CN113151259B - 籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用 - Google Patents

籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用。该分子标记包括如SEQ ID NO.1‑4所示的DNA分子，对应分子标记的引物为如SEQID NO.5‑12所示的DNA分子。可以利用这些引物组对其对应的分子标记进行PCR扩增，根据扩增产物准确鉴定籼粳杂交水稻的种子纯度，与田间鉴定结果相符度接近100％，结果可靠；操作简单，成本低，相较于田间种植鉴定大大节约人力物力；还能在制种当年确定种子纯度，保障商业化制种的安全性。

Description

籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用。
背景技术
杂交水稻种子纯度是指杂交种子在特征特性方面典型一致的程度。由于杂交水稻制种环节多、周期长，在种子生产过程中生物学混杂和机械混杂时有发生，容易导致杂交种不纯。种子纯度是水稻种子质量的核心指标，也是种子企业生存的根本，准确鉴定种纯度对种子质量标准化、品种审定、假种辨别起着重要作用。
常用的水稻种子纯度鉴定方法分为田间鉴定和室内检测。田间鉴定是传统的种纯度鉴定方法，即选取有代表性的样品播种到田间，一般在苗期、分蘖盛期、抽穗扬花期和成熟期分4次进行鉴定。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已逐步运用到水稻育种的各个方面，常用的分子标记有RFLP、AFLP、SSR、SNP等类型，其中应用最普遍的是SSR，即简单重复序列标记。相较于其他类型的分子标记，SSR标记具有数量丰富、多态性高、共显性等优点，很适合杂交种的检测。
亚洲栽培水稻分为籼、粳两大亚种，是经过长期自然选择和人工选择形成分化的结果，适宜在不同的环境下生长。籼稻种植面积占据全国种植总面积的70％左右，形成了“南籼北粳”的种植格局。粳稻主要分布在东北三省、江苏等地，籼稻在华南、长江流域等南方稻区。籼、粳稻在产量、品质和抗性上各有特色，比如说粳稻食味好，适应冷凉气候，身材秀美，而籼稻消化功能强，肥料利用效率高，身材高大，耐热性强。在长期的隔离下籼粳杂交不亲和，导致籼粳杂交后子一代本身存在难孕性。但育种科学家提出籼粳亚种间杂种优势的设想，通过分析、试验开展育种研究，育成了亚种间的籼粳杂交水稻；而籼粳杂交水稻在制种过程中存在种纯降低的缺陷，通过现有的田间鉴定，周期长，不利于企业的种子销售。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在提供籼粳杂交水稻的种子纯度相关的分子标记及引物，以求将这些分子标记及其引物应用在鉴定籼粳杂交水稻的种子纯度及特异性的分子鉴定中。
第一方面，本发明要求保护一种籼粳杂交水稻的分子标记，所述分子标记包括如下(a1)至(a4)中至少一项：
(a1)分子标记SSR1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(a2)分子标记SSR2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(a3)分子标记SSR3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
(a4)分子标记SSR4，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子；
所述分子标记与籼粳杂交水稻的杂交种纯度及特异性相关。
第二方面，本发明要求保护用于鉴定第一方面中所述的分子标记的引物组，所述引物组包括如下(b1)至(b4)中至少一项：
(b1)用于鉴定所述分子标记SSR1的引物对A5，根据SEQ ID NO.1设计得到；
(b2)用于鉴定所述分子标记SSR2的引物对B47，根据SEQ ID NO.2设计得到；
(b3)用于鉴定所述分子标记SSR3的引物对D25，根据SEQ ID NO.3设计得到；
(b4)用于鉴定所述分子标记SSR4的引物对I21，根据SEQ ID NO.4设计得到。
在本发明的具体实施方式中，所述引物对A5包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条单链DNA；所述引物对B47包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条单链DNA；所述引物对D25包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的两条单链DNA；所述引物对I21包括SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的两条单链DNA。
第三方面，本发明要求保护所述引物组的筛选方法，包括以下步骤：
从SSR引物库中，初步筛选出在染色体上均匀分布、条带相对分散的第一组引物对；
从所述第一组引物对中，去除无扩增条带和无多态性的引物对，进一步复筛出多态性好和扩增效果好的第二组引物对；
对所述第二组引物对进行有效性验证，得到第三组引物对；
再对所述第三组引物对进行籼粳杂交水稻特异性筛选，得到的引物对A5、引物对B47、引物对D25和引物对I21。
在本发明的具体实施方式中，在对所述第一组引物对和所述第二引物对进行筛选中，均包括提取水稻幼苗DNA作为模板，以第一组引物对或第二组引物对进行扩增，根据扩增条带在亲本之间是否有差异作为筛选标准的步骤。
