KR20170081169A

KR20170081169A - 소형 rna의 발현량의 보정 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20170081169A
Application number: KR1020177010333A
Authority: KR
Inventors: 사토시 콘도우; 사토코 코조노
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-07-11
Also published as: WO2016084848A1; BR112017009009A2; US10622093B2; EP3225689A4; EP3225689B1; JP6705171B2; JPWO2016084848A1; US20170351809A1; EP3225689A1; CN107109397A; KR102380453B1; CN107109397B; CA2974433C; CA2974433A1

Abstract

복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위해서 표준 물질을 이용해서 상기 발현량의 측정값을 정확하게 보정할 수 있는 수단이 개시되어 있다. 본 발명에 의한 소형 RNA의 발현량의 보정 방법에서는 핵산 길이가 200염기 이상인 핵산을 표준 물질로서 사용한다. 일정량의 상기 표준 물질을 일정량의 각 검체에 첨가하고, 검체로부터 핵산의 추출을 행하고, 추출된 각 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 측정하고, 표준 물질의 추출량의 측정값을 이용해서 표적 소형 RNA의 발현량을 보정한다. 본 발명에 의하면, 종래법보다 정확하게 각 검체간에 있어서의 소형 RNA의 발현량의 보정을 행할 수 있다.

Description

소형 RNA의 발현량의 보정 방법 및 장치{METHOD AND DEVICE FOR CORRECTING LEVEL OF EXPRESSION OF SMALL RNA}

본 발명은 복수의 검체에 포함되는 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량을 보정하는 방법 및 상기 발현량을 보정하는 장치에 관한 것이다.

non-coding RNA(ncRNA)란, 단백질을 코드하지 않는 RNA의 총칭이며, 하우스키핑 RNA와 조절계의 RNA로 크게 나뉘어진다. 여러가지 길이의 ncRNA가 있고, 특히 200염기미만의 분자는 소형 RNA(small RNA)라고 불려지고 있다.

하우스키핑 RNA로서는 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA), 스플라이싱에 관여하는 핵내 저분자 RNA(snRNA), rRNA의 수식에 관여하는 핵소체 저분자 RNA(snoRNA) 등이 알려져 있다.

조절계 RNA에 대해서는 생체기능의 해명에 중요한 기능을 하고 있는 인자로서, 최근 특히 주목을 모으고 있는 것이며, 유전자 발현이나 RNA의 세포내 분포를 조절해서 유전자 발현 억제 기구에 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 최근되어 밝혀지게 되었다. 이 조절계 RNA가 기능하는 유전자 발현 억제 기구는 RNA 간섭(RNAi)이라고 불리며, 1988년에 선충을 사용한 실험에서 밝혀지게 되었으며, 그 후에 초파리나 포유류 세포에서도 같은 기구의 존재가 밝혀지게 되었다. 이 조절계 RNA로서의 ncRNA는 쇄 길이가 약 20∼25염기이며, 그 작용 기서는 마이크로 RNA(miRNA)에 의한 번역 억제와, small interference RNA(siRNA)에 의한 표적 mRNA의 절단 및 표적 DNA 영역의 헤테로크로마틴화를 통한 유전자 사일렌싱으로 크게 나뉘어진다.

miRNA는 게놈 DNA로부터 헤어핀형상 구조의 RNA(전구체)로서 전사되어 온다. 이 전구체는 특정 효소 RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소(Drosha, Dicer)에 의해 절단된 후, 이중쇄의 형태로 변화되고, 그 후 단일쇄가 된다. 그리고, 한쪽의 안티센스쇄가 RISC라고 불리는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여한다고 여겨지고 있다. 이렇게, miRNA는 전사후, 각 단계에 있어서 그 형태는 다르기 때문에, 통상, miRNA를 표적(검출 대상)으로 하는 경우에는 헤어핀 구조체, 이중쇄 구조체, 단일쇄 구조체 등의 각종 형태를 고려할 필요가 있다. miRNA는 15∼25염기의 RNA로 이루어지고, 여러가지 생물로 그 존재가 확인되었다.

최근, miRNA는 세포내 뿐만 아니라, 세포를 포함하지 않는 검체(생체 시료)인 혈청, 혈장, 뇨, 척수액 등의 체액에도 많이 존재하고, 그 발현량이 암을 비롯한 여러가지 질환의 바이오마커가 될 가능성이 시사되어 있다. miRNA는 2014년 6월 현재, 인간에서 2500종이상이 존재하고(miRBase Release 20), 고감도인 DNA 마이크로 어레이 등의 측정계를 이용했을 경우, 이 중 1000종을 초과하는 miRNA가 혈청·혈장 중에서 발현을 동시에 검출하는 것이 가능하다. 그래서, DNA 마이크로 어레이법을 이용하여 혈청·혈장, 뇨, 척수액 등의 체액을 대상으로 한 바이오 마커 탐색 연구가 실시되어 있다.

DNA 마이크로 어레이를 이용하여 유전자 발현 해석을 행하는 경우에는 검체나 실험자, 실험 조건에 의해, 얻어지는 측정값(데이터)에 오차가 생기는 것은 잘 알려져 있다. 그 때문에 오차를 보정하기 위한 측정값의 보정 방법이 고안되어 있다. 보정에는 어떠한 검체이어도 복수의 유전자의 발현량의 측정값을 한 덩어리로 해서 유전자 발현 데이터군으로서 취한 경우에는 발현량에 차가 없다는 원리를 전제로 한 방법이 통상 잘 사용되어지고 있으며, 글로벌 노멀라이제이션법, quantile법, lowess법, 75 percentile법 등이다. 단, 이들의 보정 방법은 어떤 일정한 수이상 망라적으로 유전자를 검출했을 경우에밖에 사용할 수 없다고 하는 결점이 있다.

한편, 검체간에서 발현량이 동일한 특정 유전자(베타 엑틴이나 GAPDH 등)에 착안해서 그 유전자의 측정값이 일정해지도록 검체마다 데이터를 보정하는 방법도 행해지고 있다.

소형 RNA를 DNA 마이크로 어레이에 의해 해석하는 경우에도, 상기와 같은 유전자 발현 해석에서 사용되는 글로벌 노멀라이제이션법, quantile법, lowess법, 75 percentile법이라는 보정 방법이 사용되고 있지만, 특정 유전자밖에 검출하지 않는 경우에는 이들의 방법은 사용할 수 없다. 한편 특정 유전자의 발현량이 일정해지도록 보정하는 방법으로서 검체로 발현되고 있는 소형 RNA 중, 하우스키핑 RNA(U1snoRNA, U2snoRNA, U3snoRNA, U4snoRNA, U5snoRNA, U6snoRNA, 5SrRNA, 5.8SrRNA)를 이용하여 보정하는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).

특허문헌 1, 특허문헌 2에서는 소형 RNA인 miRNA를 검출할 때, 동시에 검출한 5SrRNA의 검출값이 모든 검체에서 일정하게 되도록 miRNA의 검출 결과를 보정하고 있지만, 이들이 검체간에서 일정량 발현하고 있다고 하는 보증은 없다

또한 특허문헌 3에서는 소형 RNA인 miRNA를 검출할 때, 동시에 mRNA를 검출하고, 그 대표값으로 miRNA의 검출 결과를 보정하고 있지만, 이 방법도 검출한 mRNA의 정규분포가 보증되는 어떤 일정한 수이상의 수의 mRNA를 검출하는 경우에 적용할 수 있는 방법이다.

