CN114395639B - 用于鉴定水稻品系纯度的snp分子标记组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合及其应用。本发明筛选出24个高质量、高多态性的SNP分子标记，可用于来源不同的水稻品种(系)纯度的精准检测，采用本发明基于所述KASP引物的SNP分子标记组合进行纯度检测，其基因分型结果表明二个纯合和杂合簇分型好、紧凑且检出率高于98％，完全能满足水稻品种纯度的精准检测，该方法简单、快捷，检测成本低，适用于不同的检测仪器设备，具有广泛的应用普适性。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，尤其是涉及用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合及其应用。
背景技术
水稻是主要的粮食作物，水稻主要的生产来源于常规品种和杂交种。随着水稻育种技术的不断发展和水稻的大面积的推广应用，品种的纯度检测成为水稻育种研发；种子生产以及种子交易必不可少的质量保证。
相关技术中，水稻品种纯度鉴定主要依赖于传统的田间小区种植鉴定方法(Grow-out Test)和DNA分子标记法。田间种植鉴定法是把品种种植于田间测试小区，通过观察植株不同生长时期(如苗期、生长、花期、成熟期以及种子)的植物学形态特征(如植株的高矮及大小、分蘖、叶色、叶形、种子大小、种皮颜色等)和生物学特性(如植株的生育期、光周期、抗病性、抗旱性、种子落粒性等)的不同来鉴定该水稻品种的纯度，该方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。而DNA分子标记法是现在作物品种纯度检测最常用方法。DNA分子标记是直接反应DNA多态性的一种遗传标记，目前主要有SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)等。其中SSR标记法是纯度和品种真实性检测的主要方法之一，在多种作物如水稻、小麦和大豆等都有SSR标记的国标。SSR标记相对于传统的田间小区种植鉴定方法，具有实验室操作简单，成本低，重复性较好，结果真实可靠等优点，而SNP标记法技术相对于SSR标记更简单，易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；SNP标记法是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定品种纯度的最常用方法。但是目前基于SNP标记的水稻纯度检测方法鲜见报道。
因此，仍需要寻求一种快速、高效、低成本且准确的用于水稻品系纯度鉴定的SNP位点组合及其引物组。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合，可用于精确检测不同来源水稻品种的纯度。
本发明还提出一种扩增用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合的引物组。
本发明还提出一种水稻群体纯度鉴定的方法。
本发明还提出一种水稻品种纯度鉴定的方法。
本发明还提出一种用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合及其引物组在水稻群体纯度鉴定中的应用。
本发明还提出一种水稻品系纯度鉴定的方法在水稻选育中的应用。
本发明还提出一种鉴定水稻品系纯度的SNP试剂盒。
本发明还提出一种用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记的引物组在水稻品种鉴定和选育中的应用。
本发明还提出一种包括上述SNP分子标记引物组的基因芯片。
本发明的第一方面，提供了一种用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合，所述SNP分子标记组合包括K_010187、K_010262、K_020041、K_020071、K_020071、K_030212、K_040013、K_040206、K_050073、K_050174、K_060288、K_060318、K_070021、K_070299、K_070299、K_080218、K_090157、K_090195、K_100002、K_100175、K_110024、K_110029、K_120050和K_120137，其中：
所述K_010187的多态性位点位于Chr01.1930297；所述K_010262的多态性位点位于Chr01.12897803；所述K_020041的多态性位点位于Chr02.19229016；所述K_020071的多态性位点位于Chr02.26242111；所述K_030165的多态性位点位于Chr03.7988121；所述K_030212的多态性位点位于Chr03.14486322；所述K_040013的多态性位点位于Chr04.5430985；所述K_040206的多态性位点位于Chr04.12640190；所述K_050073的多态性位点位于Chr05.29551633；所述K_050174的多态性位点位于Chr05.13898222；所述K_060288的多态性位点位于Chr06.20383054；所述K_060318的多态性位点位于Chr06.24198186；所述K_070021的多态性位点位于Chr07.7203712；所述K_070299的多态性位点位于Chr07.28137733；所述K_080053的多态性位点位于Chr08.19003586；所述K_080218的多态性位点位于Chr08.18676233；所述K_090157的多态性位点位于Chr09.11802345；所述K_090195的多态性位点位于Chr09.15322775；所述K_100002的多态性位点位于Chr10.790448；所述K_100175的多态性位点位于Chr10.16238019；所述K_110024的多态性位点位于Chr11.10741559；所述K_110029的多态性位点位于Chr11.11987486；所述K_120050的多态性位点位于Chr12.3715408；所述K_120137的多态性位点位于Chr12.11195122；
所述K_010187多态性为T或G；K_010262多态性为T或C；K_020041多态性为A或G；K_020071多态性为T或C；K_030165多态性为A或G；K_030212多态性为A或C；K_040013多态性为A或G；K_040206多态性为A或G；K_050073多态性为A或T；K_050174多态性为A或G；K_060288多态性为T或C；K_060318多态性为C或A；K_070021多态性为A或G；K_070299多态性为C或A；K_080053多态性为T或C；K_080218多态性为G或C；K_090157多态性为C或A；K_090195多态性为A或G；K_100002多态性为A或G；K_100175多态性为T或C；K_110024多态性为T或G；K_110029多态性为A或T；K_120050多态性为A或C；K_120137多态性为T或G。
在本发明的一些实施例中，所述水稻品系纯度包括两系水稻品种纯度、三系杂交种水稻纯度和常规水稻品种纯度。
在本发明的一些实施例中，所述水稻品系纯度的SNP分子标记位点是以Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0作为参考基因组。