在本发明的具体实施方式中，对所述第三组引物对特异性筛选的方法包括以籼粳杂交水稻相关品种的DNA为模板进行扩增的步骤。
第四方面，本发明要求保护包括第二方面中所述的引物组的试剂盒。
第五方面，本发明要求保护第一方面中所述分子标记、或第二方面中所述引物组、或所述第四方面中所述试剂盒在鉴定籼粳杂交水稻种纯中的应用。
第六方面，本发明要求保护第一方面中所述分子标记、或第二方面中所述引物组、或所述第三方面中所述试剂盒在筛选或辅助鉴定高纯度籼粳杂交水稻中的应用。
与现有技术相比，有益效果：
本发明创造性筛选得到与籼粳杂交水稻杂交种纯度相关的4个分子标记，进一步通过针对4个分子标记设计4对引物对，通过使用这4个引物对能够准确扩增出对应的分子标记，能够根据扩增产物准确鉴定籼粳杂交水稻杂交种子纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度接近100％，结果可靠；操作简单，成本低，相较于田间种植鉴定大大节约人力物力；能在制种当年确定种子纯度，保障商业化制种的安全性。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的嘉优中科3号亲本间部分多态性分子标记筛选结果；图中下划线标出嘉优中科3号父本、母本之间有差异的标记。
图2为本发明实施例2提供的4个SSR分子标记鉴定人为混杂的嘉优中科3号杂交种纯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图2A为引物A5的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图2B为引物B47的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图2C为引物D25的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图2D为引物I21的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图中，1泳道为嘉优中科3号母本，2泳道为嘉优中科3号父本，3泳道为保持系，4-13泳道为嘉优中科3号杂交种(均为同一批次，纯度一致)，14泳道为嘉优中科1号杂交种(江苏欢腾种业销售)，15泳道为甬优1540杂交种(宁波种子公司销售)，16泳道为甬优9号杂交种(宁波种子公司销售)，17泳道为中浙优8号杂交种(浙江省勿忘农种业股份有限公司销售)，18泳道为嘉丰优2号杂交种(浙江可得丰种业公司销售)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1籼粳杂交稻嘉优中科3号杂交种纯度与特异性的分子标记开发及其引物开发
嘉优中科3号是一类单季籼粳杂交稻，由浙江省嘉兴市农科院(所)、中国科学院遗传发育生物研究所和台州市台农种业有限公司进行选育，由BT型胞质不育系嘉66A作母本与中科嘉恢1293配制而成，2016年通过浙江审定。嘉优中科3号具有“抗倒易高产，早熟配后茬”的特点，适宜在浙江省、江苏省长江以南地区作单季稻种植，安徽省沿江江南地区、湖北省沿江粳稻区稻瘟病轻发区作单季晚粳稻种植。
1、第一组引物对
分别提取嘉优中科3号母本嘉66A、父本中科嘉恢1293水稻幼苗DNA，作为PCR扩增的模板。搜索已公开发表的SSR分子标记引物信息)(International Rice MicrosatelliteInitiative,
http://www.Gramene.org/microsat/)，按如下参数选择合适的引物对：引物序列长度20-25bp，引物GC含量为45％-60％，Tm值55-60℃，PCR产物大小80-150bp。经过筛选，最终选取SSR标记平均分布于水稻12条染色体上(即每条染色体包含4-5个SSR分子标记)的50对引物作为第一组引物对。
2、第二组引物对
再从所述第一组引物对中，去除无扩增条带和无多态性的引物对，进一步复筛出多态性好和扩增效果好的第二组引物对。具体方法按以下步骤进行：
(1)提取嘉优中科3号母本嘉66A、父本中科嘉恢1293的幼苗基因组DNA。母本、父本的水稻种子室温浸种2天，37℃催芽1天，待露白后播种于基质中，人工气候箱内培养10天左右。取单株幼苗，剪碎后装入2mL离心管中，液氮磨样待用。采用改良的CTAB法提取基因组DNA。具体步骤如下：
①加入300μL 2％CTAB裂解液，65℃水浴30min；加入200μL氯仿上下混匀，12000rpm离心10min后取上清。
②上清转入96孔PCR板，加入2/3体积异丙醇，混匀后-20℃冰箱内静置1h。
③3800rpm离心15min，弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤1次，通风橱内干燥，加入50μL双蒸水溶解，-20℃保存备用。
(2)利用第一组引物对进行PCR反应扩增，方法如下：
10μL反应体系成分为：1μl 10×缓冲液(含25mM MgCl2)，0.2μl 10mM dNTP，0.4μl上、下游引物(10pmol/μl)，0.2μl Taq DNA聚合酶(2U/μl)，加水补足至10μl。反应程序为：95℃预变性5min；32个循环：95℃变性32s，55℃退火32s，72℃延伸32s；最后72℃延5min。PCR扩增产物通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、AgNO3染色观察。
(3)读取条带类型，观察每一对SSR引物在亲本间扩增条带大小是否一致，不一致的即为多态性分子标记(图1)。