이 때문에, 실험간의 유전자 발현량의 오차를 보정하기 위해서, 핵산인 표준 물질을 실험의 공정에서 사용하고, 그 검출한 존재량을 사용해서 실험간의 오차를 보정하는 것이 제안되어 있다(특허문헌 4∼6). 특허문헌 4, 5는 핵산인 표준 물질 또는 그 표준 물질을 검출하는 프로브 핵산의 서열이나 설계 방법을 제시하고, 그 증폭 공정이나 검출 공정에서의 정밀도는 나타내어져 있으며, 이들에 의해 검출 방법의 성능의 평가를 행할 수는 있지만, 실제로 검체로부터의 핵산의 추출 공정을 포함하는 실험간의 오차의 보정을 행하는 것은 나타내어져 있지 않다. 또한 특허문헌 6도 검체중의 유전자 발현의 검출값의 오차를 보정하기 위한 핵산인 표준 물질의 서열을 나타내고 있지만, 이 서열을 핵산의 증폭 공정으로부터 사용하고 있고, 증폭 공정의 실험간의 오차를 보정할 수 있을 뿐이다.

즉, 상기 특허문헌 4∼6으로 나타내어져 있는 방법은 검체로부터 추출된 핵산이 충분량 있고, 사용하는 핵산을 정밀도 좋게 정량할 수 있는 경우에만, 핵산의 증폭이나 검출을 포함한 측정 공정의 정밀도의 평가나 오차의 보정이 가능하지만, 실제의 실험간의 측정 결과의 보정을 행할 경우, 특히 미량의 검체를 취급할 경우나 검체로서 체액을 취급할 경우에는 추출되는 표적 소형 RNA량이 매우 미량으로 되고, 이 소형 RNA량을 정밀도 좋게 측정할 수 없기 때문에, 실질적으로 이러한 방법으로 보정을 행하는 것이 불가능하게 된다. 이 때문에, 소형 RNA의 검출 공정 뿐만 아니라, 검체로부터의 추출 공정도 포함한 실험간의 오차를 보정하는 것이 매우 중요하게 된다.

이 때문에, 검체로부터의 추출 공정도 포함한 실험간의 오차를 평가·보정하는 방법으로서 표준 물질을 사용하는 방법이 검토되어지고 있으며, 지금까지, 소형 RNA와 동일한 염기 길이의 핵산인 표준 물질을 사용해서 보정을 행하는 것이 검토되어 왔다. 예를 들면 비특허문헌 1에서 나타내어지고 있는 miRNA와 동일한 염기 길이인 20염기 정도의 짧은 RNA를 표준 물질로서 사용하고, 이것을 검체에 일정량 투입해서 추출을 행하고, 각 실험의 추출 공정에 있어서의 표적 소형 RNA의 추출 공정의 오차를 보정하는 방법이 제안되어 있다.

일본 특허공개 2007-75095호 공보 일본 특허공개 2007-97429호 공보 일본 특허공개 2014-007995호 공보 일본 특허공개 2011-239708호 공보 일본 특허 제5229895호 공보 미국 특허 출원공개 제 2010/0184608호 명세서

Nobuyuki Kosaka Edit., 「Circulating MicroRNAs : Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)」, p1-p10, Human Press, New York(2013)

검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석할 때는 검체간에서의 실험 조건의 오차, 특히 검체로부터 핵산을 추출하는 공정에 있어서의 추출 효율의 차를 보정할 필요가 있다. 지금까지 자주 사용되어 온 방법으로서, 글로벌 노멀라이제이션이나 하우스키핑 RNA를 사용하는 방법이 있지만, 상기한 바와 같이 소형 RNA에 대해서는 망라적으로 수많은 소형 RNA를 검출할 필요가 있는, 검체간에서 일정량의 발현을 보증하는 하우스키핑 RNA가 존재하지 않는 등 결점이 있고, 비교 해석에 있어서 유효하다고는 할 수 없다.

또한 표준 물질을 사용하는 보정 방법에 대해서는 상기한 바와 같이, 표적으로 하는 소형 RNA와 동일한 염기 길이의 핵산인 표준 물질을 사용해서 보정을 행하는 것이 검토되어 왔지만, 실제로 이들의 소형 RNA와 동일한 염기 길이의 RNA를 표준 물질로서 사용하면, 특히 검체로서 체액을 사용할 경우에는 검체의 각종 조건이나 그것에 포함되는 각종 협잡물의 영향에 의해, 검체로부터의 표준 물질의 추출 효율이 안정되지 않아 결과적으로 측정값이 안정되지 않게 되고, 정밀도를 보증할 수 없으므로, 실험간의 측정 결과의 보정에는 사용할 수 없었다.

이상과 같이, 지금까지는 각 검체로부터 추출된 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한, 정확하게 검체간에 있어서의 발현량의 측정값을 보정할 수 있는, 표준 물질을 이용하는 유효한 보정 방법은 없었다.

본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 복수의 검체에 포함되는 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정 방법에 있어서, 복수의 검체 일정량에 대해서 핵산 길이가 소형 RNA보다 상당히 긴 200염기이상의 핵산인 표준 물질을 검체에 추가하고, 검체로부터 핵산의 추출을 행하고, 추출된 각 표적 소형 RNA의 발현량과 함께 표준 물질의 존재량의 측정을 행하고, 표준 물질의 존재량의 측정값을 이용하여 보정을 행함으로써, 종래보다 정확하게 각 검체간에 있어서의 발현량의 보정을 행할 수 있는 것을 찾아내어, 이하의 발명을 완성시켰다.

(1)복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정 방법으로서,

상기 복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출해서 핵산 시료를 얻는 추출 공정;

추출된 각 핵산 시료중에 존재하는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 각각 측정하고, 각 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정값을 얻는, 측정 공정;

각 검체에 대해서 표준 물질의 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는, 대표값 취득 공정;

표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 대표값 취득 공정에서 취득된 각 검체의 표준 물질의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 취득하는, 보정 계수 취득 공정;

취득된 각 보정 계수를 각각 사용해서 각 검체에 대해서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량을 보정하는 보정 공정;

을 포함하는, 보정 방법.

(2)표준 물질의 핵산 길이가 200염기이상 1200염기이하인 (1)에 기재된 보정 방법.

(3)적어도 1종의 표준 물질이 서열 번호 1∼5 및 15∼17에 나타내는 염기서열의 핵산인 표준 물질로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, (2)에 기재된 보정 방법.

(4)2종류이상의 표준 물질을 사용하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(5)검체가 체액 유래 검체인 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(6)표적 소형 RNA가 miRNA인 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(7)상기 추출 공정에 있어서의 핵산 시료의 추출이 페놀·클로로포름법에 의해 행해지는, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(8)상기 측정 공정이 표지 물질로 표지된 핵산 시료를 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브 및 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브와 접촉시켜서 하이브리다이제이션을 행하고, 각 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량을 시그널 강도 측정값으로서 얻는 것을 포함하는, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(9)상기 대표값 취득 공정에서 취득되는 대표값이 적어도 1종의 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 산출된 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값인, (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(10)상기 기준값은 표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 정해진 고정 수치, 또는 상기 복수의 검체로부터 임의로 선택된 제 1 검체에 대해서 취득된 표준 물질 추출량의 대표값인, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 보정 방법.

