CN116769961B - 利用多-筛-混-定四步法开发的小麦每穗小穗数qtl连锁分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用多‑筛‑混‑定四步法开发的小麦每穗小穗数QTL连锁分子标记及应用，属于作物分子遗传育种领域。该SNP分子标记为KASP‑SNS‑sicau1，多态性为C/T，KASP‑SNS‑sicau1与小麦小穗数QTL QSNS.sicau‑SSY‑7A共定位于小麦7A染色体长臂上。本发明公开的分子标记KASP‑SNS‑sicau1与小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau‑SSY‑7A极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，能准确预测小麦每穗小穗数性状，对小麦产量的提升和高效筛选具有较多小穗数的优质小麦品种起到重要作用，也利于提高小麦育种的效率。
Description
技术领域
本发明涉及作物分子遗传育种领域，特别是涉及与利用多-筛-混-定四步法开发的小麦每穗小穗数QTL连锁分子标记及应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要和广泛种植的粮食作物之一，提供全球20％的热量摄入，占谷物产量的四分之一。每穗粒数(KNS)、千粒重(TKW)和单位面积穗数(SNPA)是产量的三个组成部分，它们与每穗小穗数(SNS)、不育穗数和穗粒重等穗部性状密切相关。鉴于每穗小穗数对增加小麦产量的潜力，挖掘、鉴定、解析和利用控制小麦每穗小穗数的基因对提高小麦群体产量具有重要意义，另一方面对进一步理解和认识小麦小穗发育调控机制具有促进作用。
穗型的改良是超高产育种的重要途径，穗型是育种家对亲本选择、后代筛选的重要标准之一，穗部的结构决定了小麦的产量，因此也是一个关键的农艺性状，需要加以改良，以提高产量和易于收获。随着科研工作者对提高作物产量不断深入的研究，许多学者认为可以通过作物穗部性状的改良来突破产量限制。因而，深入挖掘植物穗发育相关基因，揭示植物穗发育机制，对于植物穗型改良和产量提升有着重要意义。
小麦小穗数是复杂的受多基因控制的数量性状，且对环境因素也很敏感。小麦基因组庞大而复杂，重复核苷酸序列较多，且缺乏注释基因组序列。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)标记是指在核苷酸序列中，某一处特定的位置单核苷酸位点A、T、G或C发生变异，使DNA序列改变而出现多态性。SNP在植物基因组中分布广泛、数量较多，基因的编码区和非编码区均存在。对于基因组较简单的生物来说，SNP常被用于全基因组扫描，构建高密度遗传图谱，进行重要性状的QTL检测和分析；对于基因组较复杂的小麦来说，SNP常常被用于跟基因芯片结合使用，例如9K、55K和660K SNP芯片，用来检测目标性状相关的基因组区域，促进育种进程。
混合群体分离分析法(BSA，Bulk Segregant Analysis)是利用具有极端表型的个体集合构建混池，相较于传统的遗传学研究方法，最大的特点是不需要对群体中的所有个体进行基因分型，而是对挑选的个体按照性状进行混合分析，所以可以极大地降低研究的工作量和成本。不同类型的群体在研究方法上可能存在一定差异，但核心都是根据染色体重组交换，控制形状的目标基因或片段上的标记连锁来确定候选基因，可以显著减少工作量和试剂耗材成本，提高连锁标记的筛选效率。因此，利用BSA分析对相关基因进行定位相比遗传图谱和GWAS分析更加经济和快速，目前已广泛用于小麦质量相关性状的研究，然而在小麦小穗数这一复杂的数量性状相关位点定位中应用较少。
竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)技术就是现代随着科技发展而出现的一种新型SNP检测技术，它的工作原理是对SNP位点进行特异性引物设计，通过SNP的特异性来进行标记分型和检测，可应用于广泛的基因组DNA，它的Master Mix通常是在普通PCR的基础上，使用由两种特殊荧光基团和猝灭基团做互补探针而构成的。KASP技术具有通量高、结果准确、成本低、操作简单、无需电泳经检测等特点，很好地解决了其他标记在应用上的缺点。
此前部分学者对小麦每穗小穗数进行了QTL定位，然而目前与小麦每穗小穗数性状相关且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却并不多。因此研究获得有关小穗数的QTL或基因，利用分子生物学技术，选择合适的每穗小穗数小麦植株，对于育种工作中产量的提升是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供利用多-筛-混-定四步法开发的小麦每穗小穗数QTL连锁分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记与每穗小穗数QTLQSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁，能够准确跟踪小麦每穗小穗数QTLQSNS.sicau-SSY-7A，可显著提高不同环境下每穗小穗数较多小麦品种的选择鉴定效率，且成功率高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述核苷酸序列第23位存在C/T突变，所述SNP分子标记与小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A共定位于小麦7A染色体长臂上。
