CN107058539A - 用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用 - Google Patents

Abstract

用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用，其为泛素缀合酶E2、延长因子EF2和/或微管蛋白β‑tubulin 6的基因片段，其中，所述泛素缀合酶E2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述延长因子EF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述微管蛋白β‑tubulin 6基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该内参基因可以提高大麦相关基因(如低氮胁迫、抗旱胁迫)表达检测的准确性，表达量高，表达稳定，其Ct值在20‑30间。

Description

用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种大麦基因表达研究的内参基因及其应用。

背景技术

荧光定量PCR已经被广泛用于植物基因表达变化的研究，从而来揭示植物相关机理。

特别是近年来，全基因组水平的RNA测序技术的发展，利用该技术，可以大规模的发现表达差异基因，进而为相关机理研究服务，对于RNA测序的验证，也基本都是首先使用荧光定量PCR。而荧光定量PCR检测准确性的关键在于有一个或一组非常可靠的内参基因。

大麦是世界上第四大禾谷类作物，分布广、适应性好、耐逆性强，而且也是研究禾谷类作物的模式植物。尽管有一些内参基因已经被用于大麦耐低氮定量PCR分析，但是，并没有对其稳定性进行研究，如果直接把一些所谓的内参基因拿来用，在低氮处理的样品中可能并不稳定，因此，用这样的内参基因来研究目标基因的表达情况也未必准确。

尽管也有一些内参基因筛选的研究，但是，由于所基于的大麦基因型、实验条件、低氮胁迫程度并不一致，所以，筛选的内参基因也可能表现出不稳定或者不是最稳定、最佳的，因此，有必要对即将开展的大麦耐低氮基因表达研究筛选鉴定出稳定表达的内参基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用，该内参基因可以提高大麦相关基因(如低氮胁迫、抗旱胁迫)表达检测的准确性，表达量高，表达稳定，其Ct值在20-30间。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案；

用于大麦基因表达研究的内参基因，其为泛素缀合酶E2、延长因子EF2和/或微管蛋白β-tubulin 6的基因片段，其中，所述泛素缀合酶E2基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述延长因子EF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述微管蛋白β-tubulin 6基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的内参基因用于大麦的耐低氮基因表达研究。

本发明提供一种检测大麦耐低氮基因表达的方法，包括以下步骤：

1)低氮胁迫处理及取样

取培养至三叶一心期的大麦幼苗，置于低氮营养液中，进行低氮胁迫处理，分别取处理0小时、1～6小时和24小时后大麦的茎叶部分作为样品；

其中，所述的低氮营养液中，NH₄NO₃的浓度为0.1～1.0mM；

2)提取RNA、反转录合成cDNA

提取样品RNA，进行反转录，合成cDNA；

3)进行荧光定量PCR反应

以步骤2)中获得的cDNA为模板，以扩增上述内参基因的引物对为引物，进行荧光定量PCR扩增，进行定量PCR扩增，扩增产物与荧光染料结合，由荧光强弱反映扩增情况，获得Ct值；

4)表达分析

利用Ct值和各引物对的扩增效率，根据以下公式得出耐低氮基因的标准化相对表达量NRQ；

其中，NRQ(normalized relative quantification)即标准化相对表达量；E_t为目的基因扩增效率，E_r为内参基因扩增效率；C_{t目的基因}为目的基因Ct值，C_{t内参基因}为内参基因的Ct值；n为使用的内参基因个数及第n个内参基因。

进一步，所述步骤3)中，用于扩增内参基因的引物对如下：扩增泛素缀合酶E2基因片段的引物序列为：

F1：5'-TTTTTGGCCCTGATGATAGC-3'；

R1：5'-CCGAACTGTTGGTGGCTTAT-3'；

扩增延长因子EF2基因片段的引物序列为：

F2：5'-AATCAAGGACTCCGTTGTGG-3'；

R2：5'-CGTCACAGACCTCAAAGCAA-3'；

扩增微管蛋白β-tubulin 6基因片段的引物序列为：

F3：5'-TCCCGAACAATGTCAAGTCA-3'；

R3：5'-GTGGAGTTGCCAATGAAGGT-3'。

又进一步，PCR扩增的反应体系为：各引物对中，每条引物序列的浓度为300-800nM，cDNA模板浓度为1-10ng/μL。

优选地，所述的PCR扩增反应体系中，各引物对中，每条引物序列的浓度为600nM。

进一步，所述步骤3)中，PCR扩增反应程序为：50℃2分钟，95℃2分钟，40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。