本发明的第二方面，提供一种用于扩增鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合的引物组。
在本发明的一些实施例中，所述引物组为KASP引物组。
具体的，所述KASP引物组包括特异性引物和通用引物；所述特异性引物包括Primer Allele X和Primer Allele Y。
在本发明的一些实施例中，所述特异性引物Primer Allele X和Primer Allele Y的5’端分别加上序列标签A和序列标签B。
在本发明的一些实施例中，所述序列标签A的序列为：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(如SEQ ID NO.73所示)。
在本发明的一些实施例中，所述序列标签B的序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(如SEQ ID NO.74所示)。
在本发明的一些实施例中，所述引物组包含Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物；其中，
所述K_010187分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；
所述K_010262分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
所述K_020041分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；
所述K_020071分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述K_020071分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
所述K_030212分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；
所述K_040013分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示；
所述K_040206分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
所述K_050073分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示；
所述K_050174分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示；
所述K_060288分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33所示；
所述K_060318分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示；
所述K_070021分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；
所述K_070299分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示；
所述K_070299分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45所示；
所述K_080218分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示；
所述K_090157分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51所示；
所述K_090195分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示；
所述K_100002分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57所示；
所述K_100175分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示；
所述K_110024分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63所示；
所述K_110029分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示；
所述K_120050分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69所示；
所述K_120137分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72所示。
本发明的第三方面，提供一种水稻群体纯度鉴定的方法，包括：
S1、提取待测水稻材料基因组DNA；
S2、检测待测水稻材料的24个SNP分子标记组合，获得基因型数据；
S3、根据步骤S2中的基因型数据计算待测水稻纯度，所述纯度的计算公式为：纯度(％)＝纯株数/有效单株总数×100％，其中有效单株是指SNP纯度检测缺失位点数低于总检测位点数的5％的单株，纯株是指在有效单株中与群体一致位点差异数为0或1的单株；优选的，所述群体一致位点是指基因型频率比例大于50％的基因型。
在本发明的一些实施例中，所述SNP纯度检测缺失位点是指在SNP分子标记位点未检测到基因型信息。
本发明的第四方面，提供一种水稻纯度检测的方法，包括：
S1、提取待测水稻品种和标准品种的基因组DNA；
S2、检测待测水稻品种和标准品种的24个SNP分子标记组合，获得基因型数据；
S3、根据步骤S2中待测水稻品种和标准品种的基因型数据计算待测水稻纯度，所述纯度的计算公式为：纯度(％)＝纯株数/有效单株总数×100％，其中有效单株是指SNP纯度检测缺失位点数低于总检测位点数的5％的单株，纯株是指在有效单株中与标准品种相比SNP位点差异数为0或1的单株。
在本发明的一些实施例中，所述SNP位点差异数是指待测水稻品种的24个SNP位点与标准品种24个SNP位点相比下的差异数。
在本发明的一些实施例中，所述水稻材料的品种包括华恢2100。
在本发明的一些实施例中，所述水稻材料包括水稻叶片和水稻种子中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述水稻材料还包括水稻根或茎。
在本发明的一些实施例中，所述基因分型是通过Dougla Array Tape基因分型系统完成。
本发明的第五方面，提供一种鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合及其引物组在水稻群体纯度鉴定中的应用。
本发明的第六方面，提供一种水稻品系纯度鉴定方法在水稻选育中的应用。
本发明的第七方面，提供一种试剂盒，用于鉴定水稻品系纯度。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒为SNP试剂盒。
在本发明的一些实施例中，所述SNP试剂盒配制为竞争性等位基因特异性PCR反应体系；所述竞争性等位基因特异性PCR反应体系包括所述SNP分子标记组合的引物组。
