CN108977569B

CN108977569B - 一种玉米第9号染色体开花期qtl位点的分子标记及其应用

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Publication number: CN108977569B
Application number: CN201810968792.XA
Authority: CN
Inventors: 孟庆长; 赵涵; 陈艳萍; 周玲; 袁建华; 张美景; 郑飞; 赵文明; 孔令杰; 刘瑞响; 王森; 崔亚坤
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN108977569A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种玉米第9号染色体开花期QTL位点的分子标记及其应用。所述分子标记由JAAS4374和JAAS4375的两对PCR引物组成。本发明以一个BC1RIL群体为材料，通过基因组学分析、分子标记开发、表型鉴定、QTL分析等一系列流程，在玉米第9号染色体上位于InDel标记JAAS4374和JAAS4375之间鉴定出一个玉米开花期QTL位点。该位点可以解释吐丝期表型变异的10.4％，同时可以解释散粉期表型变异的3.4％，是一个稳定表达的控制玉米开花期的、且具有多效性的位点。分析表明该标记可以用于玉米开花期的预测与选择。

Description

一种玉米第9号染色体开花期QTL位点的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种玉米第9号染色体开花期QTL位点的分子标记及其应用。

背景技术

玉米世界上最为重要的三大农作物之一，也是我国主要的粮、经、饲三元作物。2010年以前，播种面积和总产均稳居第二位。2014年我国玉米播种面积达3620万公顷，从此以后成为我国第一大粮食作物，在我国农业生产和国民经济发展中占有相当重要的地位。

近年来，由于土地流转、规模化经营、城镇化建设等因素以及农村的青壮年劳动力向城市转移，导致玉米生产管理粗放落后，效益低下。诸多原因造成了玉米生产上对籽粒机收需求十分紧迫。籽粒机收对于解放农村劳动力，实现农业现代化和国家粮食安全意义十分重大。

适宜的开花期是玉米的重要育种目标之一，与玉米最终产量形成、光周期反应特性以及地域与季节的适应性有着密切关系。早熟是玉米实现籽粒机收的重要条件之一。玉米的吐丝期、散粉期等是最为重要的育种性状，这些开花期相关性状也是培育适宜生产需求的超高产宜机收玉米新品种的重要改良目标，深入研究其遗传规律和调控机制将为定向选育玉米新品种提供必要的理论依据和技术支撑。

玉米开花期性状是典型的由多基因控制的变异广泛的复杂数量性状。随着分子生物学技术的发展，尤其是分子标记的广泛应用，特别是近年来高通量测序技术的飞速发展，可以对数量性状相关基因位点进行深入分析。由于分子标记具有数量庞大，检测不受环境条件、发育时期和表达等因素影响，共显性分子标记能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、群体遗传多样性分析、QTL定位及基因克隆、分子标记辅助选择等方面，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。有关利用分子标记进行玉米开花期相关性状的QTL定位研究也引起了关注。目前利用BC1，F2，RIL或DH等作图群体定位了许多影响玉米开花期相关的QTL位点^[1～7]。与拟南芥和水稻相比，一方面玉米基因组较大，重复序列多，基因组结构较为复杂，另一方面定位到的大部分开花期性状的等位基因为微效基因，数量多效应小，易受环境影响，克隆难度大。此外，受定位群体类型、所用标记类型、遗传连锁图谱精度以及环境控制等方面的限制，对玉米花期的QTL分析并无一致结果。

利用玉米分子遗传图谱定位控制开花期相关的QTL，对于分子辅助育种以及更深入的了解花期的生理机制、扩大优良玉米品种的适种范围、提高玉米机收籽粒水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供玉米开花期稳定表达主效QTL的分子标记及应用。

针对上述技术问题，本发明的稳定表达玉米开花期主效QTL分子标记及应用，所采用的技术方案如下：上述玉米开花期稳定表达主效QTL位于玉米第9号染色体Bin 9.03区域内，与其连锁的分子标记为2个InDel标记JAAS4374和JAAS437，其物理位置分别为34404887和42364688，上述物理位置均参考玉米自交系B73的参考基因组AGPv3版本。所述引物JAAS4374的序列为：

