JP6705171B2 - 小型ｒｎａの発現量の補正方法及び装置 - Google Patents
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Description
本発明は、複数の検体に含まれる標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量を補正する方法及び当該発現量を補正する装置に関する。
non-coding RNA（ncRNA）とは、タンパク質をコードしないRNAの総称であり、ハウスキーピングRNAと調節系のRNAとに大別される。様々な長さのncRNAがあり、特に200塩基未満の分子は、小型RNA（small RNA）と呼ばれている。
ハウスキーピングRNAとしては、リボゾームRNA（rRNA）、運搬RNA（tRNA）、スプライシングに関与する核内低分子RNA（snRNA）、rRNAの修飾に関与する核小体低分子RNA（snoRNA）等が知られている。
調節系RNAについては、生体機能の解明に重要な機能を果たしている因子として、近年特に注目を集めているものであり、遺伝子発現やRNAの細胞内分布を調節し遺伝子発現抑制機構に重要な役割を担っていることが最近になって明らかにされつつある。この調節系RNAが機能する遺伝子発現抑制機構は、RNA干渉（RNAi）と呼ばれ、1988年に線虫を用いた実験で明らかにされ、その後、ショウジョウバエや哺乳類細胞でも同様の機構の存在が明らかとなった。この調節系RNAとしてのncRNAは、鎖長がおよそ20〜25塩基であり、その作用機序は、マイクロRNA（miRNA）による翻訳抑制と、small interference RNA（siRNA）による標的mRNAの切断及び標的DNA領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシングとに大別される。
miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAを標的（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは15〜25塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。
近年、miRNAは細胞内のみならず、細胞を含まない検体（生体試料）である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その発現量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。miRNAは2014年6月現在、ヒトで2500種以上が存在し（miRBase Release 20）、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAが血清・血漿中で発現を同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されている。
DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う場合には、検体や実験者、実験条件により、得られる測定値（データ）に誤差が生じることはよく知られている。そのため、誤差を補正するための測定値の補正方法が考案されている。補正には、いかなる検体であっても、複数の遺伝子の発現量の測定値を一塊とし、遺伝子発現データ群としてとらえた場合には、発現量に差がないという原理を前提とした方法が通常よく用いられており、グローバルノーマライゼーション法、quantile法、lowess法、75 percentile法などである。ただし、これらの補正方法は、ある一定の数以上網羅的に遺伝子を検出した場合にしか使用できないという欠点がある。
一方、検体間で発現量が同一である特定の遺伝子（ベータアクチンやGAPDHなど）に着目し、その遺伝子の測定値が一定になるように、検体ごとにデータを補正する方法も行われている。
小型RNAをDNAマイクロアレイによって解析する場合にも、上記のような遺伝子発現解析で用いられるグローバルノーマライゼーション法、quantile法、lowess法、75 percentile法といった補正方法が使われているが、特定の遺伝子しか検出しない場合にはこれらの方法は使用できない。その一方で特定の遺伝子の発現量が一定になるように補正する方法として、検体で発現している小型RNAのうち、ハウスキーピングRNA（U1snoRNA、U2snoRNA、U3snoRNA、U4snoRNA、U5snoRNA、U6snoRNA、5SrRNA、5.8SrRNA）を用いて補正する方法が提案されている（特許文献１，特許文献２）。
特許文献１、特許文献２では、小型RNAであるmiRNAを検出する際、同時に検出した5SrRNAの検出値が全ての検体で一定となるように、miRNAの検出結果を補正しているが、これらが検体間で一定量発現しているという保証は無い
また、特許文献３では、小型RNAであるmiRNAを検出する際、同時にmRNAを検出し、その代表値でmiRNAの検出結果を補正しているが、この方法も検出したmRNAの正規分布が保証されるある一定の数以上の数のmRNAを検出する場合に適用できる方法である。
このため、実験間の遺伝子発現量の誤差を補正するために、核酸である標準物質を実験の工程で使用し、その検出した存在量を使用して実験間の誤差を補正することが提案されている（特許文献４〜６）。特許文献４、５は、核酸である標準物質あるいはその標準物質を検出するプローブ核酸の配列や設計方法を提示し、その増幅工程や検出工程での精度は示されており、これらにより検出方法の性能の評価を行うことはできるが、実際に検体からの核酸の抽出工程を含む実験間の誤差の補正を行うことは示していない。また、特許文献６も検体中の遺伝子発現の検出値の誤差を補正するための核酸である標準物質の配列を示しているが、この配列を核酸の増幅工程から使用しており、増幅工程の実験間の誤差を補正することができるだけである。
つまり、上記の特許文献４〜６で示されている方法は、検体から抽出された核酸が十分量有り、使用する核酸を精度良く定量できる場合に限り、核酸の増幅や検出を含めた測定工程の精度の評価や誤差の補正が可能であるが、実際の実験間の測定結果の補正を行う場合、特に微量の検体を扱う場合や検体として体液を取り扱う場合には、抽出される標的小型RNA量が非常に微量となり、この小型RNA量を精度良く測定することができないため、実質的にこのような方法で補正を行うことが不可能となる。このため、小型RNAの検出工程だけでなく、検体からの抽出工程も含めた実験間の誤差を補正することが非常に重要となる。
このため、検体からの抽出工程も含めた実験間の誤差を評価・補正する方法として、標準物質を使用する方法が検討されてきており、これまで、小型RNAと同様の塩基長の核酸である標準物質を使用して補正を行うことが検討されてきた。例えば、非特許文献１で示されているようなmiRNAと同様の塩基長である20塩基程度の短いRNAを標準物質として使用し、これを検体に一定量投入して抽出を行い、各実験の抽出工程における標的小型RNAの抽出工程の誤差を補正する方法が提案されている。
Nobuyuki Kosaka Edit.,「Circulating MicroRNAs : Methods and Protocols （Methods in Molecular Biology）」, p1-p10, Human Press, New York（2013）
検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析する際は、検体間での実験条件の誤差、特に検体から核酸を抽出する工程における抽出効率の差を補正する必要がある。これまでよく用いられてきた方法として、グローバルノーマライゼーションやハウスキーピングRNAを使用する方法があるが、上記の通り小型RNAについては、網羅的に数多くの小型RNAを検出する必要がある、検体間で一定量の発現を保証するハウスキーピングRNAが存在しない等欠点があり、比較解析において有効であるとはいえない。
また、標準物質を用いる補正方法については、上記の通り、標的とする小型RNAと同様の塩基長の核酸である標準物質を使用して補正を行うことが検討されてきたが、実際にこれらの小型RNAと同様の塩基長のRNAを標準物質として使用すると、特に検体として体液を使用する場合には、検体の各種条件やそれに含まれる各種夾雑物の影響により、検体からの標準物質の抽出効率が安定せず、結果として測定値が安定しなくなり、精度が保証できないため、実験間の測定結果の補正には使用できなかった。
以上のように、これまでには、各検体から抽出された標的小型RNAの発現量を比較解析するための、正確に検体間における発現量の測定値を補正することができる、標準物質を利用する有効な補正方法は無かった。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、複数の検体に含まれる標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正方法において、複数の検体一定量に対して核酸長が小型RNAよりも相当長い200塩基以上の核酸である標準物質を検体に加え、検体から核酸の抽出を行い、抽出された各標的小型RNAの発現量とともに標準物質の存在量の測定を行い、標準物質の存在量の測定値を用いて補正を行うことにより、従来より正確に、各検体間における発現量の補正を行うことができることを見出し、以下の発明を完成した。
(１) 複数の検体における標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正方法であって、
前記複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して核酸試料を得る抽出工程；
抽出された各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程；
を含む、補正方法。
(２) 標準物質の核酸長が200塩基以上1200塩基以下である(１)に記載の補正方法。
(３) ２種類以上の標準物質を用いる、(１)又は(２)に記載の補正方法。
(４) 検体が体液由来検体である(１)ないし(３)のいずれか１項に記載の補正方法。
(５) 標的小型RNAがmiRNAである(１)ないし(４)のいずれか１項に記載の補正方法。
(６) 前記抽出工程における核酸試料の抽出が、フェノール・クロロホルム法により行なわれる、(１)ないし(５)のいずれか１項に記載の補正方法。
(７) 前記測定工程が、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値として得ることを含む、(１)ないし(６)のいずれか１項に記載の補正方法。
(８) 前記代表値取得工程で取得される代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１)ないし(７)のいずれか１項に記載の補正方法。
(９) 前記基準値は、標準物質の抽出量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の検体から任意に選択された第１の検体について取得された標準物質抽出量の代表値である、(１)ないし(８)のいずれか１項に記載の補正方法。
(１０) 前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、(１)ないし(９)のいずれか１項に記載の方法。
(１１) 複数の検体における標的小型RNAの発現量を比較解析するために発現量を補正する装置であって、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段と；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む、前記装置。
(１２) 前記代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１１)に記載の装置。
(１３) 標的小型RNAがmiRNAである(１１)又は(１２)に記載の装置。
(１４) 前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、(１１)ないし(１３)のいずれか１項に記載の装置。
(１５) 前記記憶手段に記憶される、複数の検体における標的小型RNAの発現量及び標準物質抽出量の測定値は、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定した値である、(１１)ないし(１４)のいずれか１項に記載の装置。
(１６) 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターに、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて、各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；及び
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程
を実行させるためのプログラム。
(１７) 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターを、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；及び
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段
として機能させるためのプログラム。
(１８) (１６)又は(１７)に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
(１９) 複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブと、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブとが固定化された支持体を含む、小型RNA発現解析用チップ。
