CN108018337A - 一种应用kasp技术进行高通量转化体特异性检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于KASP(竞争性等位基因PCR)技术的高通量转化体特异性检测的方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用转化体靶标序列的引物、内源基因的引物、KASP反应液以及样品DNA，进行PCR反应，判断样品是否含有转化体的成分。利用本方法对植物样品进行转化体特异性检测具有高通量、低成本、高准确率以及易于操作等优点。

Description

一种应用KASP技术进行高通量转化体特异性检测的方法

技术领域：

本发明涉及分子生物学领域，具体的，涉及一种利用KASP技术进行高通量转化体特异性检测的方法。

背景技术：

对转基因作物及其产品的分子检测是转基因生物安全管理的基础。我国目前进口的转基因原料包括玉米、大豆、油菜等多种作物的几十种转化体，有相当一部分转化体由于尚未通过国家相关部门的批准，因此暂时不能进口。转化体特异性检测至少有三方面的作用：第一，转化体特异性的检测能预防未经批准的转化体的进口，有利于我们国家对进口的转基因作物及其产品进行有效的监管；第二，转化体特异性的检测是进行转基因品种真实性检测手段之一；第三，如果需要对产品中转基因成分进行定量检测，需要先通过转化体特异性检测确定产品含有转化体的种类。

目前常用的转化体的检测方法有基于样品DNA和基于样品蛋白质的检测方法。基于DNA的检测方法包括普通PCR和实时荧光PCR等，前者检测成本低，但是操作繁琐；后者的检测灵敏度高，但是检测费用昂贵。两者共同的缺点是通量低，很难对大批量样品进行高效的检测。基于蛋白质的检测方法包括酶联免疫吸附测定法和转基因快速检测试纸条，他们的优点是简便而且快速，缺点在于他们无法区分表达相似蛋白的转基因品系,无法检测蛋白已经变性的样品，另外抗体的研发以及实验体系的建立比较复杂，造成前期的成本高。总之，依靠上述常规的方法，很难实现对植物样品进行高通量且低成本的转化体特异性检测。

竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测样品基因组上某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位、以及种子资源鉴定的主要技术手段。

然而，目前尚未见利用KASP技术对转基因作物进行转化体特异性检测的报道。

发明内容：

有鉴于此，提出本发明。

KASP技术被研究者广泛应用于SNP基因分型等的研究中，通过对一段含有SNP位点的基因序列设计不同引物来进行SNP分型，而并未见将KASP技术应用于转化体特异性检测的报道。本发明的发明人设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物，并利用KASP技术来检测样品是否含有转基因成分，极大地提高了转基因检测的效率。

与KASP技术应用于SNP分型不同，将KASP应用于转化体特异性检测时需要在反应中加入转化体靶标序列的引物和内源基因的引物，如何保证两对引物之间没有互相干扰成为本应用的一个难点。另外在进行大批量样品检测的时候，如何确保检测结果的准确性也是本应用的一个难点。

本发明中，发明人经大量尝试，确定了农作物的内源基因和一些常见转化体靶标序列的引物的优良组合。通过该发明的方法,不仅可以检测样品是否含有转化体，同时可以验证该反应是否正确进行(如果没有内源基因的检测信号，则证明此次反应没有正确进行)，显著提高了检测的效率。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了KASP技术在检测转化体的应用。其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用转化体靶标序列的引物、内源基因的引物进行检测，判断样品是否含有该转化体的成分。

具体的，步骤(1)中的转化体靶标序列的引物设计策略是：一条引物设计在外源插入片段区域，另一条设计在插入片段侧翼的植物基因组区域，扩增片段的长度在50-120bp之间。正向引物5'端需要添加FAM标签序列(GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)修饰，反向引物不需要作任何修饰。

表1中SEQ ID NO:1-16为本发明提供的一系列转化体靶标序列的引物。

表1：转化体靶标序列的引物

具体的，步骤(2)中的内源基因的引物设计策略是：正向和反向引物都设计在作物的内源基因区域，扩增片段的长度在50-120bp之间。正向引物5'端需要添加HEX标签序列(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)修饰，反向引物不需要作任何修饰。