(11)상기 보정 공정에서는,

(a)상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 대표값으로부터 상기 기준값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값으로부터 보정 계수를 감산하는 것,

(b)상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 기준값으로부터 상기 대표값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 가산하는 것,

(c)상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 대표값을 상기 기준값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값을 보정 계수로 제산하는 것, 또는

(d)상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 기준값을 상기 대표값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 승산하는 것,

에 의해 상기 보정을 행하는, (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(12)복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위해서 발현량을 보정하는 장치로서,

복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용하여 측정된 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단과;

각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는, 대표값 취득 수단과;

표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 상기 대표값 취득 수단에 의해 취득된 각 검체의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 각각 취득하는, 보정 계수 취득 수단과;

상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 보정 계수를 이용하여 상기 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는, 보정 수단

을 포함하는, 상기 장치.

(13)상기 대표값이 적어도 1종의 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 산출된, 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값인, (12)에 기재된 장치.

(14)표적 소형 RNA가 miRNA인 (12) 또는 (13)에 기재된 장치.

(15)상기 보정 수단은,

(a)상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 대표값으로부터 상기 기준값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값으로부터 보정 계수를 감산하는 것,

(b)상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 기준값으로부터 상기 대표값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 가산하는 것,

(c)상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 대표값을 상기 기준값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값을 보정 계수로 제산하는 것, 또는

(d)상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 기준값을 상기 대표값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 승산하는 것,

에 의해 상기 보정을 행하는, (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 장치.

(16)상기 기억 수단에 기억되는 복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값은 표지 물질로 표지된 핵산 시료를, 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브 및 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브와 접촉시켜서 하이브리다이제이션을 행하고, 각 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량을 시그널 강도 측정값으로서 각각 측정한 값인, (12) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 장치.

(17)복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정을 하기 위해서 하나 또는 복수의 컴퓨터에,

복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용해서 각 핵산 시료중에 존재하는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 각각 측정하고, 각 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정값을 얻는, 측정 공정;

표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 대표값 취득 공정에서 취득된 각 검체의 표준 물질의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 취득하는, 보정 계수 취득 공정; 및

취득된 각 보정 계수를 각각 사용해서 각 검체에 대해서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량을 보정하는 보정 공정

을 실행시키기 위한 프로그램.

(18)복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정을 하기 위해서 1개 또는 복수의 컴퓨터를,

복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용하여 측정된, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단;

각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는 대표값 취득 수단;

표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 상기 대표값 취득 수단에 의해 취득된 각 검체의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단; 및

상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 보정 계수를 이용하여 상기 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단

으로서 기능시키기 위한 프로그램.

(19)(17) 또는 (18)에 기재된 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.

(20)복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브와, 서열 번호 1∼5 및 15∼17에 나타내는 염기서열의 핵산인 표준 물질로부터 선택되는 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브가 고정화된 지지체를 포함하는 소형 RNA 발현 해석용 칩.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면, 검체로부터 추출된 소형 RNA의 발현량을 측정하고, 검체간에서 소형 RNA 발현량을 비교할 때에, 종래보다 정확하게 표적 소형 RNA 발현량을 보정할 수 있다. 이에 따라 검체간에서의 표적 소형 RNA의 비교 해석을 보다 정확하게 실시할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명의 방법의 개념도이다.
도 2는 본 발명의 해석 장치의 구성의 개략을 나타내는 블럭도이다.
도 3은 본 발명에 의한 표적 소형 RNA 발현량의 보정처리의 플로챠트의 일례이다.
도 4(A)는 실시예 2의 보정을 행한 후의 스캐터 플롯도, 및 (B)비교예 2의 보정을 행한 후의 스캐터 플롯도이다.

본 발명에서 말하는 표준 물질은 추출 공정으로부터 측정 공정에 있어서, 표적 소형 RNA를 포함하는 검체에 안정적으로 공존시켜 목적으로 하는 소형 RNA의 발현량의 측정과 함께 그 표준 물질의 존재량의 측정을 행함으로써, 복수의 검체의 측정간에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값의 변동(측정간에서의 편차 또는 오차)을 보정하기 위한 기준을 얻기 위해서 사용되는 물질이다. 즉, 표준 물질의 존재량을 기준으로 해서 복수의 검체의 측정간에서의 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값을 보정할 수 있다.

우선, 본 발명 표준 물질을 사용한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정 방법의 개념에 대해서 도 1에 의거하여 설명한다.

도 1에서는 검체로부터 추출한 핵산을 표지하고, 복수 종류의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브(이하, 「소형 RNA 포착 프로브」라고도 한다.) 및 표준 물질을 포착하기 위한 프로브(이하, 「표준 물질 포착 프로브」라고도 한다.)가 고정된 마이크로 어레이로 검출한 결과를 시그널값의 히스토그램에 의해 모식적으로 나타내고 있다. 이하, 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브 또는 표준 물질을 포착하기 위한 프로브를 총칭해서 「포착 프로브」 또는 간단히 「프로브」라고도 한다.

도 1A에서는 검체 A 및 검체 B로부터 추출한 표적 소형 RNA를, 각각 DNA 마이크로 어레이를 이용하여 해석한 결과를 히스토그램으로 나타내고 있다. 마이크로 어레이에 탑재되어 있는 복수의 표적 소형 RNA 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 분포(히스토그램), 및 복수의 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 대표값을 각각 나타내고 있다. 검체 A와 검체 B에서는 소형 RNA의 히스토그램이 크게 어긋나 있다. 이 점에서, 검체간에서 소형 RNA의 발현량에 큰 차가 있다고 해석할 수 있다. 한편, 실험 오차, 특히 검체로부터의 핵산 추출 공정에 있어서의 핵산 추출 효율에 의해 차가 생겼다고도 해석할 수 있다. 어느 쪽이 옳은지, 히스토그램만으로부터 판단할 수는 없다.

도 1A에서 나타낸, 핵산인 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 대표값은 검체 A와 검체 B에서 거의 같은 값을 나타내고 있다. 즉, 검체 A와 검체 B는 바르게 실험에 제공되고, 실험 오차는 없다고 판단할 수 있다. 이 경우에는 검체 AB간에서 소형 RNA의 발현량에 큰 차가 있다고 하게 되며, 검체간에서의 비교를 함에 있어서 소형 RNA의 측정값의 보정은 불필요하다.

도 1B에서는 DNA 마이크로 어레이를 이용하여 검체 C 및 검체 D를 해석한 결과를 모식적으로 나타내고 있다. 소형 RNA 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 히스토그램, 및 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 대표값을 각각 나타내고 있다.

검체 C와 검체 D에서는 소형 RNA의 측정값의 히스토그램이 같은 분포를 나타내고 있다. 한편, 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 대표값은 검체 C와 검체 D에서는 크게 어긋나 있다. 이 점으로부터 검체 C와 검체 D의 검출 결과에는 어떠한 원인에 의해 실험 오차가 발생했다는 것을 알 수 있다. 이러한 경우에는 검체 CD간에서의 비교를 함에 있어서 소형 RNA의 측정값을 적절하게 보정할 필요가 있다.