本发明的第八方面，提供一种鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记的引物组在水稻品种鉴定或选育中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种检测试剂盒在在水稻品种鉴定或选育中的应用。
本发明的第十方面，提供一种基因芯片，所述基因芯片包括鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合的引物组。
根据本发明实施方式的一种鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合，至少具有如下有益效果：
(1)本发明筛选出24个高质量、高多态性的SNP标记位点，可用于精准检测来源不同的水稻品种纯度，具有广泛的应用普适性，其次该SNP分子标记为共显性标记，特异性好、灵敏度和分辨力高，不受环境条件影响，检测结果准确率高，可重复性和稳定性好。
(2)采用本发明基于所述KASP引物的SNP分子标记组合的水稻纯度检测方法，具有简单、快捷，检测成本低等优点，且适用于不同的检测仪器设备。
(3)采用本发明中基于Douglas Array Tape平台的所述KASP引物反应检测方法，其自动化程度高、通量高、速度快，试剂用量少，检测成本低，有效提高了水稻的纯度检测的准确性和检测效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1水稻SNP位点筛选与应用技术流程图；
图2为本发明实施例2采用24个SNP分子标记组合检测水稻纯度的典型基因分型图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
在本发明的实施方式中，Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。
在本发明的实施例中24个SNP分子标记是以Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0基因组为参考基因组。
实施例1水稻SNP位点的筛选与KASP引物的设计
1.近6万个水稻SNP位点信息的收集
利用LGC((Laboratory of the Government Chemist)的水稻基因数据库，通过大量样品的重测序数据比对，搜集了近6万个SNP位点用于SNP标记设计筛选。
2.4000个用于水稻SNP位点筛选及标记设计
对收集到的6万个SNP位点进行竞争性等位基因特异性PCR(KASP)引物的设计，并对设计标记进行综合评价，根据位点的退火温度等一致性选择，最后得到4000对特异性标记良好的标记。
3.24个水稻SNP分子标记筛选与KASP引物的设计
从4000个用于水稻SNP位点中挑选出24个用于水稻品种纯度检测的SNP标记：其中每个染色体中筛选出两个高质量、单拷贝、高多态性(184份水稻材料中的PIC值都高于≥0.35)、数据检出率>98％的SNP标记，用于各种不同遗传来源的水稻品种(系)纯度的精准检测，24个水稻SNP位点筛选与应用技术流程图如图1所示。
24个用于水稻品种纯度检测的SNP标记的位点信息见表1。
表1：
利用Batch Primer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对筛选出的24个SNP位点进行KASP引物设计。每个KASP引物由三条引物组成，包括等位基因特异性引物X(Allele-Specific Primer X；Primer_X)和Y(Allele-Specific Primer Y；Primer_Y)以及一条通用引物C(Common Primer；Primer_C)。
24个用于水稻品种纯度检测的SNP分子标记的等位基因型和KASP引物序列见表2。
表2：
实施例2用于水稻品种纯度检测的24个SNP分子标记组合的验证
1.试验材料的基因组DNA提取
选取180份水稻常规材料华恢2100与4份其他水稻材料进行随机混合，采用CTAB法提取水稻材料种子的基因组DNA。
2.PCR扩增反应
采用Array Tape基因型分型平台的NEXAR系统进行PCR扩增体系的自动组装，PCR扩增体系如下表3所示。
表3：
其中，KASP Master mix由英国LGC公司提供，包含了荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B、ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl2，其中荧光探针A带有的荧光基团FAM，荧光信号表现为蓝色，荧光探针B带有的荧光基团HEX，荧光信号表现为红色，淬灭探针带有的淬灭基团为BHQ。
其中特异性引物Primer_X和特异性引物Primer_Y的5’端分别加上序列标签A和序列标签B：
序列标签A：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(如SEQ ID NO.73所示)；
序列标签B：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(如SEQ ID NO.74所示)，
序列标签A和序列标签B适用于英国LGC公司KASP Master mix(PCR预混液)，
采用Array Tape基因型分型平台的SOELLEX系统进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，57℃～65℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，33个循环。
4.基于24个SNP分子标记组合的基因分型结果
PCR反应完成后用Array Tape基因型分型平台进行反应体系荧光信号扫描，并采用INTELLICS系统进行基因分型和数据分析，其基因型分型结果如表4-1和表4-2所示，其中纯株的判断标准为待测样品SNP分子标记位点与群体一致位点(基因型频率比例大于50％的基因型为一致位点)差异数为0或1的单株，即杂位点数大于或等于2的单株，结果表明采用本发明根据24个SNP分子标记位点设计的KASP引物组进行扩增，其位点检出率高，适合对水稻进行基因型分型检测。
表4-1：
表4-2：
5.水稻品种纯度的计算
根据表4-1和表4-2中184个水稻样本在本发明24个SNP位点的基因型数据，筛选出无效单株，其中无效单株是指SNP纯度检测缺失位点超过总检测位点数的5％，无效单株不纳入纯度判定统计；并进一步统计有效单株数、纯株数和杂株数，计算该批水稻样本的纯度，其中有效单株是指SNP纯度检测缺失位点低于总检测位点数的5％，有效单株纳入纯度判定统计；纯株是指与对照位点或群体一致位点(基因型频率比例大于50％的基因型为一致位点)差异数为0或1的单株；杂株是指与对照位点或群体一致位点(基因型频率比例大于50％的基因型为一致位点)差异数大于等于2的单株。纯度为纯株数与有效单株数的比值。
纯度的计算公式为：纯度(％)＝纯株数/有效单株总数×100％。
从表4-1和表4-2中可知184个水稻样本中，无效单株数为0，有效单株数为184，其中，群体一致位点基因型如表5所示。
表5：
通过比对表4-1、表4-2和表5中的基因型数据可知，184株有效单株中，纯株数为168，杂株数为16，所以这184个水稻样本的纯度为168/184＝91.30％，从验证结果可以看出，以本发明筛选出24个高质量、单拷贝SNP分子标记位点为检测位点，采用本发明设计的KASP引物组对其进行筛选，其检测效率高，各位点基因型数据检出率高，无效单株数为0，有效单株检测率为100％。