又优选地，步骤1)所述的低氮营养液中，NH₄NO₃的浓度为0.24mM。

所谓的低氮胁迫，就是比正常供氮的氮源低并且发现植物的生长明显受到抑制即为低氮胁迫，氮源的形式可以不同，浓度可以不同，本发明利用大麦耐低氮的转录组分析数据，选择出3个大麦内参基因E2、EF2和β-tubulin 6，这3个基因在对应的低氮胁迫样品中表现为表达无差异。

在PCR反应过程中，反应体系里含有可以结合双链DNA并且能够发光的荧光标记物，在60℃1分钟阶段，扩增产物会形成双链DNA，这样就会产生荧光，双链DNA越多，荧光强度就越强，在荧光信号呈现指数变化阶段时读取Ct值，利用本发明的内参基因检测大麦相关基因检测时Ct值为20～30。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

1)本发明利用转录组测序分析结果，结合内参基因筛选软件筛选出针对大麦合适的内参基因，利用筛选出的内参基因，可以提高检测大麦相关基因(如低氮胁迫、抗旱胁迫等等)表达的准确性。

2)本发明在检测大麦耐低氮基因表达情况时，在NH₄NO₃的浓度为0.1～1.0mM低氮营养液中，对不同基因型的大麦进行低氮胁迫处理，进行荧光定量PCR反应时，反应体系中cDNA模板浓度及引物浓度的设置，使Ct值不会太小或太大，同时保证不出现非特异扩增，节省模板cDNA的用量。

附图说明

图1为本发明实施例1中E2内参基因的熔解曲线。

图2为本发明实施例1中EF2内参基因的熔解曲线。

图3为本发明实施例1中β-tubulin 6内参基因的熔解曲线。

图4为本发明实施例2中各内参基因引物的定量PCR扩增产物。

图5为本发明实施例2中利用geNorm软件分析平均表达稳定M值的结果。

图6为本发明实施例2中内参基因配对变异分析结果。

图7为本发明实施例3中PR1基因在大麦基因型BI-04中以E2和β-tubulin 6为内参基因计算的表达情况。

图8为本发明实施例3在大麦基因型BI-04中根据转录组测序中PR1基因的转录本的个数计算的表达情况。

图9为为本发明实施例3中PR1基因在大麦基因型BI-45中以E2和β-tubulin 6为内参基因计算的表达情况。

图10为本发明实施例3在大麦基因型BI-45中根据转录组测序中PR1基因的转录本的个数计算的表达情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1大麦内参基因的获得

本发明利用大麦耐低氮相关转录组测序分析结果，选择出3个表达稳定的大麦内参基因E2、EF2和β-tubulin 6，其中，所述泛素缀合酶E2基因片段的基因序列来源为MLOC_9934.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述延长因子EF2基因片段的基因序列来源为MLOC_15661.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述微管蛋白β-tubulin 6基因片段的基因序列来源MLOC_74587.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

通过Primer 3软件(http://primer3.wi.mit.edu/)设计引物，引物信息如下：

扩增泛素缀合酶E2基因片段的引物序列为：

F1：5'-TTTTTGGCCCTGATGATAGC-3'；

R1：5'-CCGAACTGTTGGTGGCTTAT-3'；

扩增延长因子EF2基因片段的引物序列为：

F2：5'-AATCAAGGACTCCGTTGTGG-3'；

R2：5'-CGTCACAGACCTCAAAGCAA-3'；

扩增微管蛋白β-tubulin 6基因片段的引物序列为：

F3：5'-TCCCGAACAATGTCAAGTCA-3'；

R3：5'-GTGGAGTTGCCAATGAAGGT-3'。

之后利用定量PCR熔解曲线和琼脂糖电泳(2％琼脂糖凝胶，100V，30分钟)检验引物的特异性，结果参见图1-3，由图1-3可见，每对引物的扩增产物熔解曲线只有1个峰，说明只有1个扩增产物，并且，琼脂糖凝胶电泳对其扩增产物检测也只有1条带，即只有1个产物。

