CN117286287B - 大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用，所述KASP标记为与大豆耐荫基因GmYUC2密切相关的3个SNP突变位点的KASP标记，其中soySNP‑1在40886611bp发生了碱基C至T的替换、soySNP‑2在40886699bp发生了碱基C至T的替换、soySNP‑3在40888609bp发生了碱基G至A的替换。本发明提供的基于KASP方法的与大豆耐荫显著关联的单倍型标记，可用于大豆耐荫性状的分子标记辅助选择育种，对于加快大豆耐荫育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，具体提供了一种大豆耐荫基因GmYUC2的KASP标记及其应用。
背景技术
间套作大豆具有集约利用土地、空间和时间，提高光能利用率，改善作物群体结构等优点，在不影响其它作物产量的情况下，还可增收一季大豆。然而，大豆与玉米、甘蔗、木薯等高秆作物间套作时会受到荫蔽胁迫，对大豆生长和防御极为不利（Liu, et al.,2019）。大豆受到荫蔽胁迫时，株高变高，主茎节间、下胚轴及叶柄过度伸长，叶夹角变小，茎粗变细，根冠比减小，分枝减少，开花提前，最终导致倒伏、徒长、早衰以及抗病虫能力下降等，导致产量与品质难以提升（Raza, et al., 2020; Khalid, et al., 2019;Gholamhoseini, et al., 2018; Wu, et al., 2017; Liu, et al., 2016; Su, et al.,2014）。荫蔽成为制约大豆间套作发挥潜力的限制性因素，是推广大豆间套作模式的最大障碍。随着大豆间套作生产大力发展，耐荫性问题将会更加突出。筛选耐荫大豆资源、培育耐荫高产适合间套作大豆优良新品种是解决上述问题的有效途径。
传统耐荫大豆资源筛选是根据大豆耐荫性田间株高、倒伏性、产量等表型进行鉴定，这种方式不仅费时耗力而且易受环境干扰准确性不高。利用目标基因存在的碱基差异，针对大效应位点开发特异性分子标记进行辅助选择是提高大豆耐荫性选择效率的最佳方法。分子标记在作物育种中具有早期选择、不受环境影响以及准确、快速、高效的优势，已成为一种准确、高效的工具，其中KASP (kompetitive allele specific PCR)是具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行精准的双等位基因分型，在大豆的分子标记辅助选择中得到广泛应用。鉴于KASP标记检测技术具有稳定性好、准确性高、检测成本较低和高通量等优点，借助KASP标记，可以对大批量的样品进行精准的双等位基因分型，达到高通量进行目标基因验证和检测的效果。
本专利针对不同大豆资源中耐荫基因GmYUC2差异序列设计、开发出简便、高通量的KASP标记，可对大豆种质资源的耐荫性进行分子检测，为大豆育种家提供了可应用于分子标记辅助选择的分子标记，将加速了分子标记辅助聚合优异耐荫基因及培育耐荫新品种的进程。
发明内容
本发明的目的是鉴定与大豆耐荫性密切关联的耐荫基因GmYUC2的单倍型，由3个单核苷酸标记（SNP）组成，并基于该信息开发KASP标记及其引物对，为实现大豆耐荫性状的鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种与大豆耐荫基因GmYUC2耐荫性密切关联的3个单核苷酸标记SNP组成的单倍型，该单倍型位于大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体40886611_40888609 bp位置，其中soySNP-1在40,886,611 bp发生了碱基C至T的替换、soySNP-2在40,886,699 bp发生了碱基C至T的替换、soySNP-3在40,888,609 bp发生了碱基G至A的替换。其中单倍型TTA与增强大豆耐荫性极显著关联，表型变异解释率达到14.78%，上述SNP所处的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本发明还提供一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的引物对，所述KASP标记为与前述3个SNP突变位点的KASP标记，所述KASP标记含有三条引物，分别包含两条针对关键位点碱基差异设计的特异性引物，即上游引物F1、上游引物F2，一条通用引物即下游引物R，两条特异性引物3’末端为等位变异碱基，5’端连接英国LGC（Laboratoryof the Government Chemist）公司KASP反应试剂特定的FAM和HEX荧光接头序列。
所述引物对具体如下：
soySNP-1 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGC-3’，如SEQ IDNO：2所示；
soySNP-1 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGT-3’，如SEQ IDNO：3所示；
soySNP-1 KASP标记下游引物R为：5’-CATGGTCCTCAATAGTTAGCATGC-3’，如SEQ IDNO：4所示。
soySNP-2 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTG-3’，如SEQ IDNO：5所示；