JAAS4374F：5’-CTTCTCTACAGCCGCCCAATG-3’，

JAAS4374R：5’-TTTACCATCGTCCAGGGAGACC-3’。

所述引物JAAS4375的序列为：

JAAS4375F：5’-GCATGGTATGTGGTTGTGGTTC-3’，

JAAS4375R：5’-ACCAAGGAAAGTGACTGCATTG-3’。

其中，利用JAAS4374在玉米提前开花自交系早49中可扩增出大小为254bp特征条带；利用JAAS4375在玉米提前开花自交系早49中可扩增出大小为262bp的特征条带。

本发明还提供所述与玉米开花期稳定表达主效QTL分子标记在种质资源筛选及早熟玉米种质创新及杂交种选育中的应用。所述应用包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增上述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物；

优选地，步骤3)中采用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测标记PCR扩增产物。

4)根据扩增产物条带大小，选择鉴定出携带特征条带的个体作为候选提前开花玉米，将所述的候选早熟玉米应用于育种。

本发明的有益效果在于：

本发明通过QTL分析，发现在玉米第9号染色体bin 9.03上存在一个稳定表达的玉米开花期QTL位点。该QTL位点位于InDel标记JAAS437和JAAS4375之间。该位点在两个环境下可以同时被检测到。同时该位点具有多效性：对吐丝期的贡献率平均为10.4％，同时对散粉期的贡献率平均为3.4％。分析表明利用这两个分子标记还可以对玉米开花期进行早期预测及辅助选择。

通过本发明公布的分子标记进行辅助选择，只需检测分子标记的特征扩增条带，即可预测开花期相关性状的早晚，鉴定方法简单，选择效率高。在玉米播种前或生长早期即可鉴定出提前开花的玉米单株，选择目标明确，且不受环境的影响，为早熟玉米分子辅助育种提供了一条可行的途径。

附图说明

图1为与玉米开花期稳定表达主效QTL在玉米第9号染色体上的位置示意图。其中，左侧为标记距离(单位：厘摩)，右侧为标记名称，中间黑色区段为QTL位置。S15_DTS为2015年海南三亚散粉期；S15_DTT为2015年海南三亚吐丝期；16_DTS为2016年江苏南京散粉期；16_DTT为2016年江苏南京吐丝期。

具体实施方式

以下实施例若未特别指明，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书、软件说明书建议的条件。

1、BC1RIL遗传分离定位群体构建

在前期种质资源筛选研究基础上明确早49熟期早、综合性状优良，可以作为开花期等优良性状挖掘利用的亲本。组配早49与苏95-1杂交组合后，用苏95-1回交一次。其后用单粒传法进行江苏南京和海南三亚的连续7代自交加代，成功构建BC1RIL遗传分离定位群体，该群体共包括340个家系。

2、群体表型分析

包括群体亲本(早49和苏95-1)在内的家系于2015年冬播种在海南三亚(2个重复)、2016年春播种在江苏南京(3个重复)，开花期每家系定株调查8株，记载散粉日期和吐丝日期，计算以家系平均数的播种到散粉天数(散粉期)和播种到吐丝天数(吐丝期)。

3、群体基因型分析

3.1InDel标记引物设计^[8]

本研究所用的分子标记为自主开发的InDel标记。早49和苏95-1二代序列由本单位用Illumina平台测序产生。引物设计由emboss软件包中eprimer3完成开发的InDel标记在早49和苏95-1间进行比较，筛选出扩增特异性强、扩增主带清晰的共显性标记。为了便于发展的标记进行琼脂糖凝胶检测，从中剔除了长度小于20bp的InDel，选取部分长度大于20bp的InDel位点进行标记开发利用。

3.2CTAB法基因组DNA提取

在液氮条件下或真空干燥后的玉米叶片迅速研磨成粉末后转移大约0.5～1克至2ml离心管中，加入800μL65℃预热的CTAB缓冲液混匀；65℃水浴1h，期间混匀几次；加入等体积的24:1氯仿:异戊醇混匀。静置30min后13000rpm、离心15min；上清转移到另一离心管中，加入等体积经预冷的异丙醇，混匀，-20℃条件下静置30min，玻璃针挑出絮状沉淀或离心弃上清；用70％乙醇洗1次，吹干；加入200μL的l×TE溶解；取少量样品通过0.8％的Agarose胶电泳测定DNA的质量或用NanoDrop 2000DNA浓度测定仪检测DNA的浓度和纯度。

