CN113151572A

CN113151572A - 与苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记与应用

Info

Publication number: CN113151572A
Application number: CN202110579872.8A
Authority: CN
Inventors: 冯诚诚; 黄如葵; 琚茜茜; 梁家作; 陈小凤; 黄熊娟; 黄玉辉; 刘杏连
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一种苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记，该分子标记为InDel0362，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。苦瓜白粉病抗性主效QTLPm3.1与InDel分子标记均定位于苦瓜的3号染色体上，苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1，遗传距离14cM，物理距离为2.9Mb。据此，还开发了用于扩增该InDel分子标记的引物对及其试剂盒。利用该InDel分子标记可以实现苦瓜种质白粉病抗性的简便、快速、高通量检测，对加快白粉病抗性关键基因的挖掘利用，实现苦瓜抗白粉病分子育种有促进作用。研究表明，该分子标记的鉴定结果和田间接种鉴定结果一致，可在苗期白粉病未发病前对苦瓜育种材料进行分子标记辅助选择。

Description

与苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记与应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种与苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记与应用。

背景技术

苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属一年生攀缘草本植物，具较高的营养价值和食疗功效。近年来，苦瓜种植面积不断增加，已成为“南菜北运”的主要蔬菜品种和特色产业。白粉病是瓜类蔬菜广泛发生的一种世界性病害，从苗期至收获期均可发生。近年来，随着瓜类蔬菜种植面积的增加和规模化发展，白粉病已成为导致减产和果实品质下降，阻碍绿色生产的主要病害之一。如在广西苦瓜种植基地五塘镇，年栽培面积近2万亩，年产量超过4500万公斤，而白粉病的发病率高达90％以上，因白粉病导致的产量损失近1000万公斤，经济收益损失达1500万元，导致严重的经济损失。

白粉病在苦瓜田间生长的各个时期均可发生，在苗期发病可造成苦瓜生长势减弱，发育迟缓；在开花期发病可导致苦瓜减产20-40％；在结瓜期发病，会导致植株叶片枯黄，果实生长缓慢，植株早衰，严重影响果实的品质和产量。农户在防治白粉病的过程中耗费了大量的劳动力和农资，过度使用的农药对产品质量及环境都造成极大的损害，因此，培育出抗病品种是防御白粉病的一条最安全、经济、有效的途径。

由于白粉病菌只能采用活体保存，发病程度容易受环境影响等特点，给抗病性鉴定带来极大不便，传统抗病育种周期长，需要大量及多代配置杂交组合及接种白粉病观察，严重阻碍了瓜类蔬菜抗白粉病品种选育进程。

随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显著缩短了抗病品种选育的周期。DNA分子标记技术因其具有多态性高、检测方便、快速、准确等特点，在农作物抗病遗传育种中发挥了极其重要的作用。

InDel(Insertion-deletion，插入缺失序列)分子标记是指同一物种个体之间或是近缘物种发生碱基序列缺失或插入。在基因组中InDel的密度仅次于SNPs，其数目多且分布广泛。由于InDel分子标记本身的丰富性，随着高通量测序的发展使其适用于全基因组，具有以下优点：其多态性分布在种间和种内，具有通用性；其检测方法便捷且技术要求低等，现在普遍被应用于分子辅助遗传育种、群体遗传分析和遗传图谱构建等方面。在InDel分子标记技术通常基于聚合酶链式反应(PCR)扩增技术，本质上属于长度多态性标记。InDel分子标记技术具有共显性、操作简便和稳定性好等特点，是一种较理想的分子标记技术。

然而，目前有关苦瓜白粉病主效QTL精细定位及其相关分子标记的研究尚不完善

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记与应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记，该分子标记为InDel0362，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。

该分子标记由引物InDel0362 F和InDel0362 R扩增而得，引物InDel0362 F和InDel0362 R分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。

用于扩增上述InDel分子标记的引物对，该引物对包括引物InDel0362 F和InDel0362R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。

上述引物对在扩增权利要求1前述InDel分子标记中的应用。

扩增中的退火温度为52℃。

扩增的反应体系和反应程序为：

反应体系共10μL：1.0μL浓度50ng/μL的模板DNA；1 0μmol.L^-1的上游外引物1.0μL；10μmol.L^-1的下游外引物1.0μL；10×buffer 2.0μL；2m mol.L^-1的dNTP2.0μL；50μmol.L^-1的MgCl₂ 0.8μL；Taq酶0.2μL；ddH₂O 2.0μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min；共32个循环；72℃延伸7min；15℃保存备用。