soySNP-2 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTA -3’，如SEQ IDNO：6所示；
soySNP-2 KASP标记下游引物R为：5’-GCATGCTAACTATTGAGGACCATG -3’，如SEQ IDNO：7所示。
soySNP-3 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAG-3’，如SEQ ID NO：8所示；
soySNP-3 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAA-3’，如SEQ ID NO：9所示；
soySNP-3 KASP标记下游引物R为：5’-CATCAGCAGCCACCAATTCAAATA -3’，如SEQ IDNO：10所示。
在合成所述的KASP标记引物时，所述正向引物F1的5’端加上羧基荧光素FAM的荧光信号标签）；正向引物F2的5’端加上六氯荧光素氨基磷酸酯HEX的荧光信号标签。
针对与大豆耐荫基因GmYUC2的3个核苷酸突变位点SNP的KASP标记应用于鉴定或辅助筛选方法是检测大豆5号染色体40886611_40888609 bp位置的3个脱氧核糖核苷酸的基因型是CCG还是TTA，基因型为CCG时，该位点具不耐荫效应，基因型为TTA时，该位点具耐荫效应，因此可辅助大豆耐荫性状的遗传改良。
第三方面，本发明保护一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的试剂，含有前文所述的引物对。
第四方面，本发明还保护一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的试剂盒，所述试剂盒含有前文所述的引物对或含有前文所述的试剂。
第五方面，本发明还保护前文所述的引物对，前文所述的试剂、或前文所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
（A1）大豆辅助育种；
（A2）制备大豆辅助育种的产品；
（A3）鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性；
（A4）制备鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性的产品；
（A5）选育或辅助选育耐荫性大豆；
（A6）制备选育或辅助选育耐荫性大豆的产品。
第六方面，本发明保护一种选育或辅助选育耐荫大豆的方法，提取大豆基因组DNA，用前文所述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
第七方面，本发明保护一种鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性的方法，提取大豆基因组DNA，用前文所述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型。
上述方法和应用中，引物组由前述上游引物F1、上游引物F2及下游引物R组成。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。反应完成后，ABI7500实时荧光定量PCR仪会直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形；若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型全。
具体操作步骤如下：
（1）大豆植株基因组DNA的提取；
（2）采用所述的PCR特异性扩增引物对生物样本的基因组DNA进行PCR扩增并检测所述的SNP基因型：
将所述的分子标记引物加入同一PCR反应体系，并设置2个以超纯水代替样品模版DNA的空白对照，在荧光定量PCR仪上对大豆种质资源的DNA进行扩增；
5.0 μl反应体系：大豆样品DNA模板5 -100；FLu-Arms 2x PCR Mix 2.5 μl；KASP上游分型引物 F1（10 μM）0.075 μl，KASP上游分型引物 F2（10 μM）0.075 μl，KASP下游通用引物 R（10 μM）0.2 μl；补水至5 μl。反应条件包括94℃预变性3min，1个循环；95℃变性15 s，63.4~57℃退火45 s，每一个循环降低0.8 ℃，9个循环；94℃变性15 s，57.5℃退火45s，45个循环；循环结束后再30 ℃延伸 30 s；
反应完成后，利用多功能酶标仪检测荧光，根据读取的荧光，分别计算FAM/ROX和HEX/ROX的比值，利用软件画出坐标图，获得样品的基因型；
（3）根据基因型在不同大豆大豆种质资源中选择得到耐荫大豆种质资源。
有益效果
（1）本发明大豆耐荫基因GmYUC2密切相关的3个SNP变异位点，是从中国南方的1498份大豆种质资源的中选出具有代表性的394份，进行5×重测序，经过剔除过滤后获得覆盖全基因组的高密度的SNP分子标记图谱，再利用田间表型鉴定方法检测3个环境下（2014年春、2014年夏和2015年春）大豆的耐荫性指数数据，对大豆耐荫表型数据进行全基因组关联分析得到的（图1）。在3个环境中均能检测到与大豆耐荫性显著关联的由3个SNP组成的位于GmYUC2基因内的单倍型标记。该位点位于大豆基因组v2.0的5号染色体40886611_40888609 bp位置，解释14.78%的表型变异。该位点携带TTA单倍型等位变异显著增强大豆耐荫性（图2），为大豆耐荫性状的分子标记辅助育种提供技术支持。
