CN116426667B - 用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用；所述分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第155位碱基G后插入10个碱基，插入碱基序列为ATAATATCCT；该分子鉴定与表型鉴定的总体契合度高，可为辅助育种提供科学依据与有效指导，仅借助科学技术判断进行人为选择，可预期取得良好的经济效益。

Description

用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用。
背景技术
苦瓜是重要的华南特色瓜类蔬菜作物，药膳兼用，深受广大消费者青睐，具有较高的经济和社会价值。果实颜色是衡量果实品质的一个重要指标，是影响消费者与育种家选择性的最直观性状。苦瓜果实颜色呈现从墨绿色、绿色、浅绿色到白色等丰富的遗传变异。不同消费群体对苦瓜果实颜色的偏好不尽相同，而果实的颜色只有在果实达到商品成熟时才能完全显现，存在滞后性，从而给育种工作造成一定难度。随着生物技术的快速发展，分子标记辅助选择技术已在育种过程中得到广泛应用，通过开发与苦瓜果实颜色性状连锁的分子标记，在苗期对植株进行筛选，将大大提高育种效率，缩短育种进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供区分苦瓜果实颜色的InDel分子标记，其序列是：CGCTTTCTGTTATCTCTGTTCGTGCAGAAGTACAGGATGCAAAAGAGACATGTCATTCACAGAGAGGAAATTCCAAGGTGGCCCCATCCAAGATGTTCAATGCAATTCAATCACTTGAAACCTATCATGGCTTACCCTTCTTCTCATCCTAACTGTGGATTATCAGTGTCCGCTGTTTATCCAACATGGAGACAGACCAATG(SEQ ID NO:1)，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第155位碱基G后插入10个碱基，插入碱基序列为ATAATATCCT(SEQ ID NO.4)。
本发明的第二方面，提供一种引物对，所述引物对用于扩增本发明第一方面所述的分子标记。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对的序列为：
Mc958-F:5’-CGCTTTCTGTTATCTCTGTTCGTG-3’(SEQ ID NO:2)；
Mc958-R:5’-CATTGGTCTGTCTCCATGTTGGATA-3’(SEQ ID NO:3)。
本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第二方面所述的引物对。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的分子标记在苗期鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色和/或苦瓜辅助育种中的应用。
本发明的第五方面，提供本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述的试剂盒在以下至少一项中的应用：
(1)苗期鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色；
(2)苦瓜辅助育种；
(3)制备用于鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色的产品；
(4)制备用于苦瓜辅助育种的产品。
本发明的第六方面，提供一种苗期鉴定苦瓜果实颜色的方法，包括检测待测苦瓜样本基因组中本发明第一方面所述的鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记的基因型。
在本发明的一些优选实施方式中，包括采用本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述的试剂盒对待测苦瓜样本的基因组DNA进行PCR扩增。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包含以下步骤：
S1：通过采用本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述的试剂盒对待测苦瓜样本的基因组DNA进行PCR扩增；
S2：对所述PCR扩增产物进行测序或电泳，分析检测结果。
在本发明的一些实施方式中，当对所述PCR扩增产物进行电泳时，若PCR产物为192bp或192bp和202bp，则待测苦瓜样本为绿色；若PCR扩增产物为202bp，则待测苦瓜样本为白色。
在本发明的一些实施方式中，当对所述PCR扩增产物进行测序时，若5’端第155个碱基G后插入10个碱基ATAATATCCT，则待测苦瓜样本为白色，若未插入则为绿色。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的程序：92～96℃预变性1～3min后，92～96℃变性28～32s，55～59℃退火28～32s，70～74℃延伸13～17s，28～32个循环后，70～75℃保持3～7min。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种与苦瓜果实颜色性状紧密连锁的InDel分子标记，分子鉴定与表型鉴定的总体契合度高，可为辅助育种提供科学依据与有效指导，仅借助科学技术判断进行人为选择，可预期取得良好的经济效益。
附图说明
图1：Mc958在母本B07(B)，父本A06(A)以及二者F1代杂种中的扩增结果。
图2：F2群体中部分植株的InDel检测情况。其中，1-10果实为白色；11-33果实为绿色。
图3：对32个果实表现绿色和白色的自交系进行InDel检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
1.遗传群体的构建
以本所保存的墨绿色果实自交系B07为母本，以搜集的地方品种经多代自交选育而成的白色果实自交系A06为父本，构建F2群体。获得313个单株的F2群体，用于果实颜色性状遗传分析和定位群体。
2.供试材料雌性性状的确定及遗传规律分析
以墨绿色果自交系B07和白果自交系A06构建F1和F2遗传分离群体，表型鉴定结果显示：F2群体中果实颜色从墨绿色到白色呈连续性正态分布。分析结果表明，苦瓜果实颜色为多基因控制的数量性状。
3.基于BSA技术，对苦瓜果色调控基因进行精细定位
本项目利用集群分离分析方法(BSA)，对苦瓜果色调控基因进行定位，在苦瓜scafford NW_019104490.1上定位到一个关联区域。
4.InDel标记的开发、扩增。
下载定位区间内InDel位点上下游200bp的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计包含InDel位点的引物。利用亲本B07、A06和F1对开发的InDel标记进行多态性筛选，发现标记Mc958在双亲间具有稳定的多态性，结合F1检测结果，判断Mc958为共显性标记(图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第155位碱基G后插入10个碱基，插入碱基序列为ATAATATCCT。当5’端起第155位碱基G后插入ATAATATCCT(SEQID NO.4)时果实为白色，当未插入时果实为绿色。SEQ ID NO:1序列：CGCTTTCTGTTATCTCTG TTCGTGCAGAAGTACAGGATG CAAAAGAGACATGTCATTCACAGAGAGGAAATTCCAAGGTGGCCCCATCCAAGATGTTCAATGCAATTCAATCACTTGAAACCTATCATGGCTTACCCTTCTTCTCATCC TAACTGTGGATTATCAGTGTCCGCTGTTTATCCAACATGGAGACAGACCAATG(SEQ ID NO:1)。
针对上述分子标记Mc958的PCR扩增引物对序列如下所示：
Mc958-F:5’-CGCTTTCTGTTATCTCTGTTCGTG-3’(SEQ ID NO:2)；
Mc958-R:5’-CATTGGTCTGTCTCCATGTTGGATA-3’(SEQ ID NO:3)。
实施例2
在F2代群体中筛选出绿果和白果植株共33株进行检测，其中，1-10果实为白色；11-33果实为绿色。以基因组DNA为模板，利用实施例1所述设计的PCR扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物：
PCR体系(10μl)：
DNA模板：0.5μl；
引物正向：0.2μl；
引物反向：0.2μl；
2×Taq PCR StarMix：5μl；
ddH20：补足至10μl。
PCR扩增程序：
94℃预变性2min后，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸15s，30个循环后，72℃保持5min，16℃保存。
当扩增出的条带为202bp时，植株果实为白色，当扩增出的条带为192bp，或192bp和202bp时，植株果实为绿色。结果见图2，带型与植株表型一致，说明实施例1中的分子标记可以用来在苗期鉴定苦瓜果实颜色。
实施例3
对本课题组保存的32个果实表现为白色和绿色的自交系材料进行表型鉴定后，提取基因组DNA，对本发明的分子标记进行检测鉴定。利用实施例2的方法进行PCR扩增。结果，除自交系M01带型与表型不一致外，其余自交系带型与表型一致，检测效率为97％，总体契合度高(图3，表1)。所述本发明中的InDel分子标记可用于分子标记辅助选择。
表1 32个自交系材料果实颜色表型鉴定结果
编号 自交系 果色 编号 自交系 果色
1 A20 绿色 17 B23 白色
2 A21 白色 18 B24 白色
3 A22 绿色 19 B25 白色
4 A23 绿色 20 M01 白色
5 A24 白色 21 M02 绿色
6 A25 白色 22 M03 绿色
7 B01 绿色 23 M04 绿色
8 B02 白色 24 M05 绿色
9 B03 白色 25 M06 绿色
10 B04 绿色 26 M07 绿色
11 B05 绿色 27 M08 绿色
12 B06 绿色 28 M09 绿色
13 B19 白色 29 M10 绿色
14 B20 绿色 30 M11 绿色
15 B21 绿色 31 M12 绿色
16 B22 白色 32 M13 白色
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (7)