苦瓜白粉病抗性鉴定的PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括上述的引物对。

上述PCR检测试剂盒，包括：1 0μmol.L^-1的上游外引物、10μmol.L^-1的下游外引物、10×buffer、2m mol.L^-1的dNTP、50μmol.L^-1的MgCl2、Taq酶。

上述InDel分子标记、引物对PCR检测试剂盒在苦瓜抗白粉病育种、苦瓜白粉病抗性筛选中的应用。

苦瓜白粉病抗性的判断方法，通过PCR法检测苦瓜3号染色体上权利要求要求1与苦瓜白粉病主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记的插入缺失情况进行判断；如扩增出仅有277bp片段，则鉴定为高感或感病苦瓜；如扩增出500bp和300bp的特异片段，则鉴定为高抗和抗病苦瓜。

针对目前苦瓜白粉病分子标记研究缺乏的问题，发明人经系统研究发现了一种苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记，该分子标记为InDel0362，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1与InDel分子标记均定位于苦瓜的3号染色体上，苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1，遗传距离14cM，物理距离为2.9Mb。据此，还开发了用于扩增该InDel分子标记的引物对及其试剂盒。利用该InDel分子标记可以实现苦瓜种质白粉病抗性的简便、快速、高通量检测，对加快白粉病抗性关键基因的挖掘利用，实现苦瓜抗白粉病分子育种有促进作用。研究表明，该分子标记的鉴定结果和田间接种鉴定结果一致，可在苗期白粉病未发病前对苦瓜育种材料进行分子标记辅助选择。

附图说明

图1是苦瓜抗白粉病QTL定位图。

图2是苦瓜抗白粉病分子InDel标记在部分群体材料的扩增结果图，图中：泳道1：Marker1000；泳道2：父本MC18；泳道3：母本402；泳道4：HR21；泳道5：HR45；泳道6：HR68；泳道7：HR275；泳道8：HS31；泳道9：HS70；泳道10：HS90；泳道11：HS90。

具体实施方式

一、构建苦瓜F2遗传分离群体和苦瓜全基因组重测序研究

对高抗亲本MC18、高感亲本MC402及90个极感F₂个体进了测序，测序实验步骤为：

提取每个个体的基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段(～500bp)，加上接头，进行cluster制备，最后Illumina HiSeqTM 2000测序，应用Paired-End的方法对插入片段进行测序，得到测序数据。两个亲本测序深度＞97×，180个F₂个体测序深度＞32×，总信息采集量≥7.5T。总共产生了356.1亿次clean read(约占原始数据的99.5％)。平均基因组覆盖率约为93.91％，平均GC含量为37.05％。其中，Q20为97.42％(最低96.38％)，平均Q30为90.45％(最低88.42％)。

二、SNP和InDel检测

在356.1亿个clean reads中，97.42％被比对到参考基因组(Dali-11)，用于检测SNPs和indels。获得了2005914个SNPs数据集和482453个具有高可靠性的Indel数据集。在SNP数据集中，约53.13％为杂合子，46.87％为纯合子。在一致序列(即经比对后获得的样本的所有SNP信息)的基础上，将检测到的基因型与参考序列之间存在多态性的位点进行过滤，得到高可信度的2005914个SNP数据集和482453个InDel数据集(见表1)。

表1 SNP及InDel在染色体的分布情况

三、苦瓜遗传连锁图谱构建及抗白粉病QTL定位

通过重测序获得2005914个SNP，经过滤剩余2044个marker用于连锁群构建，采用软件MapQTL6等进行QTL得到遗传图谱后，共获得12个连锁群(见表2)。

表2苦瓜连锁群位置顺序及遗传距离

得到遗传图谱后，结合表型信息，采用软件MapQTL6等进行QTL得到遗传图谱后，结合表型信息，采用软件MapQTL6等进行QTL定位，初步把白粉病抗性基因定位在3号染色体上，定位区间为MC03_15927832---MC03_18830150(见图1和表3)，遗传距离14cM，物理距离为2.9Mb，命名为苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1。

表3苦瓜白粉病抗性基因定位到的区域

四、抗白粉病主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记开发

根据重测序数据预测到的InDel位点，在定位区间为MC03_15927832---MC03_18830150，筛选出测序深度大于7、插入/缺失碱基数10-40bp，且最小等位基因频率大于0.05的InDel位点。提取InDel位点上下游250bp序列，将其中含有“N”的位点过滤。利用Primer 6.0设计引物81对(由生工生物工程(上海)有限公司合成)，引物长度范围为18-24bp，GC含量范围在40％-60％之间，退火温度范围为54-60℃。

从田间取苦瓜幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA。以微量分光光度计Nanodrop2000检测其质量和浓度，并稀释至终浓度20-40ngμL^–1，于–20℃保存备用。