表2中SEQ ID NO:17-24为本发明提供的玉米等作物的内源基因的引物。

表2：内源基因的引物

设计引物时，申请人对引物进行了大量的验证及改进，以保证不同的引物间不会互相影响，干扰实验结果，以保证转化体的检测能够准确、高通量的进行。

具体的，步骤(3)的操作如下：

将样品分别加入提取板中，将样品粉碎之后加入提取液，温育之后离心，将上清液转移到新的提取板，沉淀DNA，离心后去除上清液，洗涤，溶解DNA。

优选的，所述样品为叶片样品。

优选的，所述检测板为384孔板。

优选的，提取DNA的方法为：加入钢珠后利用震荡器将样品研磨，加入DNA提取液，65℃温育45分钟，然后后离心。

优选的，使用异丙醇沉淀DNA。

优选的，使用乙醇进行洗涤，加水溶解DNA。

如果需要检测样品是否含有某个特定的转化体，将连接了标签序列的转化体靶标序列引物和内源基因引物、DNA模板以及KASP反应液按照一定比例混合构建PCR反应体系(表3)。将加样完毕的反应板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

所述KASP反应液可以通过商业途径购买到，其主要成分是FAM、HEX荧光染料、淬灭基团、高保真的Taq酶、dNTP以及缓冲液。

表3：PCR反应体系的构建

反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，扫描的结果会以散点图的形式出现，每一个点对应某个特定样品的产物释放出来的荧光情况。

图形的横坐标表示产物释放的FAM荧光，纵坐标表示产物释放的HEX荧光。基于KASP反应原理，由于转化体的正向引物5'端连接着FAM标签序列，所以如果转化体扩增出来，产物会产生FAM荧光；而由于内源基因的正向引物5'端连接着HEX标签序列的情况，所以如果植物内源基因扩增出来，产物会产生HEX荧光；如果转化体和植物内源基因都扩增出来，产物会产生FAM和HEX荧光。因此，如果从某样品的产物中检测出显著的FAM荧光和HEX荧光，则表明该样品是转化体阳性；如果仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到FAM荧光，则表明该样品是转化体阴性；如果没有检测到显著的HEX荧光以及FAM荧光，则表明样品或者实验操作有问题，需要重新检测(图1)。

应该指出，转化体靶标序列的正向引物，与内源基因的正向引物，只要连接不同的荧光标签序列即可实现本发明，并不限于本发明中提到的这种方式。

本发明还提供了一种基因检测试剂盒，包括引物组1-8中一组或多组，及引物组9-12中一组或多组。

通过上述KASP技术进行基因转化体的检测，每天可以检测上千个样品，检测效率、检测成本远低于荧光定量PCR；检测的准确度可以和荧光定量PCR相媲美。该方法由于具有高通量、低成本、高准确率以及易于操作等优点，非常适合农业主管部分进行转基因抽查，同时也很适合育种公司在进行转基因回交育种时候检测目的基因是否成功导入受体材料。

本发明的有益效果为：

(1)高通量：荧光定量PCR技术要求对PCR反应每个循环的荧光进行实时检测，因此它的检测通量受到限制，一般只能达到96或者384个反应。本发明方法采取对产物的荧光进行终点法的检测，因此利用本发明方法结合配套的仪器进行转化体特异性检测时，检测通量高达5376个反应，所以本发明的方法的检测通量是荧光定量PCR的14～56倍。

(2)高效率：利用本发明的方法配套的设备进行PCR反应体系构建时实现半自动化操作，这样不仅能大幅度的节省人力和时间，而且能有效降低了出错的概率。

(3)低成本：利用本发明方法进行转基因筛选检测不需要合成特异性的探针，而荧光定量PCR需要针对待检测的基因合成特异性的探针，因此跟荧光定量PCR相比，大大地节省检测的成本。

(4)准确度高：本发明的引物配对经过严格筛选，挑选出来合适的引物配对，引物之间互相影响的程度低，扩增效率高。利用本发明方法对已知基因型的样品进行检测，测试结果与样品本身的基因型一致程度达99.7％以上，表明该方法的准确度很高。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为高通量转化体特异性检测的结果示意图。NTC是空白对照即该反应孔中没有DNA模板；质粒是本实验室构建的转化体检测质粒，其含有转化体靶标片段但不含植物的内源基因。

图2为利用本发明方法对已知基因型玉米样品的检测结果示意图。上图表示利用KPM1758引物组合检测样品是否含有NK603的成分，下图表示利用KPM1749引物组合检测样品是否含有MON810的成分。图中正方形表示反应孔中没有DNA模板(NTC)，三角形表示模板是玉米转化体DNA，圆形表示模板是野生型玉米DNA，菱形表示模板是转化体检测质粒；

图3为利用本发明方法对已知基因型油菜样品的检测结果示意图。上图表示利用KPM1741引物组合检测样品是否含有OXY235的成分，下图表示利用KPM1737引物组合检测样品是否含有GT73的成分。图中正方形表示反应孔中没有DNA模板(NTC)，三角形表示模板是油菜转化体DNA，圆形表示模板是野生型油菜DNA，菱形表示模板是转化体检测质粒；