前記複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して核酸試料を得る抽出工程；
抽出された各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程；
を含む、補正方法。
(２) 標準物質の核酸長が200塩基以上1200塩基以下である(１)に記載の補正方法。
(３) ２種類以上の標準物質を用いる、(１)又は(２)に記載の補正方法。
(４) 検体が体液由来検体である(１)ないし(３)のいずれか１項に記載の補正方法。
(５) 標的小型RNAがmiRNAである(１)ないし(４)のいずれか１項に記載の補正方法。
(６) 前記抽出工程における核酸試料の抽出が、フェノール・クロロホルム法により行なわれる、(１)ないし(５)のいずれか１項に記載の補正方法。
(７) 前記測定工程が、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値として得ることを含む、(１)ないし(６)のいずれか１項に記載の補正方法。
(８) 前記代表値取得工程で取得される代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１)ないし(７)のいずれか１項に記載の補正方法。
(９) 前記基準値は、標準物質の抽出量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の検体から任意に選択された第１の検体について取得された標準物質抽出量の代表値である、(１)ないし(８)のいずれか１項に記載の補正方法。
(１０) 前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、(１)ないし(９)のいずれか１項に記載の方法。
(１１) 複数の検体における標的小型RNAの発現量を比較解析するために発現量を補正する装置であって、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段と；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む、前記装置。
(１２) 前記代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１１)に記載の装置。
(１３) 標的小型RNAがmiRNAである(１１)又は(１２)に記載の装置。
(１４) 前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、(１１)ないし(１３)のいずれか１項に記載の装置。
(１５) 前記記憶手段に記憶される、複数の検体における標的小型RNAの発現量及び標準物質抽出量の測定値は、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定した値である、(１１)ないし(１４)のいずれか１項に記載の装置。
(１６) 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターに、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて、各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；及び
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程
を実行させるためのプログラム。
(１７) 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターを、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；及び
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段
として機能させるためのプログラム。
(１８) (１６)又は(１７)に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
(１９) 複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブと、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブとが固定化された支持体を含む、小型RNA発現解析用チップ。
本発明によれば、検体から抽出された小型RNAの発現量を測定し、検体間で小型RNA発現量を比較する際に、従来よりも正確に標的小型RNA発現量を補正することができる。これにより、検体間での標的小型RNAの比較解析がより正確に実施できるようになる。
本発明でいう標準物質は、抽出工程から測定工程において、標的小型RNAを含む検体に安定的に共存させ、目的とする小型RNAの発現量の測定と共にその標準物質の存在量の測定を行うことにより、複数の検体の測定間における標的小型RNAの発現量の測定値の変動（測定間でのばらつき又は誤差）を補正するための基準を得るために用いられる物質である。すなわち、標準物質の存在量を基準として、複数の検体の測定間での標的小型RNAの発現量の測定値を補正することができる。
まず、本発明標準物質を用いた標的小型RNAの発現量の補正方法の概念について、図１に基づいて説明する。
図１では、検体から抽出した核酸を標識し、複数種類の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ（以下、「小型RNA捕捉プローブ」ともいう。）及び標準物質を捕捉するためのプローブ（以下、「標準物質捕捉プローブ」ともいう。）が固定されたマイクロアレイで検出した結果を、シグナル値のヒストグラムによって模式的に示している。以下、小型RNAを捕捉するためのプローブ又は標準物質を捕捉するためのプローブを、総じて「捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいう。
図１Ａでは、検体Ａ及び検体Ｂから抽出した標的小型RNAを、それぞれDNAマイクロアレイを用いて解析した結果を、ヒストグラムで示している。マイクロアレイに搭載されている複数の標的小型RNA捕捉プローブから得られた測定値の分布（ヒストグラム）、及び複数の標準物質捕捉プローブから得られた測定値の代表値をそれぞれ示している。検体Ａと検体Ｂでは、小型RNAのヒストグラムが大きくずれている。このことから、検体間で小型RNAの発現量に大きな差があると解釈できる。一方、実験誤差、特に検体からの核酸抽出工程における核酸抽出効率により差が生じているとも解釈できる。どちらが正しいか、ヒストグラムのみから判断することはできない。
図１Ａで示した、核酸である標準物質捕捉プローブから得られた測定値の代表値は、検体Ａと検体Ｂでほぼ同じ値を示している。すなわち、検体Ａと検体Ｂは正しく実験に供せられ、実験誤差はないと判断することができる。この場合には、検体ＡＢ間で小型RNAの発現量に大きな差があるということになり、検体間での比較をするに当たって小型RNAの測定値の補正は不要である。
図１Ｂでは、DNAマイクロアレイを用いて検体Ｃ及び検体Ｄを解析した結果を模式的に示している。小型RNA捕捉プローブから得られた測定値のヒストグラム、及び標準物質捕捉プローブから得られた測定値の代表値をそれぞれ示している。
検体Ｃと検体Ｄでは、小型RNAの測定値のヒストグラムが同じような分布を示している。一方、標準物質捕捉プローブから得られた測定値の代表値は、検体Ｃと検体Ｄでは大きくずれている。このことから検体Ｃと検体Ｄの検出結果には、何らかの原因によって実験誤差が生じていることが分かる。このような場合には、検体ＣＤ間での比較をするに当たり、小型RNAの測定値を適切に補正する必要がある。
本発明に従い、標的小型RNAの測定値を補正した後のヒストグラムを図１Ｃに示した。補正の具体的な方法は後述の通りである。検体Ｃと検体Ｄの標準物質捕捉プローブから得られた測定値が一致するよう、検体Ｃのデータを補正した。この補正により、標準物質捕捉プローブから得られた測定値の代表値は検体Ｃと検体Ｄで一致するようになり、同じ補正係数を用いて補正された標的小型RNA捕捉プローブの測定値のヒストグラムは、大きくずれてくる。つまり、検体ＣＤ間でも、小型RNAの発現量には大きな差があるということになる。
本発明では、複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析（測定）する。検体数は２つでもよいし、３つ以上でもよい。ここでいう複数の検体間での測定には、異なる複数種の標的小型RNAの測定、同一の標的小型RNAを複数回測定する場合の各検体の測定、又はその両者を組み合わせた測定が含まれる。
本発明における「小型RNA」とは、生体内で作られる塩基長が200塩基未満のRNAを意味する。例えば、リボソームRNA（5S rRNA、5.8S rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、small nuclear ribonucleoprotein particle RNA（snoRNA）、small nuclear RNA（snRNA）、マイクロRNA（miRNA）や、プロセッシングを受ける前の未成熟なmiRNAとして、ステムループ状のpre-miRNAや二本鎖のmiRNA/miRNA duplexなどが例示できるが、これに限定されない。好ましい小型RNAの例としては、miRNAを挙げることができる。
＜標準物質＞
本発明では、標的小型RNAの発現量を比較解析するための抽出工程及び測定工程において、標的小型RNAに対して標準物質が一定の含量で存在する。特に、抽出工程において、核酸である標準物質が標的小型RNAと同様の抽出効率で抽出されることが好ましい。
本発明では、標的小型RNAの発現量を比較解析するための抽出工程及び測定工程において、標的小型RNAに対して標準物質が一定の含量で存在する。特に、抽出工程において、核酸である標準物質が標的小型RNAと同様の抽出効率で抽出されることが好ましい。
本発明で用いる標準物質は核酸である。その核酸長は、標的とする小型RNAよりも長い200塩基以上であり、好ましくは200塩基以上1200塩基以下、より好ましくは500塩基以上1200塩基以下である。一般的に一本鎖のRNAは、核酸長が200〜300塩基以上であれば、鎖内で水素結合を形成しやすくなり、物理的に安定化されたり、各種の塩や脂質類、タンパク質などと会合したりすることにより、化学的にもより安定化した状態を保つことができる。一方、核酸である標準物質の核酸長が200塩基未満だと、検体からの抽出効率や測定結果が抽出の際の条件や検体の条件、検体に含まれる夾雑物の影響により実験間で大きくばらつき、特に小型RNAと異なる抽出効率で抽出されることが懸念される。
また、標準物質は、以下（１）、（２）の性質をもつことが好ましい。
（１）GC含率が30〜70％の範囲であること。
（２）Tm値が10℃以上95℃以下であること。
（１）GC含率が30〜70％の範囲であること。
（２）Tm値が10℃以上95℃以下であること。
このうち（１）のGC含率は、使用する標準物質の塩基配列におけるA,T,G,C全塩基中のG,Cの存在割合から求めることができる。GC含率が高いほど水素結合の数が増えるため、核酸の構造、性質が安定する傾向があるが、高すぎると測定の際の配列特異性が低下する。このため、標準物質のGC含率は30〜70％の範囲であることが好ましく、40〜60％の範囲であることがより好ましい。
（２）のTm値は、標準物質の塩基配列に基づいて、最近接塩基対（Nearest Neighbor）法（PNAS, 1998, 95: 1460-1465）等を用いることで算出することができる。一般に、Tm値が高いほど核酸の構造安定性が高いといわれており、標準物質のTm値は10℃以上95℃以下であることが好ましく、30℃以上95℃以下であることがより好ましく、86℃以上95℃以下であることがさらに好ましい。
本発明で使用する標準物質は、測定工程を考慮すると、使用する検体中に含まれる遺伝転写産物とクロスハイブリダイゼーションしないものを選択することが好ましい。具体的には、公共のデータベースに収録されている標的小型RNAと同じ生物種のあらゆる遺伝子転写産物に対して、配列相同性が50％以下である核酸を、相同性検索プログラムを利用して選択することができる。ここで、相同性検索プログラムとしては、特に限定されないが、例えばFASTA、BLAST、Mega Blastといった公共のプログラムを適用することができる。また、公共のデータベースとしては、特に限定されないが、遺伝子転写産物の配列情報が格納されたGenbank（NCBI）、EMBL（EBI）、Ensembl、miRbase等のデータベースを使用することができる。
本発明で用いる標準物質は、核酸の有機化学合成法を適用して、あるいは、標準物質の配列をプラスミドなどに組み込んだベクターを使用して大腸菌などの微生物の宿主内で合成する方法や、標準物質の配列の上流部にT7プロモーターなどのRNA合成酵素が認識できる配列を組み込み、T7ポリメラーゼ等の酵素により合成をする方法などの生物学的合成方法を適用して、作製することができる。また、分析装置や分析方法の妥当性評価や精度管理のための基準として利用できる核酸標準物質が公知であり、市販品も存在するので、そのような公知のものを本発明においても標準物質として使用することができる。
標準物質には、一本鎖の状態のもののみならず、相補鎖と共に二本鎖が形成されたものも含まれ得る。また、標的となる小型RNAと化学的な性質と一致させることを目的に、天然に存在する核酸の塩基配列を一部に含んでいても、天然に存在しない塩基配列を含んでいてもよい。また、同一の塩基配列が、複数回繰り返された又はランダムに複数回配置された配列であってもよく、配列の一部に開始コドンや終始コドンを含んでいてもよい。また、配列の両側あるいは片側にポリAなどのプライマーサイトが付与されていてもよい。
標準物質は、DNA又はRNAであることが好ましいが、PNA、LNAなどの人工核酸などの核酸誘導体を用いることもできる。ここで、核酸誘導体とは、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体を意味する。また、末端が各種官能基で修飾されていてもよく、そのような官能基としてリン酸基やアミノ基、チオール基などがあげられる。