以上结果表明，上述内参基因的引物特异性较好，可用于后续定量PCR实验。

实施例2利用现有的内参基因对稳定性及准确性进行验证

1.植物生长和低氮胁迫处理

取2种基因型(BI-04和BI-45)的大麦种子若干，用1％NaClO消毒30分钟，然后用清水冲洗3遍，再用清水浸种4个小时，然后取出种子催芽，过夜。取出芽一致的种子直接播种于含有蛭石的盆钵里，待一叶一心期时，把幼苗包裹上海绵条固定在钻有孔的泡沫板上，把泡沫板转入含有营养液的培养箱内继续生长，营养液含有114.3mg/L(1.43mM)的NH₄NO₃，50.4mg/L的NaH₂PO₄·2H₂O，89.3mg/L的K₂SO₄，110.8mg/L的CaCl₂，405.0mg/L的MgSO₄，1.6mg/L的MnSO₄·H2O，18.8μg/L的Na₂MoO₄·H₂O，1.2mg/L的H₃BO₃，43.8μg/L的ZnSO₄·7H₂O，38.8μg/L的CuSO₄·5H₂O，15.0mg/L的柠檬酸铁。待三叶一心期时，对大麦幼苗进行低氮胁迫，即把上述营养液中的NH₄NO₃降低到19.21mg/L(0.24mM)。

整个生长期，营养液的pH保持在6.2左右，每天光照为16小时，温度为20℃左右，湿度为70％。在低氮胁迫处理0小时、1小时、24小时分别取两个大麦基因型地上部作为样品，液氮冷冻后保存于-80℃超低温冰箱，每个样品3次生物学重复。

2.提取RNA和反转录cDNA

使用Invitrogen的Trizol试剂完成RNA的提取，具体程序参考试剂盒说明书。

然后使用Promega的RQ1DNA酶试剂盒进行DNA处理，再使用TaKaRa的PrimeScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒进行cDNA的合成，具体程序参考试剂盒说明书，每个反转录反应为20μL，使用1μg RNA进行。

对合成获得的cDNA样品用一对跨内含子设计的引物来进行PCR，然后对DNA去除情况进行验证，同时来确定cDNA的合成情况，根据实验需要来调整cDNA的浓度。

3.荧光定量PCR反应

分别利用现有的6个内参基因(snorna14、snorna23、ADP、GAPDH-1、GAPDH-2、Actin)和实施例1的3个内参基因(E2、EF2和β-tubulin 6)与各自对应的引物进行荧光定量PCR反应，在7500Fast定量PCR平台上进行，并且使用PowerUp荧光混合液(SYBR GreenMaster Mix)来进行定量PCR反应，获得各内参基因对应的Ct值，使用LinReg软件计算每对引物的扩增效率，相关成分及程序参考说明书，荧光定量PCR反应中的引物及扩增效率参见表1。

反应体系为：10μL的总反应体系中，荧光混合液2×PowerUp SYBR Green MasterMix 5μL，水3.4μL，10μM引物混合物(包含正反引物)0.6μL，稀释10倍的cDNA 1μL。

反应程序为：50℃2分钟，95℃2分钟，40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。

4.分析验证

使用Office Excel 2003来整理数据，使用geNorm、NormFinder和Bestkeeper三种内参基因筛选软件对内参基因进行分析比较，相关使用参考各自说明书。

1)使用geNorm软件对候选内参基因进行分析

geNorm软件分析结果参见表2和图5，图5中，纵坐标为M值，横坐标为内参基因，从左往右，表示内参基因越来越稳定，对应的M值也是由大变小，9个内参基因的M值都小于1.5，表明这些内参基因都比较稳定，其中，内参基因β-tubulin 6和GAPDH-2的M值最低为0.129，说明这两个内参基因最稳定，而相对最不稳定的内参基因snorna14的M值最高，为0.306。

进一步，通过进行内参基因配对变异分析来确定内参基因的配合使用个数，一般内参基因会同时选用3个，比如V3/4表示3个内参基因的基础上再增加一个是否必要，若配对变异系数小于判定值0.15，就表明不必要，参见图6，纵坐标为配对变异系数，横坐标为基因个数，由图6中可知，V3/4对应的配对变异系数为0.044(<0.15)，就表明不必要，以此类推，而本发明中，V2/3对应的配对变异系数为0.059也小于0.15，表明在大麦低氮胁迫中，使用2个内参基因就足够了，稳定性符合内参基因的使用要求。