图4为利用本发明方法对已知基因型大豆样品的检测结果示意图。上图表示利用KPM1723引物组合检测样品是否含有DAS-68416-4的成分，下图表示利用KPM1722引物组合检测样品是否含有DAS-44406-6的成分。图中正方形表示反应孔中没有DNA模板(NTC)，三角形表示模板是大豆转化体DNA，圆形表示模板是野生型大豆DNA，菱形表示模板是转化体检测质粒；

图5为利用本发明方法对已知基因型水稻样品的检测结果示意图。上图表示利用KPM1714引物组合检测样品是否含有LLRICE62的成分，下图表示利用KPM1712引物组合检测样品是否含有KMD(克螟稻)的成分。图中正方形表示反应孔中没有DNA模板(NTC)，三角形表示模板是水稻转化体DNA，圆形表示模板是野生型水稻DNA，菱形表示模板是转化体检测质粒。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1利用本发明方法对已知基因型的样品进行高通量的检测

利用本发明方法进行检测时，反应体系中加入了转化体靶标序列的引物和内源基因的引物，如何保证两对引物之间没有互相干扰是本应用的一个难点。另外利用本发明方法对大批量的样品进行高通量检测时，检测结果的准确性和可靠性是另外一个难点。为了测试本发明方法中引物的效果以及利用本发明方法进行高通量检测的准确性，对已知基因型的玉米、水稻、大豆、油菜的样品进行转化体特异性检测，然后将检测的结果和样品本身的基因型信息进行比较。实验的具体步骤如下：

1.DNA模板的准备：分别准备非转基因植物样品(玉米、油菜、大豆、水稻)的DNA、含转化体特异性片段的植物样品DNA、转化体检测质粒(含有转化体靶标片段但不含植物的内源基因,为正对照)以及无菌水(空白对照)。

2.构建反应体系:将转化体靶标序列的引物(正向引物的5'端添加FAM标签序列，反向引物不作修饰)、该转化体对应物种的内源基因的引物(正向引物的5'端添加HEX标签序列，反向引物不作修饰)、KASP反应液、以及DNA模板按照一定比例(表4)构建反应体系加入384孔PCR反应板。针对每个转化体检测使用的引物组合可参考表5，DNA模板量为：植物样品DNA为30ng～100ng，质粒为10^-3ng。加样完成之后，反应板需要封膜和离心。

表4：PCR反应体系的构建

反应体系组分	终浓度
		100μM某转化体正向引物	0.17μM
100μM某转化体反向引物	0.42μM
		100μM某内源基因正向引物	0.17μM
100μM某内源基因反向引物	0.42μM
		2xKASP反应液	1x
DNA	预先加入并烘干
		总体积	3μL

表5:转化体靶标序列和内源基因的引物组合

3.反应的进行：将加样完毕的反应板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

4.结果分析：反应完毕之后对产物进行荧光的扫描，扫描的结果会以散点图的形式出现，根据散点图判断该样品是否含有的转化体成分：图形的横坐标表示产物释放的FAM荧光，纵坐标表示产物释放的HEX荧光。如果从某样品的产物中检测出显著的FAM荧光和HEX荧光，则表明该样品含有相应的转化体成分(阳性)；如果从某样品仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到FAM荧光，则表明该样品不含有相应的转化体成分(阴性)；如果从某样品没有检测到显著的HEX荧光以及FAM荧光，则表明该样品或者实验操作有问题，需要重新检测，此时对应的数据点出现在NTC(无DNA模板)附近。

样品的检测结果如图所示(图2～图5)，将检测结果与样品本身的基因型信息进行比较，发现两者的一致性很高，8个引物组合检测结果的准确率都在99.7％以上(表6)。该实验结果显示使用本发明方法以及设计的引物对样品进行高通量转化体特异性检测时，检测结果的准确性和可靠性非常高。

表6:检测结果与样品基因型信息比较

应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.KASP在对产品进行转基因检测中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为玉米、油菜、水稻或大豆。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过KASP高通量地检测样品中是否含有转化体成分。

4.一种检测样品是否含有转化体成分的方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)设计转化体靶标序列的引物及内源基因的引物；(2)提取样品的DNA；(3)利用转化体靶标序列的引物、内源基因的引物进行检测，判断样品是否含有该转化体的成分。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，转化体靶标序列的引物为引物组1-8中的一组或多组。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，内源基因的引物为引物组9-12中的一组或多组。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)具体包括，内源基因检测；转化体成分检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过KASP反应进行检测。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：所述KASP反应的反应体系为连接了标签序列的转化体靶标序列的引物和内源基因的引物、DNA模板以及KASP反应液。

10.一种转基因产品检测试剂盒，包括引物组1-8中的一组或多组，及引物组9-12中的一组或多组。