（2）本发明鉴定了3个位于大豆5号染色体上控制大豆耐荫性状的SNP位点，开发的KASP标记能直接对3个SNP突变位点碱基是CCG还是TTA进行特异的区分和检测，该KASP标记具有良好的应用价值，可实现对大豆耐荫性状的预先选择和分子辅助育种。
（3）利用KASP标记引物在实时荧光定量PCR仪上对18份大豆材料（其中强耐荫材料8份、极不耐荫材料10份）进行扩增并进行基因分型，结果表明：该分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中8份强耐荫材料中有7份材料携带TTA等位变异位点，基因型为TTA，占87.5%；10份极不耐荫材料中有9份是不携带变异位点，基因型为CCG，占90.0%（CCG型为参考基因组）；18份材料的基因型与表型比对相符的比值占88.89%（表1）。基因型与耐荫性表型结果比较较为一致，可放心用于分子标记辅助选择育种中。
附图说明
图1为利用394份大豆种质资源和3年耐荫性数据进行RTM-GWAS的曼哈顿图和QQ图。
图2为在394份大豆种质资源群体中GmYUC2 基因TTA单倍型与增强耐荫性极显著相关（***, P<0.001）。
图3-5为KASP方法鉴定三个大豆耐荫性相关SNP的基因型。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明，所用方法如无特别说明，均为常规方法。
本发明中大豆耐荫基因GmYUC2的3个SNP变异位点，是通过下列步骤获得的：
（1）从中国南方的1498份大豆种质资源的中选出具有代表性的394份，用Hseq Xten测序仪进行全基因组重测序，深度为5×,平均每个样本28,279,904 reads。以William82（Glyma.Wm82.a2.v2.0）基因组为参考序列，每个样本平均覆盖度达到94.69%。用Burrows-Wheeler transform方法比对，取GATK和Samtools两种算法的交集，经过剔除过滤低频率的SNP后获得覆盖全基因组的高密度SNP分子标记共2,745,637个。利用这些SNP经两阶段限制性全基因组关联分析（RTM-GWAS）方法构建123,065个SNPLDB单倍型标记，用于关联分析。（2）利用田间表型鉴定方法检测3个环境下（2014年春、2014年夏和2015年春）大豆的耐荫性指数数据（耐荫性指数越小，耐荫性越强），对大豆耐荫表型数据进行全基因组关联分析得到的，检测到与大豆耐荫性显著关联的GmYUC2基因有3个SNP位点，表型变异解释率达到14.78%，位于大豆5号染色体40886611_40888609 bp位置，其中位点1 soySNP-1在40,886,611 bp发生了碱基C至T的替换、位点2 soySNP-2在40,886,699 bp发生了碱基C至T的替换、位点3 soySNP-3在40,888,609 bp发生了碱基G至A的替换。
利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Primer-BLAST功能，依据GmYUC2基因序列在基因组上的序列，与phytozome数据库中该基因的序列反向互补后一一对应，设计3个SNP变异位点的引物，包括上游引物F1、上游引物F2和下游引物R，其中F1和F2分别包含FAM和HEX荧光接头序列，序列如下：
soySNP-1 KASP标记上游引物F1序列为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGC-3’；
soySNP-1 KASP标记上游引物F2序列为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGT-3’；
soySNP-1 KASP标记下游引物R：5’-CATGGTCCTCAATAGTTAGCATGC-3’。
soySNP-2 KASP标记上游引物F1序列为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTG-3’；
soySNP-2 KASP标记上游引物F2序列为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTA -3’；
soySNP-2 KASP标记下游引物R：5’-GCATGCTAACTATTGAGGACCATG -3’。
soySNP-3 KASP标记上游引物F1序列为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAG-3’；
soySNP-3 KASP标记上游引物F2序列为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAA-3’；
soySNP-3 KASP标记下游引物R：5’-CATCAGCAGCCACCAATTCAAATA -3’。
分别提取不同大豆样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用KASP标记专用引物在进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。
所述的扩增体系均为 5.0 μl反应体系：大豆样品DNA模板5-100；FLu-Arms 2xPCR Mix 2.5 μl；KASP上游分型引物 F1（10 μM）0.075 μl，KASP上游分型引物 F2（10 μM）0.075 μl，KASP下游通用引物 R（10 μM）0.2 μl；补水至5 μl。