2)使用NormFinder软件对候选内参基因进行分析

NormFinder软件分析结果参见表3，由表3可见，内参基因ADP的稳定值(Stabilityvalue，SV)最低，为0.047，表明该内参基因最稳定，而snorna14的SV值最高，为0.244，表明它们作为大麦低氮胁迫样品内参基因相对最不稳定，这和geNorm软件分析的结果一致。

3)使用BestKeeper软件对候选内参基因进行分析

BestKeeper软件分析结果参见表4，由表4可见，所有的候选内参基因CP值的标准差都小于1，表明所有这些内参基因表达都相对比较稳定，这和geNorm软件分析的结果一致。其中，内参基因E2对应的标准差最小，为0.38，表明该内参基因相对最稳定，而内参基因snorna23对应的标准差最高，为0.59，这表明该内参基因相对最不稳定。

对9个内参基因的稳定性进行排序，参见表5，由表5可以看出，本发明的三个内参基因均较为稳定，其中geNorm软件分析排序中β-tubulin 6进入前3，NormFinder和BestKeeper软件分析排序中β-tubulin 6和E2两个进入了前3，因此新扩充的大麦内参基因不仅增加了大麦内参基因的选择范围，而且还使得大麦的基因表达研究更加准确。

实施例3利用内参基因对大麦低氮胁迫基因进行检测

一种检测大麦低氮胁迫下病程相关蛋白基因PR1(GenBank:Z21494.1)表达的方法，包括以下步骤：

1)低氮胁迫处理及取样

分别取两种大麦基因型(BI-04和BI-45)培养至三叶一心期的大麦幼苗，置于低氮营养液中，进行低氮胁迫处理，分别取处理0小时、1～6小时和24小时后大麦的茎叶部分作为样品；

其中，所述的低氮营养液中，NH₄NO₃的浓度为0.1～1.0mM；

2)提取RNA、反转录合成cDNA

使用Invitrogen的Trizol试剂完成RNA的提取，具体程序参考试剂盒说明书。

然后使用Promega的RQ1DNA酶试剂盒进行DNA处理，再使用TaKaRa的PrimeScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒进行cDNA的合成，具体程序参考试剂盒说明书，每个反转录反应为20μL，使用1μg RNA进行。

对合成获得的cDNA样品用一对跨内含子设计的引物来进行PCR，然后对DNA处理进行验证，同时来确定cDNA的合成情况，根据实验需要来调整cDNA的浓度。

3)进行荧光定量PCR反应

以步骤2)中获得的cDNA为模板，以扩增泛素缀合酶E2和微管蛋白β-tubulin 6的引物对(参见表1)、以及扩增大麦病程相关蛋白基因PR1的引物对为引物，进行PCR扩增，分别获得Ct值；

其中，扩增大麦病程相关蛋白基因PR1的引物序列为：

F10：5'-GGACTACGACTACGGCTCCA-3'；

R10：5'-GGCTCGTAGTTGCAGGTGAT-3'；

其扩增效率为1.767。

反应体系为：10μL的总反应体系中，荧光混合液2×PowerUp SYBR Green MasterMix 5μL，水3.4μL，10μM引物混合物(包含正反引物)0.6μL，稀释10倍的cDNA 1μL。

反应程序为：50℃2分钟，95℃2分钟，40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。

4)表达分析

利用Ct值和扩增效率(参见表1)，根据上述NRQ计算公式得出耐低氮基因的标准化相对表达量NRQ，参见图7-10。

由图7-10可以看出，基于内参基因的定量PCR分析表明，低氮胁迫下PR1基因在BI-04中是上调表达的，尽管相对于0小时表达变化的倍数不完全相同，但其趋势和转录组测序的结果相一致；同样，低氮胁迫下PR1基因在BI-45中是下调表达的，这也和转录组测序结果非常相似。

可见，本发明提供的泛素缀合酶E2和微管蛋白β-tubulin 6内参基因，通过定量PCR检测能够准确反映低氮胁迫下目标基因的变化趋势。

<110> 上海市农业科学院

<120> 用于大麦基因表达研究的内参基因及其应用

<130> 1711110

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID NO.1

<211> 939

<212> DNA

<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)