6.典型SNP分子标记的基因型分型图
以K_110024分子标记为参考标记，对184株水稻样本材料进行基因型分型，结果如图2所示。在图2中，184株水稻样本材料的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇，其中：
X簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有纯合X等位基因(G:G)，在基因分型图中标为红色，位于图形左上角；
Y簇表示样品在SNP分子标记位点含有纯合Y等位基因型(T:T)，基因分型图中标为蓝色，位于图形右下角；
杂合基因型簇表示样品在这个SNP分子标记位点含有X和Y杂合等位基因型(T:G)，基因分型图中标为紫色，位于图形靠近中间位置。图形的左下角圆点为空白对照。
从图2中可以看出采用该SNP分子标记进行基因分型，二个纯合和杂合簇分型好、紧凑，同一簇的点靠近不分散，位点为单拷贝且检出率高，可见其基因型分型质量完全能满足水稻品种纯度的精准检测。
综上所述，本发明筛选出一套共24个高质量、高多态性的SNP分子标记，其中每条染色体上筛选出两个，该SNP分子标记组合可用于来源不同的水稻品种(系)纯度的精准检测，具有广泛的应用普适性；
采用本发明基于所述KASP引物的SNP分子标记组合进行基因分型，其二个纯合和杂合簇分型好、紧凑且检出率高于98％，完全能满足水稻品种纯度的精准检测，采用基于所述KASP引物的SNP分子标记检测方法，简单、快捷，检测成本低，适用于不同的检测仪器设备。其中基于Douglas Array Tape平台的SNP分子标记自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误，检测通量高，8小时可获得122880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍。其次采用该方法检测反应体积少(仅0.8μL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70～90％。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合及其应用
<140> 202111674194.X
<141> 2021-12-31
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtataatctg ccagtgtcaa ctgct 25
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ataatctgcc agtgtcaact gcg 23
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gcacatgtta cacctcgggt tgaaa 25
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catactattt agatatgaag gcgtgc 26
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tttttccaga taaatcagag atgaatttgt aa 32
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tttttccaga taaatcagag atgaatttgt ag 32
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tctgccggtt ggtgaagctg ttta 24
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atgaggacaa atcttagacg tcagttt 27
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atgaggacaa atcttagacg tcagttc 27
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gtttacaaac ctagaaacta ccataggata 30
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ggacagaaaa cagtgcaggt cca 23
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gacagaaaac agtgcaggtc cg 22
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gtctgcaatt ctgcataaca ataacgaata 30
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agtaagtcgt gcccatgcac tta 23
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gtaagtcgtg cccatgcact tc 22
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catagaaacc cattcacctt atggctaaa 29
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attagacatg gttcttacat gtatgtctta 30
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attagacatg gttcttacat gtatgtcttg 30
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ggcacttttc tagtgatata aagcgcatt 29
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acccgcacgc tttcttatta atttaca 27
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cccgcacgct ttcttattaa tttacg 26
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agacgctcac gatctgcgcc tt 22
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ggaaaacaaa acagacgaga cgaga 25
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ggaaaacaaa acagacgaga cgagt 25
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ccacctagga gtagtagttt gggtt 25
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cgcatgtttc tcttggttta tctcca 26