本発明の方法において、標準物質は１種類を用いてもよいし、複数種を用いてもよい。また、タンパク質と会合した状態や脂質類で形成されたベシクルに内包された状態で使用してもよい。
＜検体＞
本発明の方法で用いることができる検体としては、特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、脳脊髄液、汗、涙液、精液、リンパ液、関節液などの各種組織液又は体液、各種組織、細胞の凍結検体やパラフィン包埋検体（FFPE）又はその切片、細胞や組織を培養した培養液など、生体から分離された検体、すなわち生体試料が挙げられる。また、各種飲食物又はその希釈物等を挙げることができる。一定量の検体に一定量の標準物質を添加して用いるので、特に体液であることが好適である。また、比較解析する複数の検体は、異なる組織に由来する複数の検体でもよいし、異なる生体から分離された同一の組織に由来する複数の検体でもよく、また、同一組織内の異なる部位（例えば、腫瘍等の病変部と非病変部）に由来する複数の検体でもよい。
本発明の方法で用いることができる検体としては、特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、脳脊髄液、汗、涙液、精液、リンパ液、関節液などの各種組織液又は体液、各種組織、細胞の凍結検体やパラフィン包埋検体（FFPE）又はその切片、細胞や組織を培養した培養液など、生体から分離された検体、すなわち生体試料が挙げられる。また、各種飲食物又はその希釈物等を挙げることができる。一定量の検体に一定量の標準物質を添加して用いるので、特に体液であることが好適である。また、比較解析する複数の検体は、異なる組織に由来する複数の検体でもよいし、異なる生体から分離された同一の組織に由来する複数の検体でもよく、また、同一組織内の異なる部位（例えば、腫瘍等の病変部と非病変部）に由来する複数の検体でもよい。
＜検体への標準物質の添加＞
本発明の方法では、検体の一定量に対して標準物質を一定量加える。この場合の量の単位については、特に限定されるものではなく、重さであっても、容積であってもよい。また、標準核酸の溶液を一定量加える際に、標準物質の溶液の一定量を測定する際の単位は、重量、容量、モル数など、どんな単位でもよい。標準物質の量を測定する方法としては、吸光度測定法、電気泳動法、カラム法、キャピラリー電気泳動法など既知の各種方法をとることができる。
本発明の方法では、検体の一定量に対して標準物質を一定量加える。この場合の量の単位については、特に限定されるものではなく、重さであっても、容積であってもよい。また、標準核酸の溶液を一定量加える際に、標準物質の溶液の一定量を測定する際の単位は、重量、容量、モル数など、どんな単位でもよい。標準物質の量を測定する方法としては、吸光度測定法、電気泳動法、カラム法、キャピラリー電気泳動法など既知の各種方法をとることができる。
核酸を抽出する前に、検体の一定量に対して、標準物質を一定量添加する。本発明においては、検体を抽出溶液に混合し、グアニジニウム塩などにより検体中に存在し得る核酸分解酵素を失活した後に、標準物質を添加することが好ましく、RNAを含む溶液を分離する前に添加することがより好ましい。
標準物質は検体に対して溶液状態で添加しても乾燥された固体状態で添加してもよいが、正確に一定量添加するためには溶液状態で添加することが好ましく、数μL〜数百μLの量で添加することがより好ましい。溶液で添加する場合、通常ピペットを用いるが、μLオーダー未満だと正確に秤量することが難しく、mLオーダー以上だと、検体に対する容量が大きくなり、抽出溶液の組成が大きく変わってしまうため、その後の抽出操作に対して影響を与えることが懸念される。この際の標準物質の溶液を作製する場合には、その溶媒は水あるいはPBSなどの緩衝溶液を使用することが好ましい。
また、添加される標準物質の量は、最終的に検体に含まれる標的小型RNAと同程度の濃度になるように検体に対して添加されることが好ましい。小型RNAは検体の種類により含まれる濃度は異なるが、検体が体液の場合には、モル濃度単位で、z（zepto）mol/mL〜p（pico）mol/mLであり、より好ましくはa（atto）mol/mL〜f（femto）mol/mLの濃度で、検体に対して標準物質を添加する。その濃度の測定方法は吸光度測定法、蛍光法、電気泳動法、カラム法、キャピラリー電気泳動法などがあげられる。
また、核酸抽出後に吸光度測定法、蛍光法、電気泳動法、カラム法、キャピラリー電気泳動法などで抽出溶液を測定することにより、標的小型RNAと標準物質の存在を確認し、又は、その量を測定してもよい。
＜抽出工程＞
本発明では、標準物質の共存下、各検体から標的小型RNAを含む核酸の抽出処理が行われる（抽出工程）。各検体に添加された標準物質も標的小型RNAと共に抽出されるので、この抽出工程で各検体から得られる核酸試料には、標的小型RNA及び標準物質が含まれる。
本発明では、標準物質の共存下、各検体から標的小型RNAを含む核酸の抽出処理が行われる（抽出工程）。各検体に添加された標準物質も標的小型RNAと共に抽出されるので、この抽出工程で各検体から得られる核酸試料には、標的小型RNA及び標準物質が含まれる。
検体から核酸を抽出する方法については、既知の各種方法を用いることができるが、RNAを抽出する方法として一般的に用いられているAGPC法、フェノール／クロロホルム法を用いるのが好適である。その場合、好ましくは、抽出溶液として、２〜５Ｍのグアニジンと４０〜６０％のフェノールを含む溶液であることが好ましい。さらに、タンパク質などの夾雑物を効果的に除去できる抽出溶液として、抽出溶液の総量に対して
（ａ）５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む抽出溶液を使用することが好ましい。また、核酸が抽出されやすいように、抽出溶液に各種塩を添加してもよい。
（ａ）５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３〜１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５〜２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１〜０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４〜６に維持するための緩衝剤、
を含む抽出溶液を使用することが好ましい。また、核酸が抽出されやすいように、抽出溶液に各種塩を添加してもよい。
具体的な抽出工程としては、例えば、検体を抽出溶液中でホモジナイズして、ホモジェネートを形成させ、RNAを含む水溶液を分離するための有機溶媒をこのホモジェネートに加えたのち、これを遠心分離する方法を適用できる。そのような工程では、上述の通り、検体を抽出溶液と混合した後、遠心分離の前までに標準物質を添加することが好ましい。
抽出された小型RNAを含む溶液を、さらに沈澱、クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、及びアフィニティー分離などの工程に供して精製してもよい。例えば、沈澱工程においては、小型RNAを含む溶液に低級アルコールを加えて小型RNAを沈澱させ、沈澱した小型RNAを回収する工程を適用できる。クロマトグラフィー工程としては、小型RNAが含まれる溶液に低級アルコールを加えて沈澱させた小型RNAを、RNAを吸着しうる担体、例えばシリカメンブレンカラムに吸着させた後、担体（カラム）から溶出して回収する工程を適用してもよい。
＜測定工程＞
本発明の方法では、以上の抽出工程により複数の検体からそれぞれ抽出された核酸試料に含まれる標的小型RNA及び標準物質の量を測定する（測定工程）。
本発明の方法では、以上の抽出工程により複数の検体からそれぞれ抽出された核酸試料に含まれる標的小型RNA及び標準物質の量を測定する（測定工程）。
測定方法としては、PCR法、シークエンス法等の増幅法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、アレイ法等のハイブリダイゼーション法などの各種方法が用いられる。ハイブリダイゼーション法のうち、対象のRNAや標準物質に特異的に結合するプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ等のアレイチップを用いるアレイ法により測定を行なうことが好適である。具体的には、標的小型RNA捕捉プローブと標準物質捕捉プローブとが整列固定化された支持体を含むアレイチップを好ましく用いることができる。
「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のRNA等の核酸と直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸プローブは、DNAやRNAのほか、PNA（ペプチド核酸）やLNA（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いて調製することができる。ここで、核酸誘導体とは、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体を意味する。
核酸プローブの塩基長は、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、20塩基以上とすることが好ましい。通常、20〜100塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
核酸プローブは、対象の核酸（標的小型RNAや核酸である標準物質）と完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、「Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual （2nd ed.）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York（1998）」に記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体に含まれる標的小型RNAや使用する標準物質の検出のために用意した核酸プローブが捕捉プローブとしての機能を適切に発揮できる条件を適宜決定することができる。
小型RNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースから入手することができる。また、miRNAの配列情報は、例えばmiRbaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/ftp.shtml）から入手することができる。小型RNA捕捉核酸プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
支持体上に固定化される小型RNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数の小型RNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、小型RNAの発現量を測定してもよいし、所望の数の小型RNAに対する捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよく、例えば、特定の疾患や生体状態に関連する特定の１ないし複数の小型RNA捕捉プローブを使用してもよい。
標準物質を捕捉するためのプローブは、使用する標準物質を相補的に捕捉できることができるプローブであればよい。標準物質の塩基配列との相同性が50％以上であり、かつ高次構造をとらないことが好ましく、例えば、特開2011-239708号公報で記されているような方法で設計することができる。
捕捉プローブが固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えばスライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第5705610号明細書）、Michelらの方法（米国特許第6142266号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第7037659号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
後者の方法としては、廣田ら（特許第3922454号）の方法やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてUV照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やSH基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
捕捉プローブは、１種類の小型RNA又は標準物質に対して、支持体の複数の固定化領域に固定して検出してもよい。例えば、１種類の小型RNA又は標準物質を捕捉する同一の捕捉プローブを支持体上の複数箇所に固定してもよいし、また１種類の小型RNA又は標準物質に対して複数種類の捕捉プローブを設計できる場合には、同じ小型RNA又は標準物質を標的とする複数の捕捉プローブを支持体上に固定してもよい。
支持体上に固定化された各プローブとのハイブリダイゼーションは、少なくとも１種の標準物質を添加した検体から抽出した核酸試料に標識物質を結合させ、標識物質で標識された核酸試料を調製し、この標識された核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。本発明において、「核酸試料」という語には、検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。従って、標識された核酸試料は、核酸試料中の標的小型RNA及び標準物質を直接的又は間接的に標識物質で標識したものであり得るし、また、核酸試料中のRNAから調製されたcDNA又はcRNA（標準物質がRNAの場合、標的小型RNA及び標準物質から逆転写反応により得られるcDNA又はcRNAが含まれる）を直接的又は間接的に標識物質で標識したものであり得る。