<400> 1

tatttggatc acttgcgtct tgcgtgcgtg aatcgaccag tggctggcgg tgttgtcatc 60

gctgactttc ctcgactctc ctgtccaatc cttttgccct cctctctaca tagccccctc 120

tccatccccg acctgccctt ccatcgccca ggctgaccta aagccgtcca ccccgtcgtc 180

tccatgctct aggacaacga gcacgcggga gcctacatct ccaccaccac cgccggccgc 240

atctcagata actttgagga tgtcgactcc ttcaaggaag aggctgatga gggacttcaa 300

gcggctgatg caggaccctc ctgcgggcat aagcggggcg ccgcaggaca acaacataat 360

gctgtggaat gctgtgattt ttggccctga tgatagcccg tgggacggag gtacgtttaa 420

gctgactctc cagttcaatg aagaatatcc taataagcca ccaacagttc ggtttatttc 480

tcggatgttt caccctaaca tttatgctga tggaagcata tgcttagata tcctacagaa 540

tcagtggagc ccaatatatg atgtagctgc tatacttaca tccatccagt cgctgctgtg 600

tgatcctaac ccgaattcgc ctgctaactc agaagctgcc cgcatgttca gtgagaataa 660

gcgagagtac aaccgcaaag tgcgggagat tgtcgagcag agctggacgg cagactaatg 720

agttgagttc accatgcgtt ctcatgcggt ctctgtatca aaatgcttgt aactgaaatg 780

gttgaactcc gtctttacca cctgaaacag caacttgctt tgttgcatca tttggctgga 840

cggttggaaa tgcctatact gtctgtatgt ggaatacaaa cattttgtaa cgtcctcttg 900

tgtgagtttg taagttgtat cacatcacat tgactctga 939

<210> SEQ ID NO.2

<211> 2968

<212> DNA

<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)