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gcatgtttct cttggtttat ctccg 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagccaatgt tatcgaaact aacaaggaa 29
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gcaatccgtg aatcacgcag tgt 23
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caatccgtga atcacgcagt gc 22
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cgttctccgt cggagagacc ta 22
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atcatatcct ccaaagtgaa aactc 25
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atactatcat atcctccaaa gtgaaaacta 30
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aactgtaatg atgtccatgt gccgtttt 28
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ttgaattttc tttctccatg cagagg 26
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ccaccgatcc ttgcctaccc aa 22
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agtaaatgaa ccgggagtgc aatc 24
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gcaggcatgt agatcaaaca gcctt 25
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tattttaagg tccatttttg caggctac 28
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tgaaacctcc tcttgcttgt atcaagaaa 29
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acaatccaag aattggccag caaag 25
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acaatccaag aattggccag caaac 25
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atgaatatcg atctcacttc tagcatcttt 30
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aaatttctag ttggaataac aaagcctag 29
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gaaatttcta gttggaataa caaagcctaa 30
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gttggaacag ccagaacatc ttgctt 26
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gatgaagtac aagttcccgc gg 22
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gaccagctcc cggtacgtga t 21
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atatgtgtca gccaagaaag ctcca 25
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atatgtgtca gccaagaaag ctccg 25
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cctgctacct cacgccactc tt 22
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cataatgtta gcagtttcag agaactct 28
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ataatgttag cagtttcaga gaactcc 27
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gtcacatacc tattgggtac atacatagat 30
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gtagattgat ttgatgaagt agaggt 26
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gtagattgat ttgatgaagt agaggg 26
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ggaggctcat ctgctgcaga gaa 23
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agtcttgatg gagtacattt tgaca 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtcttgatg gagtacattt tgact 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgcttaact tggggctagt ttggtt 26
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aatggtttgc ctcgtttcac gtga 24
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ggtttgcctc gtttcacgtg c 21
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ggctgagttc gcttcagtgc ttata 25
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accaagcatt gcatggttcc acat 24