核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の3'末端に標識物質を結合させる方法、5'末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。3'末端に標識物質を結合させる方法、5'末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、3'末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。ライフテクノロジーズ社のNCode miRNA Labeling systemは、miRNAにポリAテイルを付加した後、架橋形成オリゴdTを用いてキャプチャー配列を3'末端にライゲーションし、これをアレイにハイブリダイズさせた後、キャプチャー配列にハイブリダイズする配列をもった標識物質を添加して、キャプチャー配列を介してmiRNAを標識するというものであり、miRNAに間接的に標識物質を結合させる手法である。標準物質として3’末端がリン酸化されたRNAを用いればこれらの方法で標識を行うことが可能である。
このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体から抽出したRNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。標準物質としてRNAを用いる場合にはこの方法を採用することができる。
本発明では、複数の検体を用いるが、いずれにも同一の標識物質を用いてよいし、複数の異なる標識物質を用いてもよい。
本発明において使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、シグナルが検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン2）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン3）、シアニン3.5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン5）、シアニン5.5、シアニン7、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
上記のようにして標識された、検体由来の核酸（標的小型RNA）及び標準物質を含む核酸試料を支持体上のプローブと接触させてハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、30℃〜70℃程度で１分間〜十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
検出された測定値（シグナル値）は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られた測定値と、それ以外の位置から得られた測定値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
検出された測定値にバックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出したシグナル値から減算することもできる。その他、「マイクロアレイデータ統計解析プロトコール（羊土社）」に記載されている方法を用いてもよい。
上記により、各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量、すなわち各検体における標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値が、シグナル強度として得られる。
＜代表値取得工程＞
本発明の方法では、次いで、各検体について、抽出された核酸試料中の標準物質存在量の測定値から、代表値を取得する（代表値取得工程）。なお、核酸試料中の標準物質存在量という語と、検体からの標準物質抽出量という語は同義であり、本明細書においては、「標準物質存在量」と「標準物質抽出量」という語を同じ意味で用いる。核酸試料中の標準物質存在量、及び検体からの標準物質抽出量を、単に「標準物質量」ということがある。すなわち、本明細書において、「検体の標準物質量」といった場合、検体中に添加した標準物質量ではなく、核酸試料中の標準物質存在量又は検体からの標準物質抽出量を意味している。
本発明の方法では、次いで、各検体について、抽出された核酸試料中の標準物質存在量の測定値から、代表値を取得する（代表値取得工程）。なお、核酸試料中の標準物質存在量という語と、検体からの標準物質抽出量という語は同義であり、本明細書においては、「標準物質存在量」と「標準物質抽出量」という語を同じ意味で用いる。核酸試料中の標準物質存在量、及び検体からの標準物質抽出量を、単に「標準物質量」ということがある。すなわち、本明細書において、「検体の標準物質量」といった場合、検体中に添加した標準物質量ではなく、核酸試料中の標準物質存在量又は検体からの標準物質抽出量を意味している。
標準物質が１種類の場合はその１種類の存在量の測定値が代表値となり得るが、２種類以上の場合は以下各種の方法で代表値を取得してもよい。
代表値の典型例としては、平均値及び中央値を挙げることができる。平均値は、複数の標準物質の抽出量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）から算出された平均値を意味する。中央値は、複数の標準物質の抽出量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）から得られた中央値を意味する。
これらの平均値又は中央値は、対数値で表された平均値又は中央値であってよい。「対数値で表された平均値」とは、複数の標準物質の抽出量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値で求めた平均値を意味する。「対数値で表された中央値」とは、複数の標準物質の抽出量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値の中央値、又は複数の標準物質の抽出量の測定値の中央値を底が２の対数に変換した対数値を意味する。中央値の場合は、測定値の対数変換を先に行なっても後に行なっても同じ値が得られる。
平均値及び中央値は、測定対象とした複数の標準物質の全ての測定値を用いて求めたものであってもよいし、該複数の標準物質のうちから選出された一部の測定値を用いて求めたものであってもよい。例えば、マイクロアレイに搭載されている標準物質捕捉プローブで得られた全ての測定値を用いて求めてもよいし、標準物質捕捉プローブのうちの一部（例えば、マイクロアレイに搭載されている標準物質捕捉プローブが１０種であったとすると、そのうちの５種）について求めてもよい。例えば、比較解析すべき全ての検体に共通して有効判定陽性であった標準物質捕捉プローブのみを選出して、標準物質の代表値を取得することができる。また、代表値を求める前に、標準物質の存在量の測定値から外れ値を除外してもよい。
また、１種類の標準物質に対して複数種の捕捉プローブを用いたり、あるいは１種類の捕捉プローブが複数箇所にスポットされたアレイを用いて検出を行うことにより、１つの標準物質に対して複数の測定値が得られる場合もある。この場合も、２種類以上の標準物質を用いる場合と同様に、複数の測定値から算出された平均値又は中央値、例えば対数値で表された平均値又は中央値を代表値として用いることができる。また、それらの測定値の全てを用いて代表値を求めてもよいし、一部の測定値を用いて求めてもよい。
また、複数の標準物質を用いる態様において、１つの標準物質に対する１種類の捕捉プローブがそれぞれアレイ上の複数箇所にスポットされている場合は、まず標準物質ごとに複数の捕捉プローブスポットからのシグナル測定値の平均値を求め、各平均値を対数変換し、各対数値を用いて複数の標準物質の間で平均値又は中央値を求めてもよい。このようにして求めた平均値又は中央値も、「対数値で表された平均値又は中央値」に包含される。
複数の検体における代表値のCV値（変動係数）は0.5以下となることが好ましい。通常、マイクロアレイを用いた場合の測定値のCV値は0.5以下となる。CV値が0.5以上の場合はバラツキが大きく、抽出工程での標準物質の抽出効率が安定せず、結果として補正後のデータの精度が低下することが予測される。
＜補正係数取得工程＞
次いで、代表値取得工程で得られた各検体の標準物質抽出量の代表値と、標準物質抽出量に関して任意に設定された基準値とを用いて、標的小型RNAの発現量の補正に用いる補正係数を取得する（補正係数取得工程）。この補正係数取得工程では、代表値と基準値との差を利用して補正係数を求めてもよいし、代表値と基準値との比を利用して補正係数を求めてもよい。特に限定されないが、対数変換していない代表値を用いる場合には比を利用して補正係数を求め、対数で表された代表値を用いる場合には差を利用して補正係数を求めることが好ましい。以下、これら２通りの工程について説明する。
次いで、代表値取得工程で得られた各検体の標準物質抽出量の代表値と、標準物質抽出量に関して任意に設定された基準値とを用いて、標的小型RNAの発現量の補正に用いる補正係数を取得する（補正係数取得工程）。この補正係数取得工程では、代表値と基準値との差を利用して補正係数を求めてもよいし、代表値と基準値との比を利用して補正係数を求めてもよい。特に限定されないが、対数変換していない代表値を用いる場合には比を利用して補正係数を求め、対数で表された代表値を用いる場合には差を利用して補正係数を求めることが好ましい。以下、これら２通りの工程について説明する。
＜補正係数取得工程−１＞
補正係数取得工程−１は、標準物質抽出量の代表値と基準値との差を利用する方法である。本工程には、下記の１−１．基準検体取得法、又は１−２．固定数値補正法を適用し得る。
補正係数取得工程−１は、標準物質抽出量の代表値と基準値との差を利用する方法である。本工程には、下記の１−１．基準検体取得法、又は１−２．固定数値補正法を適用し得る。
１−１．基準検体取得法
解析対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの１又はそれ以上の検体（第２以降の検体）が、「補正される検体」となる。
解析対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの１又はそれ以上の検体（第２以降の検体）が、「補正される検体」となる。
なお、本明細書において、「第２以降の検体」という語には、第２の検体も包含される。例えば、比較すべき複数の検体が２つであれば、補正される検体は第２の検体のみであり、比較すべき複数の検体が３つであれば、補正される検体は第２の検体及び第３の検体の２つである。
この方法では、基準検体の標準物質量の代表値を「基準値」とする。当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の標準物質量の代表値との差を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
具体的には、補正係数は、式１又は式１’で求められる。
c1-1＝（基準検体の標準物質量の代表値（基準値））
−（補正される検体の標準物質量の代表値） ・・・式１
c1-1’＝（補正される検体の標準物質量の代表値）
−（基準検体の標準物質量の代表値（基準値）） ・・・式１’
c1-1＝（基準検体の標準物質量の代表値（基準値））
−（補正される検体の標準物質量の代表値） ・・・式１
c1-1’＝（補正される検体の標準物質量の代表値）
−（基準検体の標準物質量の代表値（基準値）） ・・・式１’
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、標準物質量の代表値として対数値で表された平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式２又は式２’で求めることができる。
ここで、式２、式２’中、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
プローブが標準物質と１対１対応である場合、ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブがターゲットとする標準物質の数に等しい。
式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
１−２．固定数値補正法
標準物質量の代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値を「基準値」とし、この固定数値と各検体の標準物質量の代表値との差を得て、この差を補正係数として利用する。当該方法では、１−１．に示した「基準検体」は存在しないので、比較解析対象となる複数の検体の全てが「補正される検体」となり、比較解析対象となる検体の数だけ補正係数が取得されることになる。
標準物質量の代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値を「基準値」とし、この固定数値と各検体の標準物質量の代表値との差を得て、この差を補正係数として利用する。当該方法では、１−１．に示した「基準検体」は存在しないので、比較解析対象となる複数の検体の全てが「補正される検体」となり、比較解析対象となる検体の数だけ補正係数が取得されることになる。
具体的には、補正係数は、式３又は式３’で求められる。
r1-2＝(固定数値(基準値))−(補正される検体の標準物質量の代表値)
・・・式３
r1-2'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)−(固定数値(基準値))
・・・式３’
r1-2＝(固定数値(基準値))−(補正される検体の標準物質量の代表値)