1.用于苗期鉴定苦瓜果实颜色的InDel分子标记片段，其序列如SEQ ID NO:1所示，或在SEQ ID NO.1所示序列的基础上自5’端起第155位碱基G后插入10个碱基，插入碱基序列为ATAATATCCT。
2.权利要求1所述的分子标记片段在苗期鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色和/或苦瓜辅助育种中的应用。
3.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物或包含引物的试剂盒在以下至少一项中的应用：
（1）苗期鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色；
（2）苦瓜辅助育种；
（3）制备用于鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色的产品；
（4）制备用于苦瓜辅助育种的产品；
所述引物的序列为：
Mc958-F: 5’-CGCTTTCTGTTATCTCTGTTCGTG-3’；
Mc958-R: 5’- CATTGGTCTGTCTCCATGTTGGATA-3’。
4.一种苗期鉴定或辅助鉴定苦瓜果实颜色的方法，包括检测待测苦瓜样本基因组中权利要求1中所述的与苦瓜果实颜色紧密连锁的Indel分子标记的基因型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
S1：通过采用权利要求3所述的引物或试剂盒对待测苦瓜样本的基因组DNA进行PCR扩增；
S2：对所述PCR扩增产物进行测序或电泳，分析检测结果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
当对所述PCR扩增产物进行电泳时，若PCR扩增产物为202bp或202bp和212bp，则待测苦瓜样本为绿色；若PCR扩增产物为212bp，则待测苦瓜样本为白色；
当对所述PCR扩增产物进行测序时，若5’端第155个碱基G后插入10个碱基ATAATATCCT，则待测苦瓜样本为白色，若未插入则为绿色。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序：92~96 ℃预变性1~3min后，92~96℃变性28~32 s，55~59℃退火28~32 s，70~74℃延伸13~17 s，28~32个循环后，70~75 ℃保持3~7 min。
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