본 발명에 따라, 표적 소형 RNA의 측정값을 보정한 후의 히스토그램을 도 1C에 나타냈다. 보정의 구체적인 방법은 후술과 같다. 검체 C와 검체 D의 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값이 일치하도록 검체 C의 데이터를 보정했다. 이 보정에 의해, 표준 물질 포착 프로브로부터 얻어진 측정값의 대표값은 검체 C와 검체 D에서 일치하게 되고, 같은 보정 계수를 이용하여 보정된 표적 소형 RNA 포착 프로브의 측정값의 히스토그램은 크게 어긋나게 된다. 즉, 검체 CD간에서도 소형 RNA의 발현량에는 큰 차가 있다고 하게 된다.

본 발명에서는 복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석(측정)한다. 검체수는 2개이어도 좋고, 3개이상이어도 좋다. 여기에서 말하는 복수의 검체간에서의 측정에는 다른 복수종의 표적 소형 RNA의 측정, 동일한 표적 소형 RNA를 복수회 측정하는 경우의 각 검체의 측정, 또는 그 양자를 조합한 측정이 포함된다.

본 발명에 있어서의 「소형 RNA」란, 생체내에서 만들어지는 염기 길이가 200염기미만의 RNA를 의미한다. 예를 들면 리보솜 RNA(5S rRNA, 5.8S rRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), small nuclear ribonucleoprotein particle RNA(snoRNA), small nuclear RNA(snRNA), 마이크로 RNA(miRNA)나, 프로세싱을 받기 전의 미성숙한 miRNA로서, 스템 루프상의 pre-miRNA나 이중쇄의 miRNA/miRNA duplex 등을 예시할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 바람직한 소형 RNA의 예로서는 miRNA를 들 수 있다.

<표준 물질>

본 발명에서는 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 추출 공정 및 측정 공정에 있어서, 표적 소형 RNA에 대해서 표준 물질이 일정 함량으로 존재한다. 특히, 추출 공정에 있어서, 핵산인 표준 물질이 표적 소형 RNA와 동일한 추출 효율로 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 표준 물질은 핵산이다. 그 핵산 길이는 표적으로 하는 소형 RNA보다 긴 200염기이상이며, 바람직하게는 200염기이상 1200염기이하, 보다 바람직하게는 500염기이상 1200염기이하이다. 일반적으로 단일쇄의 RNA는 핵산 길이가 200∼300염기이상이면, 쇄내에서 수소결합을 형성하기 쉬워져 물리적으로 안정화되거나, 각종 염이나 지질류, 단백질 등과 회합하거나 함으로써, 화학적으로도 보다 안정화된 상태를 유지할 수 있다. 한편, 핵산인 표준 물질의 핵산 길이가 200염기미만이면 검체로부터의 추출 효율이나 측정 결과가 추출시의 조건이나 검체의 조건, 검체에 포함되는 협잡물의 영향에 의해 실험간에서 크게 불규칙해서, 특히 소형 RNA와 다른 추출 효율로 추출되는 것이 우려된다.

또한 표준 물질은 이하 (1), (2)의 성질을 갖는 것이 바람직하다.

(1)GC 함율이 30∼70%의 범위인 것.

(2)Tm값이 10℃이상 95℃이하인 것.

이 중 (1)의 GC 함율은 사용하는 표준 물질의 염기서열에 있어서의 A, T, G, C 전체 염기중의 G, C의 존재 비율로부터 구할 수 있다. GC 함율이 높을수록 수소결합의 수가 증가하므로 핵산의 구조, 성질이 안정되는 경향이 있지만, 지나치게 높으면 측정시의 서열 특이성이 저하된다. 이 때문에, 표준 물질의 GC 함율은 30∼70%의 범위인 것이 바람직하고, 40∼60%의 범위인 것이 보다 바람직하다.

(2)의 Tm값은 표준 물질의 염기서열에 의거하여 최근접 염기쌍(Nearest Neighbor)법(PNAS, 1998, 95: 1460-1465) 등을 사용함으로써 산출할 수 있다. 일반적으로, Tm값이 높을수록 핵산의 구조 안정성이 높다고 말해지고 있으며, 표준 물질의 Tm값은 10℃이상 95℃이하인 것이 바람직하고, 30℃이상 95℃이하인 것이 보다 바람직하고, 86℃이상 95℃이하인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 표준 물질은 측정 공정을 고려하면, 사용하는 검체중에 포함되는 유전 전사 산물과 크로스 하이브리다이제이션하지 않는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 공공의 데이터 베이스에 수록되어 있는 표적 소형 RNA와 같은 생물종의 모든 유전자 전사 산물에 대해서 서열 상동성이 50%이하인 핵산을 상동성 검색 프로그램을 이용해서 선택할 수 있다. 여기에서, 상동성 검색 프로그램으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 FASTA, BLAST, Mega Blast라는 공공의 프로그램을 적용할 수 있다. 또한 공공의 데이터 베이스로서는 특별히 한정되지 않지만, 유전자 전사 산물의 서열 정보가 격납된 Genbank(NCBI), EMBL(EBI), Ensembl, miRbase 등의 데이터 베이스를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 표준 물질은 핵산의 유기화학 합성법을 적용하거나, 또는 표준 물질의 서열을 플러스미드 등에 장착한 벡터를 사용해서 대장균 등의 미생물의 숙주내에서 합성하는 방법이나, 표준 물질의 서열의 상류부에 T7 프로모터 등의 RNA 합성 효소를 인식할 수 있는 서열을 장착하고, T7 폴리메라아제 등의 효소에 의해 합성을 하는 방법 등의 생물학적 합성 방법을 적용해서 제작할 수 있다. 또한 분석 장치나 분석 방법의 타당성 평가나 정밀도 관리를 위한 기준으로서 이용할 수 있는 핵산 표준 물질이 공지이며, 시판품도 존재하므로, 그러한 공지의 것을 본 발명에 있어서도 표준 물질로서 사용할 수 있다.

표준 물질에는 단일쇄의 상태의 것 뿐만 아니라, 상보쇄와 함께 이중쇄가 형성된 것도 포함될 수 있다. 또한 표적이 되는 소형 RNA와 화학적인 성질과 일치시키는 것을 목적으로, 천연에 존재하는 핵산의 염기서열을 일부에 포함하고 있어도, 천연에 존재하지 않는 염기서열을 포함하고 있어도 좋다. 또한 동일한 염기서열이 복수회 반복된 또는 랜덤으로 복수회 배치된 서열이어도 좋고, 서열의 일부에 개시 코돈이나 시종 코돈을 포함하고 있어도 좋다. 또한 서열의 양측 또는 편측에 폴리A 등의 프라이머 사이트가 부여되어 있어도 좋다.

표준 물질은 DNA 또는 RNA인 것이 바람직하지만, PNA, LNA 등의 인공핵산 등의 핵산 유도체를 사용할 수도 있다. 여기에서, 핵산 유도체란 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드, 및 염기의 재구성, 이중결합의 포화, 탈아미노화, 산소분자의 유황분자에의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체를 의미한다. 또한 말단이 각종 관능기로 수식되어 있어도 좋고, 그러한 관능기로서 인산기나 아미노기, 티올기 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 표준 물질은 1종류를 사용해도 좋고, 복수종을 사용해도 좋다. 또한 단백질과 회합한 상태나 지질류로 형성된 베시크루에 내포된 상태에서 사용해도 좋다.