在RefSeqv2.0基因组版本的物理位置为565.80-569.70Mbp。
本发明还提供一种用于扩增所述的SNP分子标记的引物组合，所述引物组合包括SEQ ID NO：1-2所示的两条特异性引物和SEQ ID NO：3所示的一条通用引物。
本发明还提供一种检测小麦全基因或其基因片段的产品，包括所述的引物组合。
优选的是，所述产品包括芯片或者试剂盒。
本发明还提供所述的SNP分子标记、或所述的引物组合或所述的产品的应用，用于如下任一项应用中：
(1)筛选具有合适小穗数的小麦品种或品系；
(2)调控小麦每穗小穗数性状；
(3)提高小麦产量；
(4)小麦每穗小穗数基因遗传分析或遗传精细定位。
本发明还提供一种筛选含有每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A的小麦株系方法，包括以下步骤：
以待测植物样品的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组合对所述模板进行荧光定量PCR扩增，根据所得扩增产物的荧光检测结果进行基因型分型。
优选的是，所述PCR扩增的反应体系为：5μL Master Mix、1.4μL混合引物、5ng模板DNA、ddH2O补充至总量为10μL；其中，所述混合引物是由如SEQ ID NO：1-3所示引物，均按照10ng/μL的浓度分别加入120μL、120μL和300μL，并添加460μL ddH2O进行混合而成。
优选的是，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、60℃复性/延伸50s，共8个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共28个循环。
优选的是，所述基因型分型的标准为：与SEQ ID NO：1所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较多的小麦株系，与SEQ ID NO：2所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较少的小麦株系。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明首次公开了来自小麦‘S849-8’的每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A，位于小麦7A染色体长臂上，显著增加小麦小穗数。该QTL在小麦产量(调控小穗数)育种中具有较高的利用价值。
(2)本发明公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘S849-8’的每穗小穗数QTLQSNS.sicau-SSY-7A的分子标记KASP-SNS-sicau1，检测准确高效、扩增方便稳定。
(3)本发明公开的分子标记KASP-SNS-sicau1与每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高适应不同环境的小麦每穗小穗数较多品种的选择鉴定效率，且成功率高。
(4)本发明公开了位于小麦7A染色体上的与小麦每穗小穗数连锁的分子标记KASP-SNS-sicau1，该分子标记是小麦7A染色体长臂上每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦7A染色体上的小穗数QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。
(5)本发明提供的分子标记KASP-SNS-sicau1与小麦7A上的每穗小穗数QTLQSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁，可用来对小麦每穗小穗数这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰每穗小穗数较少的植株，提高育种工作效率，并为小麦每穗小穗数基因的研究提供基础。
(6)本发明首次提出基于“多种环境评价-极端表型筛选-混池构建分型-连锁图谱定位”(简称：“多-筛-混-定”四步法)这一遗传基础解析新模式，还将分子标记KASP-SNS-sicau1应用于小麦每穗小穗数性状的鉴定，拓展了分子标记KASP-SNS-sicau1的应用范围，并为以后在利用此类数量性状标记进行分子标记辅助选择育种奠定一定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中构建极端混池的过程及结果；