(4)50对SSR引物经鉴定，有16对在亲本间呈现多态性，如表1所示，作为第二组引物对。
表1候选SSR分子标记的引物序列(第二组引物对)
引物编号 正向序列(5’-3’) 反向序列(5’-3’)
A5 SEQ ID NO.5所示 SEQ ID NO.6所示
B47 SEQ ID NO.7所示 SEQ ID NO.8所示
D25 SEQ ID NO.9所示 SEQ ID NO.10所示
I21 SEQ ID NO.11所示 SEQ ID NO.12所示
C10 SEQ ID NO.13所示 SEQ ID NO.14所示
E9 SEQ ID NO.15所示 SEQ ID NO.16所示
E12 SEQ ID NO.17所示 SEQ ID NO.18所示
F18 SEQ ID NO.19所示 SEQ ID NO.20所示
G1 SEQ ID NO.21所示 SEQ ID NO.22所示
H27 SEQ ID NO.23所示 SEQ ID NO.24所示
J14 SEQ ID NO.25所示 SEQ ID NO.26所示
J19 SEQ ID NO.27所示 SEQ ID NO.28所示
K16 SEQ ID NO.29所示 SEQ ID NO.30所示
A26 SEQ ID NO.31所示 SEQ ID NO.32所示
B2 SEQ ID NO.33所示 SEQ ID NO.34所示
B35 SEQ ID NO.35所示 SEQ ID NO.36所示
3、第三组引物对
以筛选第二组引物对相同的方法，对其进行多态性验证，具体操作方法同上。
分别以嘉优中科3号杂交种以及5个浙江省主推的籼粳杂交水稻品种嘉优中科1号(江苏欢腾种业销售)、中浙优8号(浙江省勿忘农种业股份有限公司销售)、甬优1540(宁波种子公司销售)、甬优9号(宁波种子公司销售)、嘉丰优2号(浙江可得丰种业公司销售)的幼苗DNA为模板，16对多态性分子标记进行扩增，观察标记是否具有特异性。具体操作方法同上。
分析扩增结果，筛选多态性显著、扩增效率高、特异性高的分子标记组合，最终确定A5、B47、D25、I21其对应的引物对即为第三组引物对，并将其作为鉴定嘉优中科3号杂交种纯度及特异性的引物组合。
此四个引物对针对的四个分子标记依次如(a1)至(a4)所示。
(a1)分子标记SSR1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(a2)分子标记SSR2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(a3)分子标记SSR3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
(a4)分子标记SSR4，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子。
实施例2分子标记及其引物(第三组引物对)的验证
1、鉴定嘉优中科3号杂交种特异性验证。按以下步骤进行：
(1)提取水稻幼苗基因组DNA
待鉴定材料有嘉优中科3号母本嘉66A，保持系嘉66B，嘉优中科3号父本中科嘉恢1293，嘉优中科3号杂交种，以及5个浙江省主推的籼粳杂交水稻品种嘉优中科1号(江苏欢腾种业销售)、中浙优8号(浙江省勿忘农种业股份有限公司销售)、甬优1540(宁波种子公司销售)、甬优9号(宁波种子公司销售)、嘉丰优2号(浙江可得丰种业公司销售)。所有材料的种子室温浸种2天，37℃催芽1天，待露白后播种于基质中，人工气候箱内培养10天左右。取单株幼苗，剪碎后装入2mL离心管中，液氮磨样待用。
采用改良的CTAB法提取基因组DNA及PCR扩增，提取方法和扩增方法参照实施例1。
分析电泳结果，读取待鉴定样品的条带类型，按照以下方法区别嘉优中科3号杂交种中杂株类型：
①引物A5扩增后，嘉优中科3号母本及其保持系条带大小为157bp，父本条带大小为133bp，杂交种基因型为杂合型(双带)。嘉优中科1号、中浙优8号带型与嘉优中科3号一致，甬优1540、甬优9号、嘉丰优2号为其他类型条带，说明A5能够将嘉优中科3号与甬优1540、甬优9号、嘉丰优2号区分开(图2A)。
②引物B47扩增后，嘉优中科3号母本及其保持系条带大小为99bp，父本条带大小为72bp，杂交种基因型为杂合型(双带)，甬优9号、嘉丰优2号带型与嘉优中科3号一致，嘉优中科1号、甬优1540、中浙优8号为其他类型条带，说明B47能够将嘉优中科3号与嘉优中科1号、甬优1540、中浙优8号区分开(图2B)。
③引物D25扩增后，嘉优中科3号母本及其保持系条带大小为98bp，父本条带大小为68bp，杂交种基因型为杂合型(双带)，嘉优中科1号、中浙优8号、嘉丰优2号带型与嘉优中科3号一致，甬优1540、甬优9号为其他类型条带，说明D25能够将嘉优中科3号与甬优1540、甬优9号区分开(图2C)。
④引物I21扩增后，嘉优中科3号母本及其保持系条带大小为150bp，父本条带大小为120bp，杂交种基因型为杂合型(双带)，嘉优中科1号与嘉优中科3号一致，甬优1540、甬优9号、中浙优8号、嘉丰优2号均为其他类型条带，说明I21能够将嘉优中科3号与甬优1540、甬优9号、中浙优8号、嘉丰优2号区分开(图2D)。
实施例3鉴定嘉优中科3号杂交种纯度验证
以台州市台农种业有限公司2020年在3个不同地区制种的嘉优中科3号杂交种为检测对象，采用传统的田间种植鉴定方法和本发明方法鉴定杂交种纯度，通过比较进一步考察本发明方法的准确性和时效性。
