CN110904261B

CN110904261B - 小麦有效分蘖数qtl连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110904261B
Application number: CN201911242896.3A
Authority: CN
Inventors: 马建; 兰秀锦; 刘家君; 郑有良; 魏育明; 江千涛; 刘亚西; 陈国跃; 李伟
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CN110904261A

Abstract

本发明公开了小麦有效分蘖数QTL连锁的分子标记及其应用。所述小麦有效分蘖数QTL为QTL Qetn‑1B.1，所述分子标记命名为KASP‑1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪小麦有效分蘖数QTL Qetn‑1B.1，预测小麦的有效分蘖数特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定小麦有效分蘖数QTL Qetn‑1B.1的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强有效分蘖数的预测的准确性，以便快速筛选出具有增加有效分蘖数的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产量品种的选育进程。

Description

小麦有效分蘖数QTL连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物遗传育种领域，具体涉及小麦有效分蘖数QTLQetn-1B.1连锁的SNP分子标记以及该分子标记的应用。

背景技术

普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上主要的粮食作物，每年种植面积约为450万公顷。由于全球可耕地面积的持续减少和人口的增加，迫切需要小麦年产量的快速增长。

构成小麦产量的3个因素为穗数、穗粒数和千粒重。每公顷穗数是根据有效分蘖数计算的，因此有效分蘖数是影响小麦产量的重要因素。分蘖是单子叶植物特有的分枝现象，因此它具有重要的研究意义。此外，分蘖决定植物的分枝结构，影响开花、株高和种子发育，并最终影响每株植物的籽粒产量。

小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitativetrait locus，QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高等特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小等问题。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，不受环境和基因互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。

KASP是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive AlleleSpecific PCR,KASP)具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及In Del位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。

此前许多学者对有效分蘖数进行了QTL定位，发现与之相关的QTL在小麦中广泛存在，并且分布在小麦的各个染色体上。然而目前与小麦有效分蘖数性状相关且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却并不多。因此研究获得有关有效分蘖数的QTL或基因，利用分子生物学技术，增加有效分蘖数，进而增加穗粒数，最终达到选育增产小麦新品种的目的，在小麦育种工作中意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供与小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1紧密连锁的分子标记。

本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。

本发明的第三个目的在于提供上述小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1紧密连锁的分子标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

基于以上目的，申请人利用多有效分蘖数小麦品种‘SY95-71’为父本，以小麦品系‘20828’为母本杂交，得到杂种F₁，F₁代单株自交获得F₂，在F₂使用单穗传法，一直到F₇代，获得含有128个系的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体有效分蘖数表型鉴定，提取亲本‘20828’、‘SY95-71’和重组自交系群体植株DNA，本研究使用小麦55K SNP芯片来定位小麦有效分蘖数QTL。小麦55K SNP芯片是在小麦660K SNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55，000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2，600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别(指纹分析)。

根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的有效分蘖数表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019三个年份共8个生态点及8个生态点有效分蘖数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，在1B染色体长臂上的9.1cM区间定位出稳定表达的小麦有效分蘖数主效QTLQetn-1B.1，对侧翼标记进行物理定位并每隔1Mbp筛选位于区间内的基因，共筛选获得417个基因，并对部分基因在亲本‘20828’和‘SY95-71’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了5对共15条KASP引物(表1)，最终得到标记KASP-1与有效分蘖数QTLQetn-1B.1紧密连锁。

本发明所述的小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1，来自父本‘SY95-71’，该QTL位于小麦染色体1B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为505.11Mbp-556.99Mbp。本发明提供了上述小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1在调控小麦有效分蘖数性状中的应用。所述小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1显著增加小麦有效分蘖数，平均LOD值为7.04，解释约12.98％-44.25％的表型变异。

所述的小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1可通过SEQ ID NO.1-3所示的引物基于荧光定量PCR平台检测得到，其中SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在3’分别添加不同的荧光修饰基团。

进一步地，本发明提供了小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的SNP分子标记KASP-1，其与小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1紧密连锁。所述SNP分子标记的多态性为A/G。

本发明的小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的分子标记KASP-1由核苷酸序列如SEQID NO.1～3所示的引物对PCR扩增获得。

优选地，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团。所述荧光修饰基团包括但不限于FIFC、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、BHQ。

本发明提供了上述分子标记KASP-1在作物分子辅助育种、培育转基因小麦或小麦种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述分子标记KASP-1在培育多有效分蘖数性状的小麦或高产小麦中的应用。