图2为本发明实施例1中小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A在7A染色体上的定位；a：差异SNP位点在小麦的21条染色体上分布情况；b：差异SNP位点在7A染色体上分布情况；c：分子标记KASP-SNS-sicau1与每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁定位图；
图3为‘S849-8’基因型的株系的小穗数与‘SY95-71’基因型的株系的小穗数比较结果；
图4为实施例2中小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A对小穗数、粒长、千粒重、穗长、株高、开花期和有效分蘖数的多效性评价结果；
图5为本发明实施例3中，小麦‘S849-8’בCN16’F6验证群体的株系植株分子标记QSNS.sicau-SSY-7A检测的荧光读值结果；其中，FAM(圆形，‘S849-8’)荧光为有每穗小穗数较多的株系，HEX(正方形，‘CN16’)荧光为每穗小穗数较少株系；黑色菱形荧光为空白对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
包括每穗小穗数在内的产量性状受多基因控制且容易受环境影响，挖掘和鉴定控制这类性状的主效且稳定表达的基因或者位点通常难度较大。为此，研究者们可通过在3个及以上的多年多点的环境下对表型进行精准鉴定。根据多环境表型评价结果选取表型差异极端的个体，按照两个极端分组混合DNA构成极端混池。同时，结合高通量测序技术或标记技术，比较两组样本在多态位点的等位基因频率(AF)是否具有显著差异，是否在某一特定区段内差异标记显著增多，从而构建图谱进行定位与目标性状相关联的位点。再根据连锁图谱和侧翼标记开发高通量分子标记，在其他具有不同遗传背景的群体进行验证。另外，同时分析这些位点的遗传效应及兼顾位点对其他重要产量性状的效应，从而进一步综合评价其育种利用潜质。基于此，创立了“多种环境评价-极端表型筛选-混池构建分型-连锁图谱定位”(简称：“多-筛-混-定”四步法)的遗传解析新模式，以此方法为基础，对目标性状位点进行遗传定位和SNP分子标记开发。
基于以上目的，申请人利用小麦品系‘S849-8’为父本，以小麦品系‘SY95-71’为母本杂交，通过单籽传法，获得含有214个株系的重组自交系，构成遗传作图群体。对2021WJ、2021CZ和2021YA三个环境的每穗小穗数进行表型鉴定，将BSA与小麦660K SNP芯片结合，分析2个亲本和2个极端性状混池的差异SNP。通过以下步骤，构建极端混池：(1)SSY的SNS表型数据在三个环境中的排列顺序为先降后升。分别取3个环境中最大值和最小值的50个株系，记录其编号。(2)计算并记录三个环境每个株系表型数据的平均值,按照从小到大的顺序排列，分别选择平均值最大和最小的30个株系。(3)对(1)和(2)得到的编号进行交集筛选，最终选取最大值和最小值各23和24个株系(图1)。采用CTAB法提取每穗小穗数最少的24个株系(每株系10粒)、每穗小穗数最多的23个株系(每株系10粒)和2个亲本的等量DNA用于小麦660K SNP芯片分析，并对该群体进行图谱构建，从而定位每穗小穗数QTL。小麦660K芯片是由中国农业科学院作物研究所的贾继增课题组开发的一款小麦多倍体二倍体化的高密度SNP芯片，共含有630518个SNP标记。与90K芯片相比，660K芯片中SNP的数量显着增加，是适合于一般的种质资源多样性分析、一般的遗传作图、新基因发现、比较基因组分析与品种注册与鉴别等的SNP芯片，能服务于接下来的标记开发和精细定位工作。
根据660K SNP芯片数据，在目标染色体的候选区段内开发KASP标记对群体进行基因分型，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的每穗小穗数表型数据，用QTLIciMapping4.0中的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2021-2022年6个生态点及6个生态点每穗小穗数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，在7A染色体长臂上的1.6cM区间定位出稳定表达的小麦每穗小穗数主效QTL QSNS.sicau-SSY-7A，开发分子标记，最终得到标记KASP-SNS-sicau1与小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁。小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A显著增加小麦每穗小穗数，平均LOD值为6.41，解释约6.86-15.72％的表型变异。
为了更进一步说明上述技术方案，下面以具体的实施例加以详细说明。
实施例1基于多-筛-混-定之新模式鉴定小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A及其分子标记KASP-SNS-sicau1的获得