(1)传统田间种植鉴定。台州市台农种业有限公司2020年分别在福建建宁、嘉兴秀洲、衢州常山3个不同地区进行嘉优中科3号制种，各自收种后编号分别为FC、JS、C6。2020年11月在海南南繁基地播种，按照常规水稻田间种植方法管理，次年在分蘖期、扬花期、成熟期时分别观察表型，记录杂株数，计算纯度。
(2)本发明方法鉴定。编号FC、JS、C6制种的嘉优中科3号杂交种鉴定数量分别为427、416、429株，具体步骤与实施例2相同。
2种方法鉴定结果见表2。3个批次的嘉优中科3号杂交种的纯度均超过97％。其中，编号FC批次的纯度，无论是田间鉴定还是本发明方法均为100％；编号JS、C6批次通过本发明方法鉴定的纯度分别为99.04％和97.44％，与相应的田间种植鉴定相符度均超过99.5％。
表2嘉优中科3号杂交种纯度验证结果比较
Figure BDA0003080612730000101
Figure BDA0003080612730000111
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 台州市农业科学研究院
台州市台农种业有限公司
<120> 籼粳杂交水稻的分子标记、引物组及应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aaagcgacct ttgcctggct acacgcaccc gatactttcg tcggagcaaa ctctctctgt 60
ttgaagccac ggagaaaaag cttgggtgat ttcttggaag cgaagagtga ggggagaaga 120
agaagaagaa gaagaagaag aggggggagg aggaggagca gcatggctga gcacaaggag 180
gagcagtcgg tgatggagaa gctctccgag aagctgcacg gcgactcctc gtcgtcttcc 240
tcggactcgg acgacgacaa gaagggttcc tcctcgtcgt 280
<210> 2
<211> 221
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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caaggatccc attacaacag ctccaatgct agcagcagca gcagcagcag cagcagcaac 120
tctcggggca gtgccaatga ggaccagagg taatttggtg gctcatcact ctcttcatga 180
tcgttccata tatgcaccat cattaccctg tacatcctct t 221
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<212> DNA
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tcaagcagga cggcagcggc tacgccgttc gcctgaagag cgtggtgtac ca 232
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<212> DNA
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<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtggtaggat tggttgggtg tcg 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gccattgccg tcgtctactc g 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ttccatggca cacaagcc 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ctgtgcacga acttccaaag 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cctcttctct tcttcccttg ttcg 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
atggcatgga tggaggttgg 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gttgcctcct ccttcccagt tcc 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
taggtggccg gattctttct tcg 23
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
aacagatata ctcgggcagc attagc 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
tgactcctcc gtggtaaaca cc 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
taacctatct ttgctgccca tgc 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ggagtagtag atgagacgcc atcg 24
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