反应条件包括94℃预变性3min，1个循环；95℃变性15 s，63.4~57℃退火45 s，每一个循环降低0.8 ℃，9个循环；94℃变性15 s，57.5℃退火45 s，45个循环；循环结束后再30 ℃延伸 30 s。
反应完成后，ABI7500实时荧光定量PCR仪直接对PCR反应产物进行荧光数据读取。利用KASP标记引物在实时荧光定量PCR仪上对18份大豆材料（其中强耐荫材料8份，不耐荫材料10份）进行扩增并进行基因分型（表1），结果表明：该分子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中8份强耐荫材料中有7份材料携带TTA等位变异位点，基因型为TTA，占87.5%；10份极不耐荫材料中有9份是不携带变异位点，基因型为CCG，占90.0%（CCG型为参考基因组）；18份材料的基因型与表型比对相符的比值占88.89%（图3-5）。基因型与耐荫性表型结果比较较为一致，可放心用于分子标记辅助选择育种中。
表1. 用于KASP标记的大豆名称及耐荫性
Glyma.05g231100 （40885414-40888810），SEQ ID NO：1：
TTTAATTTAATTAAGAAAAAAAAGTGTAATATTTAAATGAAACAAGATCAAAATATAATTACCGCTTAATTCAAGCAAGTCATTATAATTATCACTTAAAATGATTAAATCTAGGTTTGGGATTTTTCGATCGTACATCCATACACAAAAGATTCCGTTGCATATAATAAAGTGCATCAACTCCTACACACGCATGGTATTAATTAGCAGCTTTCCAACAATGTTCAATATCTCCTGCAATCCTCTTTGCATCAAAAGATGCACCAAGAAGGCCACGTTTAGTGAAACCCACAGCATAGAGTCCATTTTCACCTCTCCATCCATTTGGGAAAGGTTTCCTGGGCAATCCATCCTTCTCACAAAACATGTCACTGCCCTGGTGACCAAAAAAATTTCAAAAGCCCAATCATTATATGTTTAATTGTATTTCATTAACATCATCGATGACATTAAGCATAAGACTGTTGTTTTCTGCACCTTCAACCATGTGGGTACGTTACTTTTGTATCCAGTTGCTAGAATGATCACATCGAAATCCTCTATTTTTCCATCTACAAACTCAGCCTTGTGTTGTGCTAGTTGTTTAATTCCGCGGCAAACCTATTACATATTAGACTATATAATGTTGAAAACAATAAAAGAGAAAGAAAAAAAAAGTCTTTTTTCTTTTGTTTCTTTTAAATC
TTTACCTTAAACCAAAAGGCAAATTTGTTTGACTTTGACAAGAACCAGAACACGATGAAAATTATTTTGGATTTGATTGGGATAGGAAGAATAGTCTAACCTTAATTTTTCCACTTTTTATGTGAGCAAGTGTGCCAAAATCTAAAACTGGGGTCTTGCCACACAAGTTCTTGAGCTCTAGAGGGCCAATTTTGGGACGATTAAGTCCAAATTGAGCTGTGTCCCCGAGAATGAGATGTGACATAAGAAGTAAAAATTTGTCCACAAGACGCATGGGGAACCAGTTGAGCAAGCTCAGAGATAAACCAAAAGTTGATTTCCCAAACATCTGCTGTGGCAAGATATGCACCTACAGTAAAAAGAAAATATCACGTTTAAAATTAAAGATCTTAAAAGTTGCTTTGTAAACTTCTAGAAAAATTAGTGACCATCATCTTTTCATGCTTTCGGTGATTCCCGTGACCATAGAAAATGGTTCGATGAGAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGYTTGGGTGTCTGACGTTGTTTGCGCATGCTAACTATTGAGGACCATGACAAAACATTTTTGAGATTTTTTCTTAAGAAAAAACATTTTYAAAGAGTTTTGTTTCTTTAGAGTTAATAGTTGAGTTAAATTTTAAAAAAGAATTAAATTTGTTTTCGCGGAGAATCAATTTCTGTCATACTAATTCTTTAATAATGAAAATGACGTTTGGAGTTTGTATTTGGCCCTCACAATAACTTATGAGACTAATTTGAATAATAGAATACATATTTGAAATCTGACTTCACCAACAACATACACATTTAAAAACTTTAGGCGTGGTCACTGATCATCATCGTTAAAAAATTAATACGACAAACGTCTTTCAGAACATAGTTTCATATTATGATTTACTCCATAATGTACGTAATACATTAGCTGACTCTGTTCACGTCACTTTTTCCAGCTGAACAAGAGTCTTACATCGATTTCGACCGGAACACTTATTTAAACTGGATTTAAGAGGACCAGTCAACTGAAAGTAAGAGCAACACCCAATATGCTTTCCAATGTATATATATAAACACAATAATTAATGAGTAAATAGTCAATATATTGCTGGTGTAAAAGCTTTTATATTTTTATCCAATTATAAATGGTTATGATTAGTTTATTTACTTTAATGGTAATTATCTTAAAAGTCTTATTTACTCTGATTGGTTGAAAGTAACAAGATATATAAATAAACTCTAATTATTATGTTATTAAATAGGTTCAGTGAAGGAAGAATATATATGATGAAGATGTTGAGTATGTCATTTAGAAGATCATAAGTTTTAAGTGTACTCACTGTATCTCTAACCACAAGGGATGGGCGAGCATGATGGTTGCAGAGATCTAAACAAACTTCCATGCCTGAATTACCACATCCAACCACCAAAACATTCTTCCCACAAAACATACTACCACTCTTATATGAGCTAGTGTGTAAGATAGGCCCTTCAAACTCACTCATTCCTTCAATTTGAGGCACAACCTCTTCAGCATTCTCTCCAGTGGCTACTATCAGCCACTGACAAACATATTCTGTCTCCTCCTTTTTCACACCTTGAGTCTTCACCCTCCAGTACCCACATCTATGATCAAAGTTGGCACTGATCACAGTCTTGCTTAAAGCTGGTTTTATGTCAAAATGGTCAGCATAGGCTTTGAGATAGGCCAAGAATTGTTGTTTGGTTGGATAAGAGGGAAAGTTTTGGGGGAAAGGCATTAGAGGGAGTTGGCAGAATTGCTTAGGTAGATGAAGGCATAGTCGGTCATAAGTCTTGAGCTGCCACATTGAAGCCAAGCAATCATCCCTTTCAAGGATTAGGCTTGGAATGCCTTTCTGTTTAAGACATGCTGCTGCAGCAAGCCCTGATGGACCAGCACCCACTATCACTGGTCCTTCCACACCTATTGGCTTTGTCATTTTACCCATCTTTACCTCAAGATAATCATGCACAGTTTTTCCTTCCACTTCCTTCAAGTACTCCATGTAAAGCATCAAAGGGAGAGGTGGGGAGGGGGGTATAATTTCAAGAATTTGAAGCCTGAATAAGCTTCAAGGGGTGCACGAGGTCATGACAAAGTGAAACCATTAAATCATGATTTTAAATTGCGGTCACAATCATGGTTTCATGACTATTCTTGATAAAGGGAAAATTTTGTGGATAAATGCAACCACAATTGCAGTCACGTTGTGGTCAGACAGACCTCAAACACCTTGATGTTGAGGCCAAAATTGCAGTGGCGGACTGCTTTTTAAAACTTTGCATAAAATAAAAACATGATAGTACTTTGAGTGAAGTTGAAACAGATGAGATACACTGTGGTTTGATTGATCTGAAGATCAAATCAACATGGTTTGTAAGGGTATGATTTGCTTCAAGGCTGAAAAGAGTATGAACTTTGGTTTTGTTGAATGGATGAGAAAACAGAGTAGCAGGGCATAAACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAARGGATTTTGTATTGGGATTCGATGTATACATGTATGTATATATATTTGAATTGGTGGCTGCTGATGAGTGTTAAAGGAGTTTGGTTTATAAGTGGGACAACTCCACCTTAATGATAACTAACATTAACAACAAACAAACTTTCATCACCCAAAAAACCAAATACACAACACATATTGGGAGTGGGCAAAATTTCGGCCTTAT。

Claims (10)

1.一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的引物对，其特征在于，所述KASP标记为与大豆耐荫基因GmYUC2密切相关的3个SNP突变位点的KASP标记，所述3个SNP突变位点位于大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体Chr05_40886611_40888609 bp位置，其中soySNP-1在40,886,611 bp发生了碱基C至T的替换，soySNP-2在40,886,699 bp发生了碱基C至T的替换，soySNP-3在40,888,609 bp发生了碱基G至A的替换；
所述引物对序列如下：
soySNP-1 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGC-3’；
soySNP-1 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAAAAGAACATACTATCAATATCAAAGGT-3’；
soySNP-1 KASP标记下游引物R为：5’-CATGGTCCTCAATAGTTAGCATGC-3’；
soySNP-2 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTG-3’；
soySNP-2 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTATTAACTCTAAAGAAACAAAACTCTTTA -3’；