<검체>

본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 검체로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 골수액, 타액, 면봉채취액, 뇌척수액, 땀, 누액, 정액, 림프액, 관절액 등의 각종 조직액 또는 체액, 각종 조직, 세포의 동결 검체나 파라핀 포매 검체(FFPE) 또는 그 절편, 세포나 조직을 배양한 배양액 등, 생체로부터 분리된 검체, 즉 생체시료를 들 수 있다. 또한 각종 음식물 또는 그 희석물 등을 들 수 있다. 일정량의 검체에 일정량의 표준 물질을 첨가해서 사용하므로, 특히 체액인 것이 바람직하다. 또한 비교 해석하는 복수의 검체는 다른 조직에 유래하는 복수의 검체이어도 좋고, 다른 생체로부터 분리된 동일의 조직에 유래하는 복수의 검체이어도 좋고, 또한 동일 조직내의 다른 부위(예를 들면 종양 등의 병변부와 비병변부)에 유래하는 복수의 검체이어도 좋다.

<검체에의 표준 물질의 첨가>

본 발명의 방법에서는 검체의 일정량에 대해서 표준 물질을 일정량 첨가한다. 이 경우의 양의 단위에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니고, 무게이어도, 용적이어도 좋다. 또한 표준핵산의 용액을 일정량 첨가할 때에, 표준 물질의 용액의 일정량을 측정할 때의 단위는 중량, 용량, 몰수 등, 어떤 단위이어도 좋다. 표준 물질의 양을 측정하는 방법으로서는 흡광도 측정법, 전기영동법, 컬럼법, 캐필러리 전기영동법 등 기지의 각종 방법을 취할 수 있다.

핵산을 추출하기 전에 검체의 일정량에 대해서 표준 물질을 일정량 첨가한다. 본 발명에 있어서는 검체를 추출 용액에 혼합하고, 구아니디늄염 등에 의해 검체중에 존재할 수 있는 핵산 분해 효소를 실활한 후에, 표준 물질을 첨가하는 것이 바람직하고, RNA를 포함하는 용액을 분리하기 전에 첨가하는 것이 보다 바람직하다.

표준 물질은 검체에 대해서 용액상태로 첨가해도 건조된 고체상태로 첨가해도 좋지만, 정확하게 일정량 첨가하기 위해서는 용액상태로 첨가하는 것이 바람직하고, 수μL∼수백μL의 양으로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 용액으로 첨가할 경우, 통상 피펫을 사용하지만, μL 오더미만이면 정확하게 칭량하는 것이 어렵고, mL 오더이상이면 검체에 대한 용량이 커지고, 추출 용액의 조성이 크게 바뀌어 버리므로, 그 후의 추출 조작에 대해서 영향을 주는 것이 우려된다. 이 때의 표준 물질의 용액을 제작할 경우에는 그 용매는 물 또는 PBS 등의 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

또한 첨가되는 표준 물질의 양은 최종적으로 검체에 포함되는 표적 소형 RNA와 같은 정도의 농도가 되도록 검체에 대해서 첨가되는 것이 바람직하다. 소형 RNA는 검체의 종류에 따라 포함되는 농도는 다르지만, 검체가 체액인 경우에는 몰 농도 단위로 z(zepto)몰/mL∼p(pico)몰/mL이며, 보다 바람직하게는 a(atto)몰/mL∼f(femto)몰/mL의 농도로 검체에 대해서 표준 물질을 첨가한다. 그 농도의 측정 방법은 흡광도 측정법, 형광법, 전기영동법, 컬럼법, 캐필러리 전기영동법 등을 들 수 있다.

또한 핵산 추출후에 흡광도 측정법, 형광법, 전기영동법, 컬럼법, 캐필러리 전기영동법 등으로 추출 용액을 측정함으로써, 표적 소형 RNA와 표준 물질의 존재를 확인하거나, 또는 그 양을 측정해도 좋다.

<추출 공정>

본 발명에서는 표준 물질의 공존 하, 각 검체로부터 표적 소형 RNA를 포함하는 핵산의 추출 처리가 행해진다(추출 공정). 각 검체에 첨가된 표준 물질도 표적 소형 RNA와 함께 추출되므로, 이 추출 공정에서 각 검체로부터 얻어지는 핵산 시료에는 표적 소형 RNA 및 표준 물질이 포함된다.

검체로부터 핵산을 추출하는 방법에 대해서는 기지의 각종 방법을 사용할 수 있지만, RNA를 추출하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 AGPC법, 페놀/클로로포름법을 사용하는 것이 바람직하다. 그 경우, 바람직하게는 추출 용액으로서 2∼5M의 구아니딘과 40∼60%의 페놀을 포함하는 용액인 것이 바람직하다. 또한, 단백질 등의 협잡물을 효과적으로 제거할 수 있는 추출 용액으로서 추출 용액의 총량에 대해서

(a)50용량%초과의 페놀,

(b)용액의 총량에 대해서 3∼10용량%의 다가 알콜,

(c)용액의 총량에 대해서 0.5∼2.0M 농도의 구아니디늄염,

(d)용액의 총량에 대해서 0.1∼0.5M 농도의 티오시안산염, 및

(e)용액의 pH를 4∼6으로 유지하기 위한 완충제,

를 포함하는 추출 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 핵산이 추출되기 쉽도록 추출 용액에 각종 염을 첨가해도 좋다.

구체적인 추출 공정으로서는 예를 들면 검체를 추출 용액중에서 호모디나이즈해서 호모제네이트를 형성시키고, RNA를 포함하는 수용액을 분리하기 위한 유기용매를 이 호모제네이트에 첨가한 후, 이것을 원심분리하는 방법을 적용할 수 있다. 그러한 공정에서는 상술한 바와 같이, 검체를 추출 용액과 혼합한 후, 원심분리의 전까지 표준 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.

추출된 소형 RNA를 포함하는 용액을 또한 침전, 크로마토그래피, 원심분리, 전기영동, 및 어피니티 분리 등의 공정에 제공해서 정제해도 좋다. 예를 들면 침전 공정에 있어서는 소형 RNA를 포함하는 용액에 저급 알콜을 첨가해서 소형 RNA를 침전시키고, 침전한 소형 RNA를 회수하는 공정을 적용할 수 있다. 크로마토그래피 공정으로서는 소형 RNA가 포함되는 용액에 저급 알콜을 첨가해서 침전시킨 소형 RNA를, RNA를 흡착할 수 있는 담체, 예를 들면 실리카멤브레인 컬럼에 흡착시킨 후, 담체(컬럼)로부터 용출해서 회수하는 공정을 적용해도 좋다.

<측정 공정>

본 발명의 방법에서는 이상의 추출 공정에 의해 복수의 검체로부터 각각 추출된 핵산 시료에 포함되는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 측정한다(측정 공정).

측정 방법으로서는 PCR법, 시퀀스법 등의 증폭법, 노던 하이브리다이제이션법, 서던 하이브리다이제이션법, 어레이법 등의 하이브리다이제이션법 등의 각종 방법이 사용된다. 하이브리다이제이션법 중, 대상의 RNA나 표준 물질에 특이적으로 결합하는 프로브를 지지체 상에 고정화한 마이크로 어레이 등의 어레이 칩을 사용하는 어레이법에 의해 측정을 행하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 표적 소형 RNA 포착 프로브와 표준 물질 포착 프로브가 정렬 고정화된 지지체를 포함하는 어레이 칩을 바람직하게 사용할 수 있다.