3.3PCR扩增及产物检测

PCR反应总为25μL，包含2mmol/LMg²⁺，100mol/LdNTP，0.2mol/L引物，1U酶，100gDNAPCR程序为：95℃3min；95℃40s，58℃40s，72℃40s，37个循环；72℃5min扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5g/mL)上以80V电压电泳45min，紫外透射仪上观察记录结果。

4、遗传图谱构建与QTL定位分析

分子标记连锁图谱通过QTLIciMapping V4.1软件构建。用χ²测验法检测各标记基因型分离是否符合3:1，按照软件要求整理基因型数据，在LOD大于3.0的条件下进行分组，采用nnTwoOpt选项进行排序，采用SARF算法窗口为10条件下进行整理。分子标记连锁图谱构建后，采用ICIM加性作图方法进行QTL定位，定位过程中去掉缺失的表型。

以早49和苏95-1构建的BC1RIL群体家系DNA为模板，用重复性好、扩增条带清晰、扩增稳定的151对InDel引物分析基因型，并构建连锁图谱。连锁图谱总长2225.3cM，平均间距14.7cM。

以早49和苏95-1构建的BC1RIL群体家系为材料，结合2个环境下的开花期表型数据，在玉米第9号染色体Bin 9.03的区域定位到了一个在两个环境下均表达、同时控制散粉期和吐丝期的QTL位点，最高可解释吐丝期表型变异的11.69％(图1，表1)。

表1

该位点早开花等位基因来自亲本早49，平均可以使吐丝期提前1.17天，同时使散粉期提前0.94天。该位点位于InDel标记JAAS4374和JAAS4375之间。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.Agrama Hesham AS and Moussa Mounir E.Mapping QTLs breeding fordrought tolerance in maize.Euphytica,1996，91:89-97

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3.Ausitin D F,Lee M,Veldboom LR.Genetic mapping in maize with hybridprogeny across testers and generation:plant height and flowering，Theor ApplGenet,2001.102:163-176

4.Khairallah M M,Bohn M,Jiang C,Deutsch A,Jewell D C,Mihm J A,Melchinger A E,Gonzalez-deLeon D,Hoisington D A.Molecular mapping of QTLforsouthwestern corn borer resistance,plant height and flowering in tropicalmaize.Plant Breeding,1998,117:309-318

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8.周玲,梁帅强,吕远大,张体付,戴惠学,赵松涛,赵涵.中国黄淮海地区玉米杂种优势候选位点的鉴定.玉米科学,2017,25(1):15～23

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种玉米第9号染色体开花期QTL位点的分子标记及其应用

<141> 2018-08-14

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

cttctctaca gccgcccaat g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

tttaccatcg tccagggaga cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gcatggtatg tggttgtggt tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

accaaggaaa gtgactgcat tg 22

Claims

1.一种早熟玉米种质早49第9号染色体开花期QTL位点的分子标记的引物，其特征在于，由JAAS4374和JAAS4375的两对PCR引物组成；

JAAS4374的引物对的序列为：

JAAS4374F：5’-CTTCTCTACAGCCGCCCAATG-3’，

JAAS4374R：5’-TTTACCATCGTCCAGGGAGACC-3’；

JAAS4375的引物对的序列为：

JAAS4375F：5’-GCATGGTATGTGGTTGTGGTTC-3’，

JAAS4375R：5’-ACCAAGGAAAGTGACTGCATTG-3’，

早49玉米开花期稳定表达主效QTL位于玉米第9号染色体Bin9.03区域内，与其连锁的分子标记为2个InDel标记JAAS4374和JAAS437，利用JAAS4374的引物在玉米提前开花自交系早49中可扩增出大小为254bp特征条带；利用JAAS4375的引物在玉米提前开花自交系早49中可扩增出大小为262bp的特征条带。

2.权利要求1所述的分子标记的引物在早熟玉米早49及其衍生品种开花期早期预测与筛选中的应用，其特征在于，以待测样本的基因组DNA为模板，对权利要求1所述的分子标记进行PCR扩增，出现长度分别是254bp和262bp的产物片段，即判断待测样本携带提前开花基因位点。

3.权利要求1所述的分子标记的引物在中早熟玉米早49及其衍生品种育种中的应用，其特征在于，以待测样本的基因组DNA为模板，对权利要求1所述的分子标记进行PCR扩增，出现长度分别是254bp和262bp的产物片段，即判断待测样本携带提前开花基因位点。