soySNP-2 KASP标记下游引物R为：5’-GCATGCTAACTATTGAGGACCATG-3’；
soySNP-3 KASP标记上游引物F1为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAG-3’；
soySNP-3 KASP标记上游引物F2为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGAAACTAATAGACAGCTAGTTAAAA-3’；
soySNP-3 KASP标记下游引物R为：5’-CATCAGCAGCCACCAATTCAAATA-3’。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，当待测大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体Chr05_40886611_40888609 bp位置的3个SNP突变位点的基因型为CCG时，待测材料为不耐荫材料，基因型为TTA时，待测材料为耐荫性材料。
3.一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的试剂，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
4.一种用于检测大豆耐荫性能相关的KASP标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对或含有权利要求3所述的试剂。
5.权利要求1-2任一所述的引物对，权利要求3所述的试剂、或权利要求4所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
（A1）鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性；
（A2）制备鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性的产品；
（A3）选育或辅助选育耐荫性大豆；
（A4）制备选育或辅助选育耐荫性大豆的产品；
当待测大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体Chr05_40886611_40888609 bp位置的3个SNP突变位点的基因型为CCG时，待测材料为不耐荫材料，基因型为TTA时，待测材料为耐荫性材料。
6.一种选育或辅助选育耐荫大豆的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取大豆基因组DNA，用权利要求1所述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型；
当待测大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体Chr05_40886611_40888609 bp位置的3个SNP突变位点的基因型为CCG时，待测材料为不耐荫材料，基因型为TTA时，待测材料为耐荫性材料。
7.一种鉴定或辅助鉴定大豆耐荫性的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取大豆基因组DNA，用权利要求1所述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的荧光信号，进行基因分型；
当待测大豆基因组Wm82.a2.v2.0的5号染色体Chr05_40886611_40888609 bp位置的3个SNP突变位点的基因型为CCG时，待测材料为不耐荫材料，基因型为TTA时，待测材料为耐荫性材料。
8.根据权利要求5所述的应用，权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）大豆植株基因组DNA的提取；
（2）采用权利要求1所述的引物对生物样本的基因组DNA进行PCR扩增并检测权利要求1所述的SNP基因型：
将权利要求1所述的引物加入同一PCR反应体系，并设置2个以超纯水代替样品模版DNA的空白对照，在荧光定量PCR仪上对大豆种质资源的DNA进行扩增；
反应完成后，利用多功能酶标仪检测荧光，根据读取的荧光，分别计算FAM/ROX和HEX/ROX的比值，利用软件画出坐标图，获得样品的基因型；
（3）根据基因型判断大豆种质资源的耐荫性。
9.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于，
所述步骤（2）中，5.0 μl反应体系如下：大豆样品DNA模板5 -100 ng；FLu-Arms 2x PCRMix 2.5 μl；KASP上游分型引物 F1 10 μM 0.075 μl，KASP上游分型引物 F2 10 μM 0.075μl，KASP下游通用引物 R 10 μM 0.2 μl；补水至5.0 μl。
10.根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于，
所述步骤（2）中，PCR反应条件如下：94℃预变性3min，1个循环；95℃变性15 s，63.4~57℃退火45 s，每一个循环降低0.8 ℃，9个循环；94℃变性15 s，57.5℃退火45 s，45个循环；循环结束后再30 ℃延伸 30 s。
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