「포착 프로브」 또는 「포착하기 위한 프로브」란 포착 대상의 RNA 등의 핵산과 직접적 또는 간접적으로, 바람직하게는 직접적으로, 또한 선택적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하고, 대표적인 예로서, 핵산, 단백질, 당류 및 다른 항원성 화합물을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는 핵산 프로브를 바람직하게 사용할 수 있다. 핵산 프로브는 DNA나 RNA 외, PNA(펩티드 핵산)나 LNA(Locked Nucleic Acid) 등의 핵산 유도체를 이용하여 조제할 수 있다. 여기에서, 핵산 유도체란 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드, 및 염기의 재구성, 이중결합의 포화, 탈아미노화, 산소분자의 유황분자로의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체를 의미한다.

핵산 프로브의 염기 길이는 하이브리다이제이션의 안정성을 확보하는 관점으로부터 20염기이상으로 하는 것이 바람직하다. 통상, 20∼100염기 정도의 쇄 길이로 하면, 프로브가 대상으로 하는 RNA에의 선택적 결합성을 충분히 발휘할 수 있다. 그러한 쇄 길이가 짧은 올리고 핵산 프로브는 주지의 화학 합성법 등에 의해 용이하게 조제할 수 있다.

핵산 프로브는 대상의 핵산(표적 소형 RNA나 핵산인 표준 물질)과 완전히 상보적인 염기서열로 하는 것이 바람직하지만, 일부에 차이가 있어도 대상의 핵산과 스트리젠트한 조건에서 하이브리다이즈할 수 있을 정도로 상동성이 높은 염기서열이면, 포착 프로브로서 사용가능하다.

하이브리다이제이션시의 스트리젠시는 온도, 염 농도, 프로브의 쇄 길이, 프로브의 뉴클레오티드 서열의 GC 함량 및 하이브리다이제이션 완충액중의 카오트로픽제의 농도의 함수인 것이 알려져 있다. 스트리젠트한 조건으로서는 예를 들면 「Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)」에 기재된 조건 등을 사용할 수 있다. 스트리젠트한 온도 조건은 약 30℃이상이다. 그 밖의 조건으로서는 하이브리다이제이션 시간, 세정제(예를 들면, SDS)의 농도, 및 캐리어 DNA의 존부 등이며, 이들의 조건을 조합함으로써, 여러가지 스트리젠시를 설정할 수 있다. 당업자는 소망하는 검체에 포함되는 표적 소형 RNA나 사용하는 표준 물질의 검출을 위해서 준비한 핵산 프로브가 포착 프로브로서의 기능을 적절하게 발휘할 수 있는 조건을 적당하게 결정할 수 있다.

소형 RNA의 서열 정보는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 등의 데이터 베이스로부터 입수할 수 있다. 또한 miRNA의 서열 정보는 예를 들면 miRbase의 웹 사이트(http://www.mirbase.org/ftp.shtml)부터 입수할 수 있다. 소형 RNA 포착 핵산 프로브는 이들의 사이트로부터 입수할 수 있는 서열 정보에 의거하여 설계할 수 있다.

지지체 상에 고정화되는 소형 RNA 포착 프로브의 수는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 서열이 동정되어 있는 공지의 miRNA의 전체를 망라하는 수의 소형 RNA 포착 프로브를 지지체 상에 고정화한 것을 이용하여 소형 RNA의 발현량을 측정해도 좋고, 소망의 수의 소형 RNA에 대한 포착 프로브를 지지체 상에 고정화한 것을 이용해도 좋고, 예를 들면 특정의 질환이나 생체상태에 관련되는 특정의 1 내지 복수의 소형 RNA 포착 프로브를 사용해도 좋다.

표준 물질을 포착하기 위한 프로브는 사용하는 표준 물질을 상보적으로 포착할 수 있는 프로브이면 좋다. 표준 물질의 염기서열과의 상동성이 50%이상이며, 또한 고차 구조를 취하지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면 일본 특허공개 2011-239708호 공보에서 기재되어 있는 방법으로 설계할 수 있다.

포착 프로브가 고정화되는 지지체로서는 공지의 마이크로 어레이나 매크로 어레이 등에서 사용되고 있는 지지체와 동일한 것을 사용할 수 있고, 예를 들면 슬라이드 유리나, 막, 비즈 등을 사용할 수 있다. 일본 특허 제4244788호 등에 기재되어 있는, 표면에 복수의 볼록부를 갖는 형상의 지지체를 사용할 수도 있다. 지지체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 유리, 세라믹, 실리콘 등의 무기재료; 폴리에틸렌테레프탈레이트, 아세트산 셀룰로오스, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 실리콘고무 등의 폴리머 등을 들 수 있다.

지지체에 포착 프로브를 고정화하는 방법으로서는 지지체 표면 상에서 올리고 DNA를 합성하는 방법과, 미리 합성해 둔 올리고 DNA를 지지체 표면에 적하해서 고정하는 방법이 알려져 있다.

전자의 방법으로서는 Ronald 등의 방법(미국 특허 제5705610호 명세서), Michel 등의 방법(미국 특허 제6142266호 명세서), Francesco 등의 방법(미국 특허 제7037659호 명세서)을 들 수 있다. 이들 방법에서는 DNA 합성 반응시에 유기용매를 사용하기 때문에 지지체는 유기용매에 내성이 있는 재질인 것이 바람직하다. 또한 Francesco 등의 방법에서는 지지체의 이면으로부터 광을 조사해서 DNA 합성을 제어하므로 지지체는 투광성을 갖는 재질인 것이 바람직하다.

후자의 방법으로서는 히로타 등(일본 특허 제 3922454호)의 방법이나 스포터사용하는 방법을 들 수 있다. 스폿의 방식으로서는 고상에의 핀 선단의 기계적인 접촉에 의한 핀 방식, 잉크젯 프린터의 원리를 이용한 잉크젯 방식, 모세관에 의한 캐피러리 방식 등을 들 수 있다. 스폿 처리한 후에는 필요에 따라 UV 조사에 의한 크로스 링킹, 표면의 블록킹 등의 후처리가 행해진다. 표면 처리한 지지체 표면에 공유 결합에 의해 올리고 DNA를 고정화시키기 위해서 올리고 DNA의 말단에는 아미노기나 SH기 등의 관능기가 도입된다. 지지체의 표면수식은 통상, 아미노기 등을 갖는 실란커플링제 처리에 의해 행해진다.

포착 프로브는 1종류의 소형 RNA 또는 표준 물질에 대해서 지지체의 복수의 고정화 영역에 고정해서 검출해도 좋다. 예를 들면 1종류의 소형 RNA 또는 표준 물질을 포착하는 동일한 포착 프로브를 지지체 상의 복수 개소에 고정해도 좋고, 또한 1종류의 소형 RNA 또는 표준 물질에 대해서 복수 종류의 포착 프로브를 설계할 수 있는 경우에는 같은 소형 RNA 또는 표준 물질을 표적으로 하는 복수의 포착 프로브를 지지체 상에 고정해도 좋다.