・・・式３
r1-2'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)−(固定数値(基準値))
・・・式３’
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、標準物質量の代表値として対数値で表された平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式４又は式４’で求めることができる。
ここで、式４、式４’中、
αは基準値（固定数値）、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
αは基準値（固定数値）、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
プローブが標準物質と１対１対応である場合、ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブがターゲットとする標準物質の数に等しい。
式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
固定数値補正法で基準値として用いる固定数値は、少なくとも１回の比較解析において、全ての検体に対して一貫して同一の数値を使用する限り、いかなる数値（ただし０以外）を用いてもよい。同一の発現測定システムを使用し、かつ、常に同一の数値を固定数値として使用することとすれば、別の日に発現量の測定を行なった検体の間でも比較解析が可能である。例えば、検体に添加する各標準物質の量は全ての検体で同一なので、標準物質添加量に基づいて固定数値を決定してもよい。もっとも、測定工程において使用するシステムによって検出されるシグナル値の大きさは変動し得るため、使用するシステムに応じて固定数値は自由に選択できる。
＜補正係数取得工程−２＞
補正係数取得工程−２は、標準物質量の代表値と基準値との比を利用する方法である。本工程には、下記の２−１．基準検体取得法、又は２−２．固定数値補正法を適用し得る。
補正係数取得工程−２は、標準物質量の代表値と基準値との比を利用する方法である。本工程には、下記の２−１．基準検体取得法、又は２−２．固定数値補正法を適用し得る。
２−１．基準検体取得法
解析対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの第２以降の検体が、「補正される検体」となる。
解析対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの第２以降の検体が、「補正される検体」となる。
この方法では、基準検体の標準物質量の代表値を「基準値」とし、当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の標準物質量の各代表値との比を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
具体的には、補正係数は、式５又は式５’で求められる。
c2-1＝(基準検体の標準物質量の代表値(基準値))
／(補正される検体の標準物質量の代表値) ・・・式５
c2-1'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)
／(基準検体の標準物質量の代表値(基準値)) ・・・式５’
c2-1＝(基準検体の標準物質量の代表値(基準値))
／(補正される検体の標準物質量の代表値) ・・・式５
c2-1'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)
／(基準検体の標準物質量の代表値(基準値)) ・・・式５’
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、標準物質量の代表値として対数値で表された平均値を用いる場合、第２の検体のための補正係数は、式６又は式６’で求めることができる。
ここで、式６、式６’中、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
プローブが標準物質と１対１対応である場合、ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブがターゲットとする標準物質の数に等しい。
式６及び式６’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
２−２．固定数値補正法
標準物質量の代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値を「基準値」とし、この固定数値と各検体の標準物質量の代表値との比を得て、この比を補正係数として利用する。当該方法では、２−１．に示した「基準検体」は存在しないので、比較解析対象となる複数の検体の全てが「補正される検体」となり、比較解析対象となる検体の数だけ補正係数が取得されることになる。
標準物質量の代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値を「基準値」とし、この固定数値と各検体の標準物質量の代表値との比を得て、この比を補正係数として利用する。当該方法では、２−１．に示した「基準検体」は存在しないので、比較解析対象となる複数の検体の全てが「補正される検体」となり、比較解析対象となる検体の数だけ補正係数が取得されることになる。
具体的には、補正係数は、式７又は式７’で求められる。
r2-2＝(固定数値(基準値))／(補正される検体の標準物質量の代表値)
・・・式７
r2-2'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)／(固定数値(基準値))
・・・式７’
r2-2＝(固定数値(基準値))／(補正される検体の標準物質量の代表値)
・・・式７
r2-2'＝(補正される検体の標準物質量の代表値)／(固定数値(基準値))
・・・式７’
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、標準物質量の代表値として対数値で表された平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式８又は式８’で求めることができる。
ここで、式８、式８’中、
αは固定数値、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
αは固定数値、
ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の標準物質捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
プローブが標準物質と１対１対応である場合、ｎは、支持体上の標準物質捕捉プローブがターゲットとする標準物質の数に等しい。
式８及び式８’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった標準物質捕捉プローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
ここで基準値として用いる「固定数値」の詳細は、「１−２．固定数値補正法」における固定数値と同様である。
＜補正工程＞
次いで、補正係数取得工程−１又は補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて、補正工程−１又は補正工程−２の方法を利用して、補正される検体における標的小型RNAの発現量の補正を行う。
次いで、補正係数取得工程−１又は補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて、補正工程−１又は補正工程−２の方法を利用して、補正される検体における標的小型RNAの発現量の補正を行う。
＜補正工程−１＞
補正工程−１は、補正係数取得工程−１で得られた補正係数を用いて標的小型RNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的小型RNAの発現量に補正係数を加算、又は該発現量から補正係数を減算することによって補正を行なう。本工程には、補正係数取得工程−１の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
補正工程−１は、補正係数取得工程−１で得られた補正係数を用いて標的小型RNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的小型RNAの発現量に補正係数を加算、又は該発現量から補正係数を減算することによって補正を行なう。本工程には、補正係数取得工程−１の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
１−１．基準検体取得法
第２以降の検体における標的小型RNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的小型RNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（c21-1又はc21-1’）を使用し、第３の検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（c31-1又はc31-1’）を使用する。
第２以降の検体における標的小型RNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的小型RNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（c21-1又はc21-1’）を使用し、第３の検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（c31-1又はc31-1’）を使用する。
補正係数として、基準検体の標準物質量の代表値から第２以降の検体の標準物質量の代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１の場合には、第２以降の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値に補正係数を加算することにより、第２以降の各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９によって求めることができる。
ここで、Ｗｉは、ｉ番目の小型RNA捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
これとは逆に、補正係数として、第２以降の検体の標準物質量の代表値から、基準検体の標準物質量の代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１’の場合には、第２以降の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値から補正係数を減算することにより、第２以降の各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９’によって求めることができる。
ここで、Ｗｉの定義は上記式９に同じである。
第２の検体において測定された標的小型RNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値にｃ２を加算するか、又はｃ２’を減算すればよい。第３以降の検体についても同様である。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と基準値との差は当然０であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的小型RNA発現量に０を加算又は減算するという計算を実施しても差し支えない。
１−２．固定数値補正法
標的小型RNA発現量の補正は、代表値と固定数値（基準値）との差によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ1-2又はｒ1-2’）を使用する。
標的小型RNA発現量の補正は、代表値と固定数値（基準値）との差によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ1-2又はｒ1-2’）を使用する。
補正係数として、固定数値から検体の標準物質量の代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３の場合には、検体における各標的小型RNAの発現量の測定値又は該測定値の対数値に補正係数を加算することにより、各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０によって求めることができる。
ここで、Ｗｉは、ｉ番目の小型RNA捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
これとは逆に、補正係数として、検体の標準物質量の代表値から固定数値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３’の場合には、検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値から補正係数を減算することにより、各検体についての標的小型RNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０’によって求めることができる。
Ｗｉの定義は上記式１０に同じである。
＜補正工程−２＞
補正工程−２は、補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて標的小型RNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的小型RNAの発現量を補正係数で除算、又は該発現量に補正係数を乗算することによって補正を行なう。本工程にも、補正係数取得工程−２の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