<400> 2

ggacggcgtc gctcgccaca cagccgcacg gacagccacg attcgctcgc ctttcccgcg 60

gcgccgccac tacgcagcca ataaaacccc ccgcacggcc gcaagccccg gtcgcccaca 120

gcgcacaggc cacaggggga tcgcctaggt ccttctcctg cgccttcgct cggcgccgtc 180

cagggctgtc ctcatctcat tcctcctgaa tcctgatagc gagggggatc ctcaaggaat 240

ttatatttgt agtgtgataa tcaaaagcag tcaagatggt gaaattcaca gtagaaggac 300

tccgcatcat catggacaag caaaataata ttcgtaacat gtctgttatt gctcatgtcg 360

accatggaaa gtctacgctt actgattctc tggtggcagc tgccgggatt attgcacaag 420

aagttgcagg tgacgtccgc atgactgata ctcgtgcaga tgaagcagag cgtggtatca 480

caatcaaatc cacgggtata tctctttttt atgagatgac tgaggaatca ctcagggctt 540

ataagggcga gagagatggc aatgaatacc tgatcaacct tatagattct cctgggcacg 600

ttgatttctc ttcggaagtc acagctgctc ttcgtattac tgatggtgct ttggtggtgg 660

ttgactgtat tgagggtgta tgtgtgcaaa ctgagactgt gcttcgccaa gcccttggtg 720

agaggattag gcctgtcctt accgtgaaca agatggacag atgcttcctt gagcttcagg 780

ttgacggcga ggaagcttac cagactttct cccgcgtcat tgagaacgcc aatgtcatta 840

tggcaacata tgaagatgca aaacttggtg atgtccaagt ctacccagag aagggaactg 900

ttgctttctc ggctggttta cacggatggg catttactct cacgaacttt gctaagatgt 960

atgcctccaa gtttggggtt gatgaaacta aaatgatgga gaggctttgg ggtgagaact 1020

tctttgaccc aagcacaaaa aagtggacca acaagagcac tggctctcca acttgcaaga 1080

gaggttttgt tcagttctgc tatgatccaa tcaagcaaat cattaacacc tgcatgaatg 1140

accagaagga taaattgtgg cccatgttac acaagcttgg tgtgaccatg aagactgatg 1200

agaaggagct aatgggcaag cctttaatga aacgtgttat gcaaacttgg ctgccagcaa 1260

gtactgctct acttgagatg atgatattcc acctcccttc tccttcgaaa gcacaaaagt 1320

atcgtgtaga gaacttgtat gagggccccc ttgatgatgt ctatgcaact gctataagaa 1380

actgtgaccc agaaggccct cttatgctgt atgtttccaa gatgattcca gcatctgaca 1440

agggcaggtt ctttgcgttt gggcgtgtct tctccgggag aattgcaact ggcatgaagg 1500

tccggatcat gggcccaaac tatgttcctg gacagaagaa ggatctgtac atgaagagtg 1560

tccagcgtac agtcatttgg atgggaaaga agcaagagtc tgttgaggat gttccttgtg 1620

gtaacactgt tgctatggtt ggcttggatc agtacatcac aaagaatgct accctgacaa 1680

acgagaagga ggttgatgca tgcccaatca gagcaatgaa attttccgta tcccctgttg 1740

tacgcgttgc tgtccagtgc aaggttgcct ctgatcttcc caaacttgtg gaaggcttga 1800

agcgcctggc gaagtctgat cctatggttc tctgttccat ggaagagtct ggcgagcata 1860

tcattgctgg agctggagag ctgcaccttg aaatttgctt gaaggatctg caggaggatt 1920

tcatgggtgg tgctgagatt attgtttccc ctcctgttgt ctctttccgc gagaccgttc 1980

ttgagaagtc ctgccgtacc gtgatgagca agtccccgaa caagcataac cgtctctaca 2040

tggaggctcg ccccatggag gaaggactgg ctgaggccat tgacgatggt cgcatcggcc 2100

cacgtgatga tcccaaggtg cgctccaagg tcctgtccga ggagtttggc tgggacaagg 2160

atctcgccaa gaagatttgg tgtttcggac ccgaaaccac tgggccgaat atggttgttg 2220

atatgtgcaa gggagtgcag tatctgaacg aaatcaagga ctccgttgtg gccggcttcc 2280

agtgggcgtc gaaagaaggg gcattggcag aagaaaacat gcgtggcatt tgctttgagg 2340

tctgtgacgt cgtcctccac acagatgcta ttcacagggg tggcggtcag gtcatcccga 2400

cggctagaag ggtcatttat gcttctcagc tcacggctaa gccaaggtta ctcgagcctg 2460

tatacctagt ggagatccag gcacctgaga atgcacttgg tggcatctat ggcgttctca 2520

accagaagag agggcatgtg tttgaggaga tgcagaggcc tggtacccca ctttacaaca 2580

tcaaggctta cctacctgtt atcgagtcct ttggtttctc cagcacactt cgggctgcga 2640

cgtctggcca ggccttcccg cagtgtgtgt ttgatcactg ggacatgatg tctgctgatc 2700

ctttggaggc aggatcacag gcggcgcagc tggtcttgga tatccgcaag aggaaggggt 2760

tgaaagaaca gatgacccct ctctccgaat tcgaggacaa gctctaagct tttgctccca 2820

tgtgatctat gatctcgccc agtttttgat ctatacttgg tctgttgtca ggagattagt 2880

actctttttc gtattccagt tccttgggtt gtcatgtact gagcctattt cggtgtctta 2940

tcagatttaa caaataattt accttaga 2968

<210> SEQ ID NO.3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)