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ccaagcattg catggttcca cag 23
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cttcgtgctt tgctgactgt taccat 26
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gaaggtgacc aagttcatgc t 21
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<400> 74
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
Claims (9)
1.扩增用于鉴定水稻品系纯度的SNP分子标记组合的引物组，其特征在于：所述SNP分子标记组合包括K_010187、K_010262、K_020041、K_020071、K_030165、K_030212、K_040013、K_040206、K_050073、K_050174、K_060288、K_060318、K_070021、K_070299、K_080053、K_080218、K_090157、K_090195、K_100002、K_100175、K_110024、K_110029、K_120050和K_120137；
所述引物组包含Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物；其中，
所述K_010187分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；
所述K_010262分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
所述K_020041分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；
所述K_020071分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；
所述K_030165分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
所述K_030212分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示；
所述K_040013分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示；
所述K_040206分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示；
所述K_050073分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27所示；
所述K_050174分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示；
所述K_060288分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33所示；
所述K_060318分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示；
所述K_070021分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；
所述K_070299分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示；
所述K_080053分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45所示；
所述K_080218分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示；
所述K_090157分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51所示；
所述K_090195分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54所示；
所述K_100002分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57所示；
所述K_100175分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示；
所述K_110024分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63所示；
所述K_110029分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示；
所述K_120050分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.69所示；
所述K_120137分子标记的引物组中Primer Allele X、Primer Allele Y和通用引物的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.70、SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72所示。
2.一种水稻群体纯度鉴定的方法，其特征在于，包括：
S1、提取待测水稻材料基因组DNA；
S2、采用如权利要求1所述的引物组对所述待测水稻材料基因组DNA进行扩增，获得基因型数据；
S3、根据步骤S2中的基因型数据计算待测水稻纯度，所述纯度的计算公式为：纯度（%）=纯株数/有效单株总数×100%，其中有效单株是指SNP纯度检测缺失位点数低于总检测位点数的5%的单株，纯株是指在有效单株中与群体一致位点差异数为0或1的单株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述群体一致位点是指基因型频率比例大于50%的基因型。
4.一种水稻品种纯度检测的方法，其特征在于，包括：
S1、提取待测水稻品种和标准品种的基因组DNA；
S2、采用如权利要求1所述的引物组对所述待测水稻品种和标准品种的基因组DNA进行扩增，获得基因型数据；
S3、根据步骤S2中待测水稻品种和标准品种的基因型数据计算待测水稻品种纯度，所述纯度的计算公式为：纯度（%）=纯株数/有效单株总数×100%，其中有效单株是指SNP纯度检测缺失位点数低于总检测位点数的5%的单株，纯株是指在有效单株中与标准品种相比SNP位点差异数为0或1的单株。
5.如权利要求1所述的引物组在水稻群体纯度鉴定中的应用。
6.一种如权利要求2或3所述的方法在水稻选育中的应用。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
8.如权利要求1所述的引物组或如权利要求7所述的试剂盒在水稻品种纯度鉴定中的应用。
9.一种基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括权利要求1中所述的引物组。
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