補正工程−２は、補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて標的小型RNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的小型RNAの発現量を補正係数で除算、又は該発現量に補正係数を乗算することによって補正を行なう。本工程にも、補正係数取得工程−２の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
２−１．基準検体取得法
第２以降の検体における標的小型RNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的小型RNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２2-1又はｃ２2-1’）を使用し、第３の検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３2-1又はｃ３2-1’）を使用する。
第２以降の検体における標的小型RNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的小型RNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２2-1又はｃ２2-1’）を使用し、第３の検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３2-1又はｃ３2-1’）を使用する。
補正係数として、補正される第２以降の検体の標準物質量の代表値を分母とし、基準検体の標準物質量の代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５の場合には、第２以降の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、第２以降の各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１によって求めることができる。
ここで、Ｗｉは、ｉ番目の小型RNA捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
これとは逆に、補正係数として、基準検体の標準物質量の代表値を分母とし、第２以降の検体の標準物質量の代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５’の場合には、第２以降の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値を補正係数で除算することにより、第２以降の各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１’によって求めることができる。
ここで、Ｗｉの定義は上記式１１に同じである。
第２の検体において測定された標的小型RNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値にc22-1を除算するか、又はc22-1'を乗算すればよい。第３以降の検体についても同様である。式５及び式１１の手順でも、式５’及び式１１’の手順でも、最終的に得られる補正済み標的小型RNAの発現量Ｅｉの値は同じである。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と基準値との比は当然１であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的小型RNA発現量に１を乗算又は該標的小型RNA発現量を１で除算するという計算を実施しても差し支えない。
２−２．固定数値補正法
標的小型RNA発現量の補正は、固定数値（基準値）との比によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ2-2又はｒ2-2’）を使用する。
標的小型RNA発現量の補正は、固定数値（基準値）との比によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的小型RNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ2-2又はｒ2-2’）を使用する。
補正係数として、検体の標準物質量の代表値を分母とし、固定数値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７の場合には、検体における各標的小型RNAの発現量の測定値又は該測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、各検体についての標的小型RNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２によって求めることができる。
ここで、Ｗｉは、ｉ番目の小型RNA捕捉プローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
これとは逆に、補正係数として、検体の標準物質量の代表値を分母とし、固定数値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７’の場合には、検体における各標的小型RNA発現量の測定値又は該測定値の対数値を補正係数で除算することにより、各検体についての標的小型RNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的小型RNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２’によって求めることができる。
ここで、Ｗｉの定義は上記式１２に同じである。
＜比較解析工程＞
補正済みの標的小型RNA発現量を使用して、複数の検体間で標的小型RNA発現量を対比する。基準検体取得法により補正が実施される場合には、基準検体とした第１の検体の標的小型RNA発現量は補正を受けていないため、例えば第１の検体と第２の検体との間の対比は、補正されていない第１の検体の標的小型RNA発現量と、補正済みの第２の検体の標的小型RNA発現量との間での対比となるが、対比する検体のうちの少なくとも１つは必ず補正された検体となる。従って、「補正済みの標的小型RNA発現量により、複数の体液検体間で標的小型RNA発現量を対比する」といった場合には、補正されていない基準検体と補正された他の検体との間で対比する態様も包含される。
補正済みの標的小型RNA発現量を使用して、複数の検体間で標的小型RNA発現量を対比する。基準検体取得法により補正が実施される場合には、基準検体とした第１の検体の標的小型RNA発現量は補正を受けていないため、例えば第１の検体と第２の検体との間の対比は、補正されていない第１の検体の標的小型RNA発現量と、補正済みの第２の検体の標的小型RNA発現量との間での対比となるが、対比する検体のうちの少なくとも１つは必ず補正された検体となる。従って、「補正済みの標的小型RNA発現量により、複数の体液検体間で標的小型RNA発現量を対比する」といった場合には、補正されていない基準検体と補正された他の検体との間で対比する態様も包含される。
比較解析工程自体は、従来法と同様に行なうことができる。例えば、スキャッタープロットと呼ばれる発現量データの散布図を作成すればよい。比較すべき検体が３つの場合、例えば、３つのうちのいずれか１つの検体と残りの各検体とを比較解析したスキャッタープロットを２つ（例えば、第１の検体−第２の検体間のスキャッタープロットと第１の検体−第３の検体間のスキャッタープロット）作成すればよく、必要に応じて、さらに残りの２つの検体間（前述の例の場合には、さらに第２の検体−第３の検体間）で比較解析したスキャッタープロットを作成してもよい。４つ以上の検体の比較解析も同様に行なうことができる。なお、３検体の比較解析であれば、３次元的にスキャッタープロットを作成することもできる。基準検体取得法の場合であっても、必ずしも基準検体と他の２検体とをそれぞれ比較しなければならないわけではなく、例えば第２の検体−基準検体間の比較と第２の検体−第３の検体間の比較を行なうこととしてもよい。
また、補正済みの標的小型RNA発現量により、いずれか１つの検体と残りの他の検体との間で標的小型RNAの発現量の差を計算し、その差をもって対数化された変化倍率（fold-change）として比較解析結果を表してもよい。例えば、基準検体における標的小型RNAの発現量（基準検体取得法の場合）又は第１の検体における補正済みの標的小型RNAの発現量（固定数値補正法の場合）と、第２以降の検体における補正済みの標的小型RNAの発現量との差を計算してよい。この場合も上述の場合と同様に、第１の検体と他の検体との差を計算することに限定されず、第２以降の検体のいずれか１つと他の検体との差を計算することとしてもよい。さらにはまた、また、補正済みの標的小型RNA発現量を使用して、平均値や標準偏差、標準誤差、変動係数の算出、群間比較や有意差検定、クラスター解析など、複数の検体における標的小型RNAの発現量を使用した統計的な解析により対比や評価を実施することも可能である。
本発明の装置は、標的小型RNAの発現量を比較解析するために該発現量を補正する装置である。該装置は、
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
ある１つの態様において、基準値は、任意に選択された第１の検体（基準検体）の標準物質量の代表値であり、第２以降の検体において測定された標的小型RNAの発現量が補正される。すなわち、この態様において、本発明の装置は、
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
任意に選択された第１の検体を基準検体とし、基準検体の標準物質抽出量の代表値を基準値として、当該基準値と残りの第２以降の検体の代表値との差又は比を、当該第２以降の検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
任意に選択された第１の検体を基準検体とし、基準検体の標準物質抽出量の代表値を基準値として、当該基準値と残りの第２以降の検体の代表値との差又は比を、当該第２以降の検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
別の態様において、基準値は、標準物質抽出量に関して任意に定められた固定数値であり、第１の検体を含む全ての検体について、標的小型RNA発現量の補正が行われる。すなわち、この態様において、本発明の装置は、
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
固定数値を基準値として、当該基準値と各検体の代表値との差は比を、当該検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各検体のための補正係数をそれぞれ用いて、各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
複数の各検体に、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
固定数値を基準値として、当該基準値と各検体の代表値との差は比を、当該検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各検体のための補正係数をそれぞれ用いて、各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む。
上記した補正装置を備える小型RNA発現量の比較解析装置は、さらに、補正済みの標的小型RNA発現量により、少なくとも２つの検体の間で標的小型RNA発現量を対比した結果を出力する出力手段を含み得る。
当該補正装置を備えた解析装置の構成の概略を示すブロック図を図２に示す。解析装置１０は、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０を具備する。また、図３には、本発明による標的小型RNA発現量の補正処理のフローチャートの一例を示す。
入力部１１０は、解析装置１０の動作に関わる情報を入力する手段である。キーボード等の従来公知の入力手段を好ましく用いることができる。マイクロアレイを用いた場合、ハイブリダイゼーションアッセイにより得られる小型RNA発現量や標準物質抽出量のデータは、例えば、本発明の装置とは別のスキャナー等の読取手段で読み取られ、数値データに変換された後、入力部１１０から当該数値データを解析装置１０に入力されてもよい。あるいは、スキャナー等の読取手段が、本発明の解析装置１０に含まれていてもよい（図示せず）。
入力部１１０から入力された発現量や抽出量のデータ、又は解析装置１０に組み込まれた読取手段によって読み取られ数値化された発現量や抽出量のデータは、記憶部１４０に記憶される。この時、記憶部１４０は、複数の検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的小型RNAの発現量及び少なくとも１種の標準物質の抽出量の測定値を記憶する記憶手段として働く。
記憶部１４０に格納された各検体の小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値データは、場合によっては変換部１６０により、底が２などの対数に変換される。次いで、解析部１７０により、各検体について、標準物質抽出量の測定値の代表値が取得される。代表値は、補正方法についての説明で述べた通り、例えば少なくとも１種の標準物質量測定値の平均値若しくは中央値（１種類の標準物質のみを補正に用いる場合でも、それを測定するためのプローブ固定化領域がアレイ上に複数個存在する場合には、代表値が平均値又は中央値となり得る）、又は特定の１種類の標準物質量の測定値であり得る。