지지체 상에 고정화된 각 프로브와의 하이브리다이제이션은 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 검체로부터 추출한 핵산 시료에 표지 물질을 결합시켜서 표지 물질로 표지된 핵산 시료를 조제하고, 이 표지된 핵산 시료를 프로브와 접촉시킴으로써 실시한다. 본 발명에 있어서, 「핵산 시료」라는 말에는 검체로부터 추출한 RNA 외에 상기 RNA로부터 역전사 반응에 의해 조제된 cDNA 및 cRNA가 포함된다. 따라서, 표지된 핵산 시료는 핵산 시료중의 표적 소형 RNA 및 표준 물질을 직접적 또는 간접적으로 표지 물질로 표지한 것일 수 있고, 또한 핵산 시료중의 RNA로부터 조제된 cDNA 또는 cRNA(표준 물질이 RNA인 경우, 표적 소형 RNA 및 표준 물질로부터 역전사 반응에 의해 얻어지는 cDNA 또는 cRNA가 포함된다)를 직접적 또는 간접적으로 표지 물질로 표지한 것일 수 있다.

핵산 시료에 표지 물질을 결합시키는 방법으로서는 핵산 시료의 3' 말단에 표지 물질을 결합시키는 방법, 5' 말단에 표지 물질을 결합시키는 방법, 표지 물질이 결합한 뉴클레오티드를 핵산에 도입시키는 방법을 들 수 있다. 3' 말단에 표지 물질을 결합시키는 방법, 5' 말단에 표지 물질을 결합시키는 방법에서는 효소반응을 사용할 수 있다. 효소반응에는 T4 RNA Ligase나 Terminal Deoxitidil Transferase, Poly A polymerase 등을 사용할 수 있다. 어느 표지 방법이나 「Shao-Yao Ying편, miRNA 실험 프로토콜, 양토사, 2008년」에 기재되어 있는 방법을 참고로 할 수 있다. 또한 RNA의 말단에 직접 또는 간접적으로 표지 물질을 결합시키기 위한 키트가 각종 시판되고 있다. 예를 들면 3' 말단에 직접 또는 간접적으로 표지 물질을 결합시키는 키트로서는 miRCURY miRNA HyPower Labeling kit(엑시콘사), NCode miRNA Labeling system(라이프 테크놀러지즈사), FlashTag Biotin RNA Labeling kt(제니스피아사) 등을 예시할 수 있다. 라이프 테크놀러지즈사의 NCode miRNA Labeling system은 miRNA에 폴리A 테일을 부가한 후, 가교 형성 올리고 dT를 이용하여 캡처 서열을 3' 말단에 라이제이션하고, 이것을 어레이에 하이브리다이즈시킨 후, 캡처 서열에 하이브리다이즈하는 서열을 가진 표지 물질을 첨가하고, 캡처 서열을 통해 miRNA를 표지한다고 하는 것이며, miRNA에 간접적으로 표지 물질을 결합시키는 방법이다. 표준 물질로서 3' 말단이 인산화된 RNA를 사용하면 이들의 방법으로 표지를 행하는 것이 가능하다.

이 외에, 종래법과 마찬가지로, 표지한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 표지한 리보누크레오티드의 존재 하에서 검체로부터 추출한 RNA로부터 cDNA 또는 cRNA를 합성함으로써, 표지 물질이 도입된 cDNA 또는 cRNA를 조제하고, 이것을 어레이 상의 프로브와 하이브리다이즈시킨다는 방법도 가능하다. 표준 물질로서 RNA를 사용하는 경우에는 이 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에서는 복수의 검체를 사용하지만, 어느 것이나 동일한 표지 물질을 이용해도 좋고, 복수의 다른 표지 물질을 이용해도 좋다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 표지 물질로서는 공지의 마이크로 어레이 해석에 있어서도 사용되고 있는 각종 표지 물질을 들 수 있다. 구체적으로는 형광색소, 인광색소, 효소, 방사선 동위체 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 것은 측정이 간편하고, 시그널이 검출되기 쉬운 형광색소이다. 구체적으로는 시아닌(시아닌2), 아미노메틸쿠마린, 플루오로세인, 인도카르보시아닌(시아닌3), 시아닌3.5, 테트라메틸로다민, 로다민레드, 텍사스레드, 인도카르보시아닌(시아닌5), 시아닌5.5, 시아닌7, 오이스터 등의 공지의 형광색소를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한 표지 물질로서는 발광성을 갖는 반도체 미립자를 사용해도 좋다. 이러한 반도체 미립자로서는 예를 들면 카드뮴셀레늄(CdSe), 카드뮴텔루륨(CdTe), 인듐갈리륨인(InGaP), 실버인듐황화아연(AgInZnS) 등을 들 수 있다.

상기한 바와 같이 해서 표지된 검체 유래의 핵산(표적 소형 RNA) 및 표준 물질을 포함하는 핵산 시료를 지지체 상의 프로브와 접촉시켜서 하이브리다이즈시킨다. 이 하이브리다이제이션 공정은 종래와 완전히 동일하게 행할 수 있다. 반응온도 및 시간은 하이브리다이즈시키는 핵산의 쇄 길이에 따라 적당하게 선택되지만, 핵산의 하이브리다이제이션의 경우, 통상, 30℃∼70℃ 정도에서 1분간∼십수시간이다. 하이브리다이제이션을 행하고, 세정후, 지지체 상의 개개의 프로브 고정화 영역에 있어서의 표지 물질로부터의 시그널 강도를 검출한다. 시그널 강도의 검출은 표지 물질의 종류에 따라 적당한 시그널 판독 장치를 이용하여 행한다. 형광색소를 표지 물질로서 사용했을 경우에는 형광 현미경이나 형광 스캐너 등을 사용하면 좋다.

검출된 측정값(시그널값)은 주변 노이즈와 비교된다. 구체적으로는 프로브 고정화 영역으로부터 얻어진 측정값과, 그 이외의 위치로부터 얻어진 측정값을 비교하여 전자의 수치가 상회하고 있는 경우를 검출했다(유효 판정 양성)라고 한다.

검출된 측정값에 백그라운드 노이즈가 포함되어 있는 경우에는 백그라운드 노이즈를 감산해도 좋다. 주변 노이즈를 백그라운드 노이즈로서 검출한 시그널값으로부터 감산할 수도 있다. 기타, 「마이크로 어레이 데이터 통계해석 프로토콜(양토사)」에 기재되어 있는 방법을 사용해도 좋다.

상기에 의해, 각 핵산 시료중에 존재하는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양, 즉 각 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정값이 시그널 강도로서 얻어진다.

<대표값 취득 공정>

본 발명의 방법에서는 이어서, 각 검체에 대해서 추출된 핵산 시료중의 표준 물질 존재량의 측정값으로부터 대표값을 취득한다(대표값 취득 공정). 또, 핵산 시료중의 표준 물질 존재량이라는 말과, 검체로부터의 표준 물질 추출량이라는 말은 동의이며, 본 명세서에 있어서는 「표준 물질 존재량」과 「표준 물질 추출량」이라는 말을 같은 의미로 사용한다. 핵산 시료중의 표준 물질 존재량, 및 검체로부터의 표준 물질 추출량을 단지 「표준 물질량」이라고 하는 일이 있다. 즉, 본 명세서에 있어서, 「검체의 표준 물질량」이라는 경우, 검체중에 첨가한 표준 물질량이 아닌 핵산 시료중의 표준 물질 존재량 또는 검체로부터의 표준 물질 추출량을 의미하고 있다.

표준 물질이 1종류인 경우는 그 1종류의 존재량의 측정값이 대표값이 될 수 있지만, 2종류이상의 경우에는 이하 각종의 방법으로 대표값을 취득해도 좋다.