<400> 3

caccccaccc caatccccat cccctctcac tcccccacgc gcgacgcgag cgctgcagtc 60

ctctccgcag ggaggcgaag atgagggaga tcctgcacat ccagggcggg cagtgcggga 120

accagatcgg gtccaagttc tgggaggtgg tgtgcgacga gcacggcatc gaccccacgg 180

ggaggtacgt cggcacgtcc gacctgcagc tggagcgcgt caacgtctac tacaacgagg 240

cctcatgcgg ccgcttcgtg ccgcgcgccg tgctcatgga tctcgagccc ggcaccatgg 300

actccgttcg cacggggccg tacggccaga tcttccgccc cgacaacttc gtcttcggcc 360

agtccggcgc cggcaacaac tgggccaagg gccactacac cgagggcgcg gagctcatcg 420

actccgtcct cgacgtcgtc cgcaaggagg ctgagaactg cgactgcctc caaggcttcc 480

aggtgtgcca ctccctgggc gggggcaccg gttccggcat gggcacgctg ctgatttcca 540

agatcaggga ggagtaccct gaccggatga tgctcacctt ctccgtgttc ccatccccca 600

aggtgtctga cacggtggtc gagccctaca acgccaccct ctcggttcac cagctggtgg 660

agaacgccga cgagtgcatg gtgctggaca acgaggcgct ctacgacatc tgcttccgca 720

ccctgaagct gaccacacct agctttggtg acctgaatca tttgatcagt gccaccatga 780

gcggtgtcac ctgctgcctt cgcttcccag gacagctgaa ctcagacctc cgcaagcttg 840

cagtcaacct gatccccttc ccgcgcctcc acttcttcat ggtgggcttt gcgccgctca 900

catctcgtgg atcgcagatg taccgctccc tcactgtccc agaactcaca cagcaaatgt 960

gggactcgaa gaacatgatg tgtgctgccg acccacgcca tggccgctac ctcacagcct 1020

cagccatgtt ccgtggcaag atgagcacca aggaggttga tgagcagatg atcaacgtgc 1080

agaacaagaa ctcttcctac ttcgtggagt ggatcccgaa caatgtcaag tcaagcgtgt 1140

gtgacatccc accacgtggc ctctccatgg cgtccacctt cattggcaac tccacctcca 1200

tccaggagat gttccggcgt gtgagcgagc agttcaccgc catgttcagg aggaaggctt 1260

tcttgcattg gtacactggt gaggggatgg acgagatgga gttcactgag gccgagagca 1320

acatgaatga cctggtctct gagtaccagc agtaccagga cgccactgct gacgaggagg 1380

gcgagtacga ggaagaggac gagctggagc aggagtaaga tcggtgacaa ttgcatctcc 1440

atttatgtgg tattgtgctt ttcgtacaac tggagcttgt tttcgtaggg actagagggt 1500

accatggcta caaactatgc tgcttgtttg tgtgtcttgg catgtgttgg atttgtactg 1560

cgttcgtatg taggcatgtt cactcgatgc tatgtttctt tgcgtgaatt attttatgtg 1620

agg 1623

Claims (9)

1.用于大麦基因表达研究的内参基因，其为泛素缀合酶E2、延长因子EF2和/或微管蛋白β-tubulin 6的基因片段，其中，所述泛素缀合酶E2基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述延长因子EF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述微管蛋白β-tubulin 6基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的内参基因用于大麦的耐低氮基因表达研究。

3.一种检测大麦耐低氮基因表达的方法，包括以下步骤：

1)低氮胁迫处理及取样

取培养至三叶一心期的大麦幼苗，置于低氮营养液中，进行低氮胁迫处理，分别取处理0小时、1～6小时和24小时后大麦的茎叶部分作为样品；

其中，所述的低氮营养液中，NH₄NO₃的浓度为0.1～1.0mM；

2)提取RNA、反转录合成cDNA

提取样品RNA，进行反转录，合成cDNA；

3)进行荧光定量PCR反应

以步骤2)中获得的cDNA为模板，以扩增权利要求1所述内参基因的引物对和扩增目的基因的引物对，进行定量PCR扩增，扩增产物与荧光染料结合，由荧光强弱反映扩增情况，获得Ct值；

4)表达分析

利用Ct值和各引物对的扩增效率，根据以下公式得出耐低氮基因的标准化相对表达量NRQ；

其中，NRQ即标准化相对表达量；E_t为目的基因扩增效率，E_r为内参基因扩增效率；C_{t目的基因}为目的基因Ct值，C_{t内参基因}为内参基因的Ct值；n为使用的内参基因个数及第n个内参基因。

4.根据权利要求3所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，

所述内参基因的使用个数n为2。

5.根据权利要求3所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，

所述步骤3)中，用于扩增权利要求1所述内参基因的引物对如下：

扩增泛素缀合酶E2基因片段的引物序列为：

F1：5'-TTTTTGGCCCTGATGATAGC-3'；

R1：5'-CCGAACTGTTGGTGGCTTAT-3'；

或者扩增延长因子EF2基因片段的引物序列为：

F2：5'-AATCAAGGACTCCGTTGTGG-3'；

R2：5'-CGTCACAGACCTCAAAGCAA-3'；

或者扩增微管蛋白β-tubulin 6基因片段的引物序列为：

F3：5'-TCCCGAACAATGTCAAGTCA-3'；

R3：5'-GTGGAGTTGCCAATGAAGGT-3'。

6.根据权利要求3所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增的反应体系中：各引物对中，每条引物序列的浓度为300-800nM，cDNA模板浓度为1～10ng/μL。

7.根据权利要求3所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系中，各引物对中，每条引物序列的浓度为600nM。

8.根据权利要求5或6所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增反应程序为：50℃2分钟，95℃2分钟，40个循环的95℃15秒和60℃1分钟。

9.根据权利要求3-7任一项所述检测大麦耐低氮基因表达的方法，其特征在于，步骤1)所述的低氮营养液中，NH₄NO₃的浓度为0.24mM。