代表値が取得された後、解析部１７０により、各検体について基準値と各検体の標準物質量の代表値との差又は比が算出され、補正係数がそれぞれ取得される。補正係数の取得の詳細は、補正方法の＜補正係数取得工程＞で述べた通りである。なお、基準検体取得法が採用される場合には、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体についても補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を取得する構成としても差し支えない。
装置１０において、基準値を入力するあるいは基準検体を選出する場合は、装置１０を操作する者が入力部１１０から任意の１検体を指定することにより行なわれてよい。あるいは、装置１０が自動的に基準値を選定してもよいし、基準検体となる１検体を選出してもよい。例えば、入力部１１０からデータが入力され、記憶部１４０に最初にデータが記憶された検体が、装置１０によって基準検体として選出され得る。この基準検体の選出又は入力のステップは、図３では便宜的に代表値取得工程（S-3）の後に位置されているが、これに限定されず、より早いステップで、例えばデータの格納時に実行されてもよい。あるいはまた、あらかじめ指定した固定数値を基準値として変換部１６０等に登録しておいてもよい。
次いで、解析部１７０は、各検体のための補正係数をそれぞれ用いて、測定された標的小型RNA発現量データを補正する。補正操作の詳細は、補正方法の＜補正工程＞で述べた通りである。なお、基準検体取得法が採用される場合には、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体の標的小型RNA発現量データについても、補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を用いた補正操作を実行することとしても差し支えない。
次いで、解析部１７０により、各検体の標的小型RNA発現量の対比や統計的な解析が行なわれる。対比や統計的な解析の結果は、出力部１３０によって、表示部１２０に出力され、表示される。さらに、プリンター等の出力装置や記録媒体等に対比結果や統計解析結果が出力され得る。さらにまた、出力部１３０は、ネットワークを介して装置外部に存在するデータベース等の外部記憶装置に対比解析結果や統計解析結果を出力するように構成することもできる。
記憶部１４０は、複数の小型RNAの発現量及び複数の標準物質の抽出量の測定値を記憶するほか、上記の各工程で生じる中間の解析結果も適宜記憶する。
装置１０の上記した各種動作は、制御部１５０によって制御される。具体的には、図２の破線矢印で示されるように、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０の各手段に対して、制御部１５０から制御情報が出力され、この制御情報に基づいて各手段が連携して動作し、装置１０全体が動作する。
また、本発明は、コンピュータを上記した補正装置ないしは解析装置として機能させるためのプログラムを提供する。該プログラムは、具体的には、コンピュータを上記した各手段（すなわち、記憶手段、代表値取得手段、補正係数取得手段、補正手段、及び、解析装置においてはさらに出力手段）として機能させるためのプログラムである。あるいはまた、本発明は、コンピュータに上記した本発明の補正方法ないしは該補正方法を含む比較解析方法の各工程を実行させるためのプログラムを提供する。補正方法には、上記した測定工程、代表値取得工程、補正係数取得工程、及び補正工程が含まれ、比較解析方法においては、さらに、補正済みの標的小型RNA発現量により、複数の検体間で標的小型RNA発現量を対比する比較解析工程が含まれ得る。これらのプログラムは、マイクロアレイ等により標的小型RNAの発現量と同時に測定された標準物質抽出量の測定値のデータを用いて、標的小型RNAの発現量の補正をコンピュータに実行させるプログラムである。
さらにまた、本発明は、上記いずれかのプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO、DVD等の任意の「可搬用の物理媒体」（非一過性の記録媒体）であり得る。あるいは、LAN、WAN、インターネットに代表される、ネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」であり得る。
「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、OS（Operating System）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
本発明において好ましく使用され得る、複数の標的小型RNA捕捉プローブと、少なくとも１種、好ましくは複数の標準物質捕捉プローブとが固定化された支持体を含むアレイチップは、小型RNA発現解析用チップとして提供することができる。当該チップについての好ましい条件は、本発明の測定工程において説明した通りである。
以下、本発明を、ヒト血清検体を用いて本発明の補正方法を適用した実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（標準物質）
核酸長が200塩基以上の核酸である実施例用の標準物質として、独立行政法人産業技術総合研究所から定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液として購入できる、５種類のRNA水溶液：試料名RNA500-A（配列番号１）、RNA500-B（配列番号２）、RNA500-C（配列番号３）（以上、いずれも核酸長約500塩基のRNA）、RNA1000-A（配列番号４）、及びRNA1000-B（配列番号５）（以上、いずれも核酸長約1000塩基のRNA）からなる認証標準物質 NMIJ CRM 6204-a、並びに本願発明者らが設計しユーロフィンジェノミクス社にて委託合成した3種類のRNA、hsncs_071028（配列番号１５）、hsncs_404161（配列番号１６）、hsncs_647981（配列番号１７）（以上、いずれも核酸長約200塩基のRNA）のRNAを使用した。
核酸長が200塩基以上の核酸である実施例用の標準物質として、独立行政法人産業技術総合研究所から定量解析用リボ核酸（RNA）水溶液として購入できる、５種類のRNA水溶液：試料名RNA500-A（配列番号１）、RNA500-B（配列番号２）、RNA500-C（配列番号３）（以上、いずれも核酸長約500塩基のRNA）、RNA1000-A（配列番号４）、及びRNA1000-B（配列番号５）（以上、いずれも核酸長約1000塩基のRNA）からなる認証標準物質 NMIJ CRM 6204-a、並びに本願発明者らが設計しユーロフィンジェノミクス社にて委託合成した3種類のRNA、hsncs_071028（配列番号１５）、hsncs_404161（配列番号１６）、hsncs_647981（配列番号１７）（以上、いずれも核酸長約200塩基のRNA）のRNAを使用した。
核酸長が200塩基未満の核酸である比較例用の標準物質として、非特許文献１で示されている核酸長が20塩基の非ヒト由来のmiRNAであるcel-miR-39（配列番号６）、cel-miR-54（配列番号７）、ath-mir-159a（配列番号８）、cel-miR-238（配列番号９）を選択した。各miRNAについて、ユーロフィンジェノミクス社で5'末端にリン酸基修飾をいれたRNAとして合成を行った。また、ユーロフィンジェノミクス社から販売されている非生物由来であり核酸長が60塩基である5種類のRNA、H2NC000001（配列番号１０）、H2NC000002（配列番号１１）、H2NC000003（配列番号１２）、H2NC000005（配列番号１３）、H2NC000006（配列番号１４）を使用した。
各標準物質の物理的性質等を表１に示す。使用した全ての標準物質について、公共データベースBLASTに収録されている全てのヒト遺伝子転写産物に対して、配列相同性が50％以下であることを確認した。
（捕捉プローブの設計）
標的小型RNAとして、miRBaseリリース19から入手した2555種のヒトmiRNAを選択し、その相補配列を有するDNAを標的小型RNA捕捉プローブとして用いた（http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml）。
標的小型RNAとして、miRBaseリリース19から入手した2555種のヒトmiRNAを選択し、その相補配列を有するDNAを標的小型RNA捕捉プローブとして用いた（http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml）。
実施例用の標準核酸物質捕捉プローブとしては、上記RNA500-A、RNA500-B、RNA500-C、RNA1000-A、RNA1000-B、hsncs_071028、hsncs_404161、hsncs_647981の配列の相補配列を有するDNAを用いた。
また、比較例用の標準物質捕捉プローブとしては、miRBaseから入手したcel-miR-39（22塩基）、cel-miR-54（24塩基）、ath-mir-159a（21塩基）、cel-miR-238（23塩基）の相補配列を有するDNAを用いた。また、市販の上記5種類のRNA（H2NC000001、H2NC000002、H2NC000003、H2NC000005、H2NC000006）の相補配列を有するDNAを用いた。
上記の標的小型RNA捕捉プローブ及び標準核酸物質の捕捉プローブは、3'末端にアミノ基を導入した合成DNA（ユーロフィンジェノミクス社にて委託合成）を使用した。
（DNAマイクロアレイの作製）
3'末端にアミノ基を導入した上記2555種の標的小型RNA（miRNA）捕捉プローブ及び全17種の標準物質捕捉プローブを、東レ株式会社製の「3D-Gene」（登録商標）基板（3000柱基板）の凸部に固定化し、DNAマイクロアレイを作製した。なお、標準物質捕捉プローブは各8点で固定を行った。このDNAマイクロアレイを用いて以下の実験を行なった。
（DNAマイクロアレイの作製）
3'末端にアミノ基を導入した上記2555種の標的小型RNA（miRNA）捕捉プローブ及び全17種の標準物質捕捉プローブを、東レ株式会社製の「3D-Gene」（登録商標）基板（3000柱基板）の凸部に固定化し、DNAマイクロアレイを作製した。なお、標準物質捕捉プローブは各8点で固定を行った。このDNAマイクロアレイを用いて以下の実験を行なった。
（血清検体への標準物質の添加と核酸の抽出工程）
血清検体300μLに対し、RNA抽出試薬である3D-Gene RNA extraction reagent from liquid sample（東レ）を900μL混合し、実施例においては、上記した実施例用の標準物質であるRNA500-A、RNA500-B、RNA500-C、RNA1000-A、RNA1000-B、hsncs_071028、hsncs_404161及びhsncs_647981のうちの少なくとも１種を各10fmol添加し、比較例においては、上記した比較例用標準物質であるcel-miR-39、cel-miR-54、ath-mir-159a、cel-miR-238、H2NC000001、H2NC000002、H2NC000003、H2NC000005及びH2NC000006のうちの少なくとも１種を各10fmol添加し、遠心分離操作により、上層の水層を回収し、miRNeasy mini kit（キアゲン社）を用いてRNAを精製した。
血清検体300μLに対し、RNA抽出試薬である3D-Gene RNA extraction reagent from liquid sample（東レ）を900μL混合し、実施例においては、上記した実施例用の標準物質であるRNA500-A、RNA500-B、RNA500-C、RNA1000-A、RNA1000-B、hsncs_071028、hsncs_404161及びhsncs_647981のうちの少なくとも１種を各10fmol添加し、比較例においては、上記した比較例用標準物質であるcel-miR-39、cel-miR-54、ath-mir-159a、cel-miR-238、H2NC000001、H2NC000002、H2NC000003、H2NC000005及びH2NC000006のうちの少なくとも１種を各10fmol添加し、遠心分離操作により、上層の水層を回収し、miRNeasy mini kit（キアゲン社）を用いてRNAを精製した。
（DNAマイクロアレイによる標的小型RNA（miRNA）の発現量及び標準物質の抽出量の測定工程）
得られた標的小型RNA（miRNA）を、3D-Gene miRNA labeling kit（東レ）を用いて標識した。標識したmiRNAは、3D-Gene miRNA chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナ（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を42％にした。
得られた標的小型RNA（miRNA）を、3D-Gene miRNA labeling kit（東レ）を用いて標識した。標識したmiRNAは、3D-Gene miRNA chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナ（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を42％にした。
＜実施例１＞
上記の手順に従って、配列番号１〜５で示される実施例用標準物質（５種全て）又は配列番号１５〜１７で示される実施例用標準物質（３種全て）を市販の血清検体300μLに添加し、核酸の抽出工程、及びDNAマイクロアレイによる標的小型RNA（miRNA）の発現量及び標準物質の存在量の測定工程を実施した。以上の工程は、その測定実験間での発現量の測定値の変動（ばらつき）を補正する効果を比較するために、10回繰り返して行った。
上記の手順に従って、配列番号１〜５で示される実施例用標準物質（５種全て）又は配列番号１５〜１７で示される実施例用標準物質（３種全て）を市販の血清検体300μLに添加し、核酸の抽出工程、及びDNAマイクロアレイによる標的小型RNA（miRNA）の発現量及び標準物質の存在量の測定工程を実施した。以上の工程は、その測定実験間での発現量の測定値の変動（ばらつき）を補正する効果を比較するために、10回繰り返して行った。