(1)利用小麦品系‘SY95-71’(1999年1月四川农业大学培育而成)为母本，以小麦品系‘S849-8’(2015年5月四川农业大学培育而成)为父本杂交，通过单籽传法，获得含有214个株系的重组自交系构成遗传作图群体。
(2)重组自交系群体每穗小穗数表型鉴定：小麦蜡熟期对重组自交系每穗小穗数进行分析鉴定，排除边际效应，选取每个株系中长势一致的3-5个单株对每穗小穗数进行鉴定，其平均值为每个株系最终的每穗小穗数。
(3)运用混合群体分离分析法(BSA)，构建两个亲本池，同时根据2021WJ，2021CZ和2021YA三个环境点群体的表型数据(表1)，在F6群体中筛选出两组分别具有23和24个极端每穗小穗数差异的株系分别构建混池(图1)。
表1 S849-8/SY95-71重组自交系群体三个环境下的每穗小穗数表型
注：“SSY”为S849-8/SY95-71重组自交系群体；“-”表示信息缺失。
(4)660K SNP芯片分析
a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘S849-8’、‘SY95-71’和F6群体植株DNA。
b)使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本发明中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbio tech.com)与贾继增课题组合作开发的660K SNP芯片完成，该芯片市售可得。
c)通过筛选两个极端混池之间有差异的SNP，并将这些差异SNP位点整合到小麦的21条染色体上，结果表明，在7A染色体上含量最多。因此，初步确定在7A染色体上可能存在着控制每穗小穗数的位点，并且在7A染色体440-560Mbp之间差异SNP的集中度最高，将这一段被选为候选区段(图2中a和b)。
d)连锁图谱的构建：根据660K SNP芯片数据，在目标染色体的候选区段及其周围，开发可用的KASP标记对S849-8群体进行基因分型，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的每穗小穗数表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2021-2022年共6个生态点及6个生态点每穗小穗数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，定位出小麦每穗小穗数QTLQSNS.sicau-SSY-7A，并计算QTL QSNS.sicau-SSY-7A的位置和分子标记之间的遗传距离。
e)每穗小穗数位点的比较以及分子标记的获得：小麦染色体7A可能对每穗小穗数起着至关重要的作用，因为在小麦染色体7A上已经发现了许多与SNS相关的位点和基因。QTsn.cau-7A.1(670.80-675.30Mb)和QTsn.cau-7A.2(675.50-683.50Mb)在染色体臂7AL上被鉴定出可影响每穗小穗数和开花期(Plant Biotechnol Journal 20:920-933)。QSns.sau-QZ-7A位于wPt-5949和wPt-0961之间，位于7A染色体669.62-700.42Mb(CropScience 56:2410-2420)。QSns.sau-2SY-7A定位于4.75cM的区间，物理位置在7AL染色体臂673.87-677.70Mb之间，推断WAOP1为其候选基因(Journal of Integrative Agriculture21:1551-1562)。通过比较了它们的物理位置，进一步确定之前研究中发现的QTL与本发明中发现的QTL之间的关系。这些结果表明QSNS.sicau-SSY-7A可能是一个新的调控每穗小穗数的位点。
为了进一步获得与每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁的分子标记，利用660K SNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因。开发获得高效的KASP分子标记，需要如下多个步骤：
(I)设计扩增特定小麦基因型目标同源染色体(7A)候选基因序列的引物。虽然目前已有六倍体小麦‘中国春’参考基因组，但是因为小麦进化过程中可能有染色体结构变异(Ma J,Stiller J,Wei Y,Zheng Y-L,Devos KM,J,Liu C(2014)ExtensivePericentric Rearrangements in the Bread Wheat(Triticum aestivum L.)Genotype“Chinese Spring”Revealed from Chromosome Shotgun Sequence Data.Genome BiolEvol 6:3039-3048)，不同小麦基因型的基因序列结构和多态性位点差异可能较大，要高效、快速、低成本地获得特定小麦基因型的基因序列，最简单的方法便是同源序列克隆。而因为小麦具有三个部分同源染色体组，要分离获得特异于其中某个同源染色体上的序列具有很大难度(Bagge M,Xia X,Lübberstedt T(2007)Functional markers in wheat.CurrOpin Plant Biol 10:211-216)，需要通过设计特异于某个染色体组上的引物。在熟练掌握比较基因组学技术、生物信息学技术的基础上，对六倍体小麦的供体二倍体亲本乌拉尔图小麦和节节麦、四倍体野生二粒小麦和六倍体‘中国春’等参考基因组进行序列截取、比对、分析，获得特异于某个染色体上的多态性位点，从而设计扩增目标区域的特异引物。在设计好引物后，需依靠比较基因组学技术对引物特异性、退火温度、扩增长度等进一步分析，从而确定引物的可用性。