本发明提供了上述分子标记KASP-1在筛选具有有效分蘖数增加的小麦品种或品系中的应用。

本发明还提供了用于检测小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的SNP分子标记KASP-1的引物组合物，其含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示的引物。

本发明提供了上述引物组合物在小麦种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述引物组合物在小麦多有效分蘖数的材料创制中的应用。

含有上述引物组合物的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种鉴定小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的分子标记方法，以待鉴定材料的DNA作为模板，用三条引物序列分别为SEQ ID NO.1～3所示的特异性引物对进行PCR扩增并读取荧光值，若为SEQ ID NO.1所示引物标记的荧光可判断为含有有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的小麦。

具体地，在本发明的一个实施例中，上述的应用，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增分子标记KASP-1的引物，在仪器CFX96 Real-Time System，进行PCR扩增反应并读取荧光值；

3)检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取FAM荧光，则待测植株为具有多有效分蘖数性状的小麦资源。

上述PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、三条引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。

上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。

本发明公开了位于小麦1B染色体上的与小麦有效分蘖数连锁的分子标记KASP-1，该分子标记是小麦1B染色体长臂上有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦1B染色体上的有效分蘖数QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-1与小麦1B上的有效分蘖数QTLQetn-1B.1紧密连锁，可用来对小麦有效分蘖数这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰有效分蘖数较少的植株，提高育种工作效率，并为小麦有效分蘖数基因的研究提供基础。

有益效果：(1)本发明首次公开了来自小麦‘SY95-71’的有效分蘖数QTL Qetn-1B.1，位于小麦1B染色体长臂上，显著增加小麦有效分蘖数。该QTL在小麦产量(调控有效分蘖数)育种中具有较高的利用价值。(2)本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘SY95-71’的有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的分子标记KASP-1，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。(3)本发明公开的分子标记KASP-1与有效分蘖数QTL Qetn-1B.1极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦多有效分蘖数品种的选择鉴定效率，且成功率高。

附图说明

图1为本发明实施例1中小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1在1B染色体上的定位。

图2为本发明实施例1中‘20828’×‘SY95-71’的重组自交系株系植株分子标记KASP-1检测的荧光读值结果；其中，FAM(黑色正方形，‘SY95-71’)荧光为有较多有效分蘖数的株系，HAX(灰色圆形，‘20828’)荧光为较少有效分蘖数株系；深灰色三角形荧光为杂合株系；黑色菱形荧光为空白对照。

图3为本发明实施例2中小麦‘S849-8’×小麦品种‘SY95-71’的重组自交系株系植株分子标记KASP-1检测的荧光读值结果；其中，FAM(黑色正方形，‘SY95-71’)荧光为有较多有效分蘖数的株系，HAX(灰色圆形，‘20828’)荧光为较少有效分蘖数株系；深灰色三角形荧光为杂合株系；黑色菱形荧光为空白对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所兰秀锦研究员种植资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1及其分子标记KASP-1的获得

(1)利用小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘SY95-71’为父本杂交，得到杂种F₁，F₁代单株自交获得F₂，在F₂使用单穗传法，一直到F₇代，获得含有128个系的重组自交系，构成遗传作图群体。

(2)重组自交系群体有效分蘖数表型鉴定：小麦成熟期对重组自交系有效分蘖数进行分析鉴定，去除每行两端的单株，分别收取五个长势一致的单株，计算有效分蘖数，并得出平均值，代表该株系的有效分蘖数。

(3)55K SNP芯片分析

a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、‘CN16’和重组自交系群体植株DNA。

b)使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbiotech.com)与贾继增课题组合作开发的55KSNP芯片完成。

c)连锁图谱的构建：根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的有效分蘖数表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(InclusiveComposite Interval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019三个年份共8个生态点及8个生态点有效分蘖数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linearunbiased prediction)值来检测QTL，定位出小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1，并计算Qetn-1B.1的位置和分子标记之间的遗传距离。