その結果、2555種のmiRNAのうち約1000種類のmiRNAが検出された。この検出された約1000種類の各miRNAの発現量の10回の測定実験間におけるCV値（変動係数）の、検出された約1000種類のmiRNA全体での中央値は、補正前において0.45であった。
各miRNAの発現量の補正は、以下のように行った。まず、各回の実験における各標準物質の存在量を、DNAマイクロアレイ上の8点の測定値の平均値として求め、これを代表値として算出した。次に、１回目の実験における標準物質の代表値を基準値とし、２〜１０回目の実験の代表値との比を補正係数として取得した。この補正係数を用いて２〜１０回目の実験におけるmiRNAの発現量の測定値の補正を実施した。その結果、補正後において、各miRNAの発現量の１０回の測定実験間におけるCV値の、検出された約1000種類のmiRNA全体での中央値は、それぞれ0.32（配列番号１）、0.40（配列番号２）、0.40（配列番号３）、0.38（配列番号４）、0.30（配列番号５）、0.41（配列番号１５）、0.36（配列番号１６）、0.39（配列番号１７）であった。
＜比較例１＞
標準物質として、配列番号１〜５で示される実施例用標準物質の代わりに、配列番号６〜１４で示される比較例用の標準物質９種を使用して、実施例１と同様の実験を行った。
標準物質として、配列番号１〜５で示される実施例用標準物質の代わりに、配列番号６〜１４で示される比較例用の標準物質９種を使用して、実施例１と同様の実験を行った。
補正前における、検出された約1000種類の各miRNAの発現量のCV値の中央値は0.45であった。
補正後における、各miRNAの発現量のCV値の中央値は、それぞれ1.07（配列番号６）、1.14（配列番号７）、0.98（配列番号８）、0.99（配列番号９）、0.94（配列番号１０）、0.95（配列番号１１）、0.84（配列番号１２）、0.82（配列番号１３）、0.88（配列番号１４）であった。
以上のとおり、実施例１では補正後の標的小型RNAの検出値のCV値の中央値が補正前の0.45より小さくなったのに対し、比較例１では補正前の0.45より大きくなった。すなわち、同一の検体を使用して核酸の抽出からDNAマイクロアレイ実験までを同一条件で複数回行った実験におけるその実験間での発現量の変動（ばらつき）の補正において、比較例１に比べて、実施例１で使用した標準物質を用いて補正を行うことにより、補正の正確性が向上することが示された。
＜実施例２＞
3人のヒトから採取した血清Ａ〜Ｃの３種類を用い、標準物質として配列番号１〜５で示される実施例用標準物質を使用し、各血清に対して核酸の抽出日と実験者が異なる条件で各２回（１回目、２回目）ずつ、上記の手順で血清検体への標準物質の添加と核酸の抽出工程ならびにDNAマイクロアレイによる標的小型RNAの発現量及び標準物質の存在量の測定工程を行った。標的小型RNA（miRNA）としては、実施例１と同じく、検出された約1000種類のmiRNAを用いた。
3人のヒトから採取した血清Ａ〜Ｃの３種類を用い、標準物質として配列番号１〜５で示される実施例用標準物質を使用し、各血清に対して核酸の抽出日と実験者が異なる条件で各２回（１回目、２回目）ずつ、上記の手順で血清検体への標準物質の添加と核酸の抽出工程ならびにDNAマイクロアレイによる標的小型RNAの発現量及び標準物質の存在量の測定工程を行った。標的小型RNA（miRNA）としては、実施例１と同じく、検出された約1000種類のmiRNAを用いた。
標的小型RNAである各miRNAの測定値の補正は、以下のように行った。
まず、測定工程で得られた各標準物質の存在量を、DNAマイクロアレイ上の8点の測定値の平均値として算出し、これを底が2の対数値に変換した。次に、得られた５種の標準物質の対数変換値の平均値を算出し、これを代表値とした。以上のようにして、各血清Ａ〜Ｃについて、１回目及び２回目の代表値を算出した。各標準物質の対数変換値及びその平均値（代表値）を表２に示す。
血清Ａ〜Ｃの2回の実験間の各miRNAの発現量の補正は、１回目の代表値を基準値とし、２回目の代表値との差（２回目−１回目）を、各血清における補正係数とした（表３）。
次に、各血清におけるmiRNAの発現量の測定値を、それぞれ底が2の対数に変換し、各血清の２回目の対数変換値から上記の各血清における補正係数を減算して補正を実施した。
以上の操作により、２回目の実験のmiRNAの発現量の測定値の補正が実施された。
以上の操作により、２回目の実験のmiRNAの発現量の測定値の補正が実施された。
＜実施例３＞
標準物質として配列番号１５〜１７で示される実施例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
標準物質として配列番号１５〜１７で示される実施例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
＜比較例２＞
標準物質として配列番号６〜９で示される比較例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
標準物質として配列番号６〜９で示される比較例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
＜比較例３＞
標準物質として配列番号１０〜１４で示される比較例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
標準物質として配列番号１０〜１４で示される比較例用標準物質を使用して、実施例２と同様の実験を実施した。
実施例２、実施例３、比較例２、比較例３の各実験に関して1回目（基準検体）の標的小型RNAの発現量の測定値と2回目（補正される検体）の補正したmiRNAの発現量の測定値の回帰直線を計算した結果を表４に、また、横軸に１回目（基準検体、補正無し）、縦軸に２回目（補正される検体、補正有り）の発現量をプロットしたスキャッタープロット（血清A）を図４（（Ａ）：実施例２の補正の結果、（Ｂ）：比較例２の補正の結果）に示した。
１回目と２回目の実験は同一の血清を使用しているため、本来、両者の結果（１回目の検体の結果と補正を受けた２回目の検体の結果）は一致するはずであり、その場合、回帰直線はｙ＝ｘの直線上に重なるはずである。実施例２、３と比較例２、３を比べると、いずれもその傾きは同一であった。しかし、実施例２、３では切片の絶対値が＜0.5でありｙ＝ｘの直線にほぼ重なる結果が得られたのに対し、比較例２、３では切片の絶対値が＞0.5であり、ｙ＝ｘの直線からは大きく外れた。
以上のように、実施例２、３では、２回の測定実験間において、回帰直線の切片の絶対値が0でｙ＝ｘに近い補正データが得られており、補正後のデータの正確性が高いことが示されていると言える。一方、比較例２、３では、回帰直線の切片の絶対値が0.5より大きく、補正後のデータの正確性が低いことが示されているといえる。
以上の実施例１〜３及び比較例１〜３で確認されたとおり、本発明の補正方法を用いることにより、複数の検体に含まれる標的小型RNAの発現量を比較解析するための正確なデータを得ることができ、標的小型RNAの発現量の正確な解析が可能になる。
１０ 解析装置
１１０ 入力部
１２０ 表示部
１３０ 出力部
１４０ 記憶部
１５０ 制御部
１６０ 変換部
１７０ 解析部
１１０ 入力部
１２０ 表示部
１３０ 出力部
１４０ 記憶部
１５０ 制御部
１６０ 変換部
１７０ 解析部
Claims (19)
- 複数の検体における標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正方法であって、
前記複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出して核酸試料を得る抽出工程；
抽出された各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程；
を含む、補正方法。 - 標準物質の核酸長が200塩基以上1200塩基以下である請求項１に記載の補正方法。
- ２種類以上の標準物質を用いる、請求項１又は２に記載の補正方法。
- 検体が体液由来検体である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の補正方法。
- 標的小型RNAがmiRNAである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の補正方法。
- 前記抽出工程における核酸試料の抽出が、フェノール・クロロホルム法により行なわれる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の補正方法。
- 前記測定工程が、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値として得ることを含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の補正方法。
- 前記代表値取得工程で取得される代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の補正方法。
- 前記基準値は、標準物質の抽出量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の検体から任意に選択された第１の検体について取得された標準物質抽出量の代表値である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の補正方法。
- 前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。 - 複数の検体における標的小型RNAの発現量を比較解析するために発現量を補正する装置であって、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段と；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段と
を含む、前記装置。 - 前記代表値が、少なくとも１種の標準物質抽出量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、請求項１１に記載の装置。
- 標的小型RNAがmiRNAである請求項１１又は１２に記載の装置。
- 前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的小型RNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載の装置。 - 前記記憶手段に記憶される、複数の検体における標的小型RNAの発現量及び標準物質抽出量の測定値は、標識物質で標識された核酸試料を、支持体上に固定化された複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブ及び少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブと接触させてハイブリダイゼーションを行ない、各標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定した値である、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の装置。
- 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターに、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて、各核酸試料中に存在する標的小型RNA及び標準物質の量をそれぞれ測定し、各検体について標的小型RNAの発現量及び標準物質の抽出量の測定値を得る、測定工程；
各検体について、標準物質の抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各検体の標準物質の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数として取得する、補正係数取得工程；及び
取得された各補正係数をそれぞれ用いて、各検体について測定された標的小型RNAの発現量を補正する補正工程
を実行させるためのプログラム。 - 複数の検体間で標的小型RNAの発現量を比較解析するための発現量の補正をするために、１又は複数のコンピューターを、
複数の各検体に、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種を含む、核酸長が200塩基以上の核酸である少なくとも１種の標準物質を加えた後、各検体から核酸を抽出することにより得られた核酸試料を用いて測定された、各検体についての標的小型RNA発現量及び標準物質抽出量の測定値を記憶する記憶手段；
各検体について、標準物質抽出量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
標準物質の抽出量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各検体の代表値との差又は比を、各検体のための標的小型RNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；及び
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各検体において測定された標的小型RNAの発現量の補正を行なう、補正手段
として機能させるためのプログラム。 - 請求項１６又は１７に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
- 複数の標的小型RNAを捕捉するためのプローブと、配列番号１〜５及び１５〜１７に示す塩基配列の核酸である標準物質から選択される少なくとも１種の標準物質を捕捉するためのプローブとが固定化された支持体を含む、小型RNA発現解析用チップ。
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