(II)利用特异引物对目标小麦基因型进行扩增。在进行扩增时，需要凭借熟练的分子生物学技术对扩增条件进行优化，进一步克隆测序。以获得目标区域的基因序列。
(III)目标同源染色体候选基因序列多态性位点的获得。在获得两个亲本候选基因序列后，需要进一步对序列进行详细分析，检测是否有多态性位点，如果没有，则需要重新回到第I步，选择其他可能的候选区域进行分离克隆。
(IV)多态性位点上下游KASP引物的设计。在获得多态性位点之后，需要设计KASP特异引物。由如前所述，小麦为异源六倍体植物，则仍然要凭借熟练的生物信息学技术对ABD染色体序列进行分析，从而获得特异于目标染色体的KASP引物。
(V)KASP引物扩增条件的优化。引物合成之后，需要凭借经验进一步对引物扩增条件进行调试优化，以便能达到在亲本之间能够显著区分的效果。
综上所述，虽然KASP标记技术已经广泛应用于二倍体物种，但是要想在六倍体小麦中获得高效的KASP标记时，对本领域技术人员而言绝非易事。
最终经过多次KASP标记开发，引物设计和扩增，共设计KASP引物6对(表2)，最终得到标记KASP-SNS-sicau1(多态性为C/T)与每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁。KASP-SNS-sicau1的核苷酸序列(SEQ ID NO.19)如下：
TGAGCCTCGTAACATTCCAGAT[C/T]GATAATTACCTGCTGAAGC；上述序列的23bp处碱基存在C/T突变。
表2 KASP引物序列
设计的6对KASP引物中最终得到了1个分子标记KASP-SNS-sicau1，其与每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A紧密连锁，结果见图2中c。
实施例2每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A对粒长、千粒重、穗长、株高、开花期和有效分蘖数的多效性评价
根据基因分型结果，标记KASP-SNS-sicau1将定位作图群体‘S849-8’בSY95-71’F6的214个株系分为三种基因型。其中，与‘S849-8’基因型相同的具有99个株系，与‘SY95-71’基因型相同的具有96个株系，其余为杂合基因型，未进行比较分析。根据其BLUP值，具有‘S849-8’基因型的株系的每穗小穗数显著高出具有‘SY95-71’基因型的株系9.58％(图3)。基于此，本发明在该定位群体中对粒长、千粒重、穗长、株高、开花期和有效分蘖数也进行了效应分析(图4)，根据这些性状的BLUP值，具有‘S849-8’基因型的株系的粒长(+1.19％)、千粒重(+2.60％)、穗长(+3.94％)与具有‘SY95-71’基因型的株系差异显著(P＜0.05，图4)。综上结果，每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A的效应对这些重要的农艺性状的起到重要的兼顾作用，为该每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A在育种上的利用奠定基础。
实施例3分子标记KASP-SNS-sicau1对控制每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A在不同的遗传背景下进行验证
(1)利用较多每穗小穗数的普通小麦品‘S849-8’为父本，每穗小穗数较少普通小麦品种‘川农16’(1998年1月四川农业大学培育而成，简写为‘CN16’)为母本构建F6群体，首先对检测‘S849-8’和‘CN16’进行QSNS.sicau-SSY-7A标记检测。
(2)再从重组自交系后代株系中随机选择75个株系进行KASP-SNS-sicau1标记检测，具体方法为：提取75个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-SNS-sicau1的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGCCTCGTAACATTCCAGATC-3’(SEQ ID NO:1)
HEX标签上引物：(下划线部分为HEX标签序列)
通用下游引物：5’-CTCTGTTCGCTTCAGCAGGT-3’(SEQ ID NO:3)
PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为15μL，其中，混合引物是由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示引物均按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后制备而成。同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、60℃复性/延伸50s，共8个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共28个循环；完成后进行荧光读值。
荧光读值结果如图5所示，将检测到与‘CN16’一致的FAM荧光的植株基因型记为B，为每穗小穗数较少的株系，同‘S849-8’一样表现为HEX荧光的植株基因型记为A，为每穗小穗数较多的株系。各个株系基因型与每穗小穗数的表型值如表3所示。
表3 ‘S849-8’בCN16’F6群体KASP-SNS-sicau1基因型与表型对应结果
由表3可见，与含有每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A的‘S849-8’类型相同的植株平均每穗小穗数为24.31，极显著高于与‘CN16’类型的植株平均每穗小穗数(23.82)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A确实有显著增加每穗小穗数的作用；同时本发明的分子标记KASP-SNS-sicau1可以用于跟踪鉴定每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A。
依据实施例1形成了“多-筛-混-定”这一遗传解析新模式，基于该模式对鉴定小麦每穗小穗数主效QTL及其连锁的SNP分子标记开发进行了全面清晰的阐述。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种检测与小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A连锁的SNP分子标记的试剂的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：
(1)筛选具有增加小穗数的小麦品种或品系；
(2)小麦每穗小穗数基因遗传分析或遗传精细定位；
所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述核苷酸序列第23位存在C/T突变，所述SNP分子标记与小麦每穗小穗数QTL QSNS.sicau-SSY-7A共定位于小麦7A染色体长臂上；
所述试剂为SEQ ID NO：1-2所示的两条特异性引物和SEQ ID NO：3所示的一条通用引物；所述SEQ ID NO：1的荧光标记为FAM，所述SEQ ID NO：2的荧光标记为HEX；
利用如SEQ ID NO：1-3所示的引物对待测植物样品的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，若检测到的荧光为与SEQ ID NO：1所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较多的小麦株系，若检测到的荧光为与SEQ ID NO：2所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较少的小麦株系。
2.一种筛选含有每穗小穗数较多的小麦株系方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测植物样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO：1-3所示的引物对所述模板进行荧光定量PCR扩增，根据所得扩增产物的荧光检测结果进行基因型分型；若检测到的荧光为与SEQ IDNO：1所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较多的小麦株系，若检测到的荧光为与SEQID NO：2所示引物的荧光一致的植株为每穗小穗数较少的小麦株系；所述SEQ ID NO：1的荧光标记为FAM，所述SEQ ID NO：2的荧光标记为HEX。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：5μL MasterMix、1.4μL混合引物、5ng模板DNA、ddH2O补充至总量为10μL；其中，所述混合引物是由如SEQID NO：1-3所示引物，均按照10ng/μL的浓度分别加入120μL、120μL和300μL，并添加460μLddH2O进行混合而成。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、60℃复性/延伸50s，共8个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共28个循环。
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| GR01 | Patent grant | ||
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