d)分蘖位点的比较以及分子标记的获得：前人报道与有效分蘖相关的QTL有很多，但在1B染色体上检测到的与有效分蘖相关的主效QTL相对较少。2007年Kumar等人基于两个作图种群鉴定了与有效分蘖相关的QTL QTp.ccsu-1B.1，并将其定位于1BS染色体上，因此它们并不是一个相同的位点。2003年Huang等人鉴定到的有效分蘖相关QTn.ipk-1B被定位在染色体1BL上的Xgwm1050和Xgwm759之间，尽管这两个标记的序列信息未知，但该QTL位于1B染色体着丝粒附近的deletion bin C-1BL6-0.32中,而Qetn-1B.1位于1B染色体上的deletion bin 1BL1-0.47-0.69，表明这两个QTL不是同一个位点。2008年Su等人鉴定了每株植物有效穗数的QTL，并将其定位在Xcfd65b(374.74Mbp)和Xbhw175之间。Xbhw175标记的位置靠近Xwmc85a(即328.94Mbp)，与Qetn-1B.1没有物理区间的重叠。这些结果均表明Qetn-1B.1很可能是一个新的稳定的QTL。为了进一步密化图谱并获得与有效分蘖数QTLQetn-1B.1紧密连锁的分子标记，利用55K SNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因，对这些基因在亲本‘20828’和‘SY95-71’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，利用DNAMAN设计KASP引物(共设计15条，5对KASP引物)见表1，最终得到标记KASP-1与有效分蘖数QTL Qetn-1B.1紧密连锁。

表1 5对KASP引物序列

e)进行分析。设计的5对KASP引物中最终得到了2个分子标记，其中KASP-1与有效分蘖数QTL Qetn-1B.1紧密连锁。结果见图1，图2。

实施例2分子标记KASP-1在选择控制有效分蘖数QTL Qetn-1B.1上的应用

(1)利用有效分蘖数少的普通小麦品系‘S849-8’为母本，有效分蘖数多的普通小麦品系‘SY95-71’为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择83个株系。

(2)对所获得的83个株系进行KASP-1标记检测，具体方法为：提取83个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-1的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：

FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAATTCAGCAACTATTCCCCA-3’(SEQ ID No.1)

HEX标签上引物：(波浪线部分为HEX标签序列)

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAATTCAGCAACTATTCCCCG-3’(SEQ ID No.2)

通用下游引物：5’-GCTCAAATACTATGGTAAAT-3’(SEQ ID No.3)

荧光读值结果(见图3)，将检测到与‘SY95-71’一致的FAM(橙色)荧光的植株基因型记为A，为多有效分蘖数型株系，同‘S849-8’一样表现为HAX(蓝色)荧光的植株基因型记为B，为少有效分蘖数型株系。各个株系基因型与有效分蘖数田间表型值如表2所示。与含有有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的‘SY95-71’类型相同的植株平均有效分蘖数为4.86，极显著高于与‘S849-8’类型的植株有效分蘖数(平均3.72)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的有效分蘖数QTL Qetn-1B.1确实有显著增高有效分蘖数的作用；同时本发明的分子标记KASP-1可以用与跟踪鉴定有效分蘖数QTL Qetn-1B.1。

表2‘S849-8’×‘SY95-71’重组自交系KASP-1基因型与表型对应结果

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 小麦有效分蘖数QTL连锁的分子标记及其应用

<130> KHP191116801.8

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taattcagca actattcccc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taattcagca actattcccc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcaaatac tatggtaaat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taacagataa ttagctccac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taacagataa ttagctccat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtcgtcgt tcatgacgag 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagcacctc tgatgcacg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagcacctc tgatgcact 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtagcccgg aaaatcaaac 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggaattca cttgctcca 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggaattca cttgctccg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctttatccag atatggccat 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggttctctc aagggatgc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggttctctc aagggatgt 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttaagtgcca gatagaggag 20

Claims

1.小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SNP分子标记，命名为KASP-1，其与小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1共定位于小麦1B染色体长臂上，且位于QTL Qetn-1B.1区间内，所述SNP分子标记的多态性为A/G；

所述分子标记通过以下引物组合扩增得到，所述引物组合含有3条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’端分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’端分别添加不同的荧光修饰基团。

3.一种引物组合物，其特征在于，含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

4.权利要求1-2任一所述的分子标记或权利要求3所述的引物组合物在培育转基因小麦或小麦种质资源改良中的应用。

5.权利要求1-2任一所述的分子标记或权利要求3所述的引物组合物在培育多有效分蘖数小麦或高产小麦中的应用。

6.权利要求1-2任一所述的分子标记或权利要求3所述的引物组合物在筛选具有有效分蘖数增加的小麦品种或品系中的应用。

7.一种鉴定小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1的分子标记的方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；所述引物组合物中，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团，将能够读取到SEQ ID NO.1所标记的荧光基团的植株鉴定为具有多有效分蘖数性状的小麦资源；所述分子标记为SNP分子标记，命名为KASP-1，其与小麦有效分蘖数QTL Qetn-1B.1共定位于小麦1B染色体长臂上，且位于QTL Qetn-1B.1区间内，所述SNP分子标记的多态性为A/G。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增反应体系：5μLMaster Mix、引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH₂O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白；

荧光定量PCR程序：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。