atcgatggag cacagcagag g 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
aaatgcgaat ggacagcaat gg 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tgtctacggc tgccgaaact ctcc 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
atgggcctag cagcagcaga agc 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
cgtgcttgtc caggctaaac c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
gacctagcct cgctgcatgg 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gctttggtat ttgcaggttc acg 23
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ctattgctcg aacactttgc ttctcc 26
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
ctgcagctct tcccagagaa cc 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
cgcggcagag tagcagaacc 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
agctagcaaa gcgtaaacga agc 23
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
cagcctttgg gtgaaagaga gg 22

Claims (7)

1.籼粳杂交水稻的分子标记扩增引物组的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
从SSR引物库中，初步筛选出在染色体上均匀分布、条带相对分散的第一组引物对；
从所述第一组引物对中，去除无扩增条带和无多态性的引物对，进一步复筛出多态性好和扩增效果好的第二组引物对；
对所述第二组引物对进行有效性验证，得到第三组引物对；
再对所述第三组引物对进行籼粳杂交水稻特异性筛选，得到引物对A5、引物对B47、引物对D25和引物对I21；
其中，籼粳杂交水稻的分子标记与籼粳杂交水稻的杂交种纯度及特异性相关；
所述引物对A5为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条单链DNA；所述引物对B47为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条单链DNA；所述引物对D25为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的两条单链DNA；所述引物对I21为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的两条单链DNA。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，与籼粳杂交水稻的杂交种纯度及特异性相关的分子标记为如下（a1）至（a4）中至少一项：
（a1）分子标记SSR1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
（a2）分子标记SSR2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
（a3）分子标记SSR3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
（a4）分子标记SSR4，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的DNA分子；
所述分子标记与籼粳杂交水稻的杂交种纯度及特异性相关。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述引物对A5根据SEQ ID NO.1设计得到；所述引物对B47根据SEQ ID NO.2设计得到；所述引物对D25根据SEQ ID NO.3设计得到；所述引物对I21根据SEQ ID NO.4设计得到。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，在对所述第一组引物对和所述第二组引物对进行筛选中，均包括提取水稻幼苗DNA作为模板，以第一组引物对或第二组引物对进行扩增，根据扩增条带在亲本之间是否有差异作为筛选标准的步骤。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，对所述第三组引物对特异性筛选的方法包括以籼粳杂交水稻相关品种的DNA为模板进行扩增的步骤。
6.权利要求1~5任一项所述的筛选方法在鉴定籼粳杂交水稻种纯中的应用。
7.权利要求1~5任一项所述的筛选方法在筛选或辅助鉴定高纯度籼粳杂交水稻中的应用。
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