以白粉病高抗亲本MC18和高感亲本MC402和F₂代中极抗白粉病、抗白粉病和极感白粉病的幼嫩叶片DNA为模板，利用81对InDel引物进行PCR扩增。

反应体系共10μL：1.0μL浓度50ng/μL的模板DNA；1 0μmol.L^-1的上游外引物1.0μL；10μmol.L^-1的下游外引物1.0μL；10×buffer 2.0μL；2m mol.L^-1的dNTP 2.0μL；50μmol.L^-1的MgCl₂ 0.8μL；Taq酶0.2μL；ddH₂O 2.0μL。

PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SNP分型通过电泳谱带进行鉴定。

五、InDel分子标记开发与应用

获得1对引物能扩增出与预期长度吻合的特异性产物(见图2和表4)，具有特异性高、稳定性好的特点，该标记在F₂代分离群体中的检出率均达到99％以上，利用该分子标记对800余份苦瓜种质的白粉病抗性鉴定，与田间接种鉴定结果一致，可以作为分子标记对苦瓜育种材料进行辅助选择。

表4苦瓜抗白粉病分子InDel标记引物序列

为方便基层检测工作，可参照上述反应体系组装试剂盒：1 0μmol.L^-1的上游外引物、10μmol.L^-1的下游外引物、10×buffer、2m mol.L^-1的dNTP、50μmol.L^-1的MgCl₂、Taq酶以及ddH₂O。

使用时，根据检测结果按如下判断待测样本是否具有苦瓜白粉病抗性：

如扩增出仅有277bp片段，则鉴定为高感或感病苦瓜；

如扩增出500bp和300bp的特异片段，则鉴定为高抗和抗病苦瓜。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 与苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctttctttt tttaaaagtt tggttaagat ttctaggggt ggtgtcgttt gataatcctt 60

tcccttttag tttttagctt ttataaatta tgcttgtttt tttccatgtt tgaattctta 120

gctaaattaa gtttttaaaa ataaaatggt tatcaaatga attttttttt tctctattga 180

tgatgagaat gtggtattgg tatttttcaa tttatgtatg atgagagaga acgatgtctt 240

caaatttcag gtgtatatat atatatatat atattttttt ttttttggga agcagatgaa 300

agagaatcag agacccagtt cctaacggtt agttcaactg tacaaaactg aagtttgtac 360

caatgacatt caaagaggaa aatatataaa caaacagtag ctttagtgat tttaaaacgg 420

attctgatca attttgttta aatgatggtt agctatattt tgttgatgta atcttgaact 480

tggattgtag ttaaatgaaa tcattttcca tttatagaaa tat 523

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggggtggtg tcgtttgata 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctttcatct gcttcccaaa 20

Claims

1.一种苦瓜白粉病抗性主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于该分子标记为InDel0362，它具有序列表中SEQ.ID.NO.1的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于该分子标记由引物InDel0362 F和InDel0362 R扩增而得，引物InDel0362 F和InDel0362 R分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。

3.用于扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对包括引物InDel0362 F和InDel0362 R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的碱基序列。

4.权利要求3所述的引物对在扩增权利要求1所述InDel分子标记中的应用。

5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于所述扩增中的退火温度为52℃。

6.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于所述扩增的反应体系和反应程序为：

反应体系共10μL：1.0μL浓度50ng/μL的模板DNA；10μmol.L^-1的上游外引物1.0μL；10μmol.L^-1的下游外引物1.0μL；10×buffer 2.0μL；2m mol.L^-1的dNTP 2.0μL；50μmol.L^-1的MgCl₂ 0.8μL；Taq酶0.2μL；ddH₂O 2.0μL；

7.一种苦瓜白粉病抗性鉴定的PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中包括权利要求3所述的引物对。

8.根据权利要1求7所述的PCR检测试剂盒，其特征在于包括：10μmol.L^-1的上游外引物、10μmol.L^-1的下游外引物、10×buffer、2m mol.L^-1的dNTP、50μmol.L^-1的MgCl2、Taq酶。

9.权利要求1所述的InDel分子标记、权利要求3所述的引物对、权利要求7所述的PCR检测试剂盒在苦瓜抗白粉病育种、苦瓜白粉病抗性筛选中的应用。

10.一种苦瓜白粉病抗性的判断方法，其特征在于：通过PCR法检测苦瓜3号染色体上权利要求要求1所述与苦瓜白粉病主效QTL Pm3.1紧密连锁的InDel分子标记的插入缺失情况进行判断；如扩增出仅有277bp片段，则鉴定为高感或感病苦瓜；如扩增出500bp和300bp的特异片段，则鉴定为高抗和抗病苦瓜。