대표값의 전형예로서는 평균값 및 중앙값을 들 수 있다. 평균값은 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값(예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 얻어진 시그널 강도의 측정값)으로부터 산출된 평균값을 의미한다. 중앙값은 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값(예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 얻어진 시그널 강도의 측정값)으로부터 얻어진 중앙값을 의미한다.

이들 평균값 또는 중앙값은 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값이어도 좋다. 「대수값으로 나타내어진 평균값」이란 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값(예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 얻어진 시그널 강도의 측정값)을 밑이 2인 대수로 변환한 대수값으로 구한 평균값을 의미한다. 「대수값으로 나타내어진 중앙값」이란 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값(예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 얻어진 시그널 강도의 측정값)을 밑이 2인 대수로 변환한 대수값의 중앙값, 또는 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값의 중앙값을 밑이 2인 대수로 변환한 대수값을 의미한다. 중앙값의 경우에는 측정값의 대수 변환을 먼저 행해도 나중에 행해도 같은 값이 얻어진다.

평균값 및 중앙값은 측정 대상으로 한 복수의 표준 물질의 모든 측정값을 이용해서 구한 것이어도 좋고, 상기 복수의 표준 물질 중에서 선출된 일부의 측정값을 이용하여 구한 것이어도 좋다. 예를 들면 마이크로 어레이에 탑재되어 있는 표준 물질 포착 프로브에서 얻어진 모든 측정값을 이용하여 구해도 좋고, 표준 물질 포착 프로브 중 일부(예를 들면 마이크로 어레이에 탑재되어 있는 표준 물질 포착 프로브가 10종이었다고 하면 그 중의 5종)에 대해서 구해도 좋다. 예를 들면 비교 해석해야 할 모든 검체에 공통해서 유효 판정 양성이었던 표준 물질 포착 프로브만을 선출하여 표준 물질의 대표값을 취득할 수 있다. 또한 대표값을 구하기 전에 표준 물질의 존재량의 측정값으로부터 이상값을 제외해도 좋다.

또한 1종류의 표준 물질에 대해서 복수종의 포착 프로브를 사용하거나, 또는 1종류의 포착 프로브가 복수 개소에 스폿된 어레이를 이용하여 검출을 행함으로써, 1개의 표준 물질에 대해서 복수의 측정값이 얻어지는 경우도 있다. 이 경우도, 2종류이상의 표준 물질을 사용하는 경우와 마찬가지로, 복수의 측정값으로부터 산출된 평균값 또는 중앙값, 예를 들면 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값을 대표값으로서 사용할 수 있다. 또한 이들의 측정값 전체를 이용하여 대표값을 구해도 좋고, 일부의 측정값을 이용하여 구해도 좋다.

또한 복수의 표준 물질을 사용하는 형태에 있어서, 1개의 표준 물질에 대한 1종류의 포착 프로브가 각각 어레이 상의 복수 개소에 스폿되어 있는 경우에는 우선 표준 물질마다 복수의 포착 프로브 스폿으로부터의 시그널 측정값의 평균값을 구하고, 각 평균값을 대수 변환하고, 각 대수값을 이용하여 복수의 표준 물질 사이에서 평균값 또는 중앙값을 구해도 좋다. 이렇게 해서 구한 평균값 또는 중앙값도 「대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값」에 포함된다.

복수의 검체에 있어서의 대표값의 CV값(변동계수)은 0.5이하가 되는 것이 바람직하다. 통상, 마이크로 어레이를 사용했을 경우의 측정값의 CV값은 0.5이하가 된다. CV값이 0.5이상인 경우에는 편차가 크고, 추출 공정에서의 표준 물질의 추출 효율이 안정되지 않아, 결과적으로 보정후의 데이터의 정밀도가 저하되는 것이 예측된다.

<보정 계수 취득 공정>

이어서, 대표값 취득 공정에서 얻어진 각 검체의 표준 물질 추출량의 대표값과, 표준 물질 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값을 이용하여 표적 소형 RNA의 발현량의 보정에 사용하는 보정 계수를 취득한다(보정 계수 취득 공정). 이 보정 계수 취득 공정에서는 대표값과 기준값의 차를 이용해서 보정 계수를 구해도 좋고, 대표값과 기준값의 비를 이용해서 보정 계수를 구해도 좋다. 특별히 한정되지 않지만, 대수 변환하지 않는 대표값을 사용할 경우에는 비를 이용해서 보정 계수를 구하고, 대수로 나타내어진 대표값을 사용할 경우에는 차를 이용해서 보정 계수를 구하는 것이 바람직하다. 이하, 이들 2가지의 공정에 대해서 설명한다.

<보정 계수 취득 공정-1>

보정 계수 취득 공정-1은 표준 물질 추출량의 대표값과 기준값의 차를 이용하는 방법이다. 본 공정에는 하기의 1-1.기준 검체 취득법, 또는 1-2.고정 수치 보정법을 적용할 수 있다.

1-1.기준 검체 취득법

해석 대상으로 하는 복수의 검체 중에서 임의로 1검체(제 1 검체)를 선택하고, 이것을 「기준 검체」로 한다. 나머지의 1개 또는 그 이상의 검체(제 2 이후의 검체)가 「보정되는 검체」가 된다.

또, 본 명세서에 있어서, 「제 2 이후의 검체」라는 말에는 제 2 검체도 포함된다. 예를 들면 비교해야 할 복수의 검체가 2개이면, 보정되는 검체는 제 2 검체뿐이며, 비교해야 할 복수의 검체가 3개이면, 보정되는 검체는 제 2 검체 및 제 3 검체 2개이다.

이 방법에서는 기준 검체의 표준 물질량의 대표값을 「기준값」으로 한다. 상기 기준값과, 제 2 이후의 각 검체(보정되는 검체)의 표준 물질량의 대표값의 차를, 상기 제 2 이후의 각 검체를 위한 보정 계수로서 사용한다. 보정 계수는 보정되는 검체의 수만큼 취득되게 된다.

구체적으로는 보정 계수는 식 1 또는 식 1'로 구해진다.

c_1-1=(기준 검체의 표준 물질량의 대표값(기준값))

- (보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값) ···식 1

c_1-1'=(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)

-(기준 검체의 표준 물질량의 대표값(기준값)) ···식 1'

예를 들면, 마이크로 어레이를 이용하여 발현량의 측정을 실시하고, 표준 물질량의 대표값으로서 대수값으로 나타내어진 평균값을 사용할 경우, 보정되는 검체를 위한 보정 계수는 식 2 또는 식 2'로 구할 수 있다.

여기에서, 식 2, 식 2' 중,

n은 지지체 상의 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역의 총수,

Aj는 기준 검체에 있어서의 j번째(1≤j≤n)의 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역으로부터의 시그널 측정값,

Xj는 제 2 검체에 있어서의 j번째(1≤j≤n)의 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역으로부터의 시그널 측정값이다.

프로브가 표준 물질과 1대1 대응인 경우, n은 지지체 상의 표준 물질 포착 프로브가 타겟으로 하는 표준 물질의 수와 같다.

식 2 및 식 2'에 있어서는 n대신에, 비교해야 할 모든 검체에서 공통되어서 유효 판정 양성이었던 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역의 총수 n'을 사용할 수도 있다.

1-2.고정 수치 보정법

표준 물질량의 대표값에 대해서 모든 검체에 있어서 일정한 수치를 취하는 것으로 미리 가정하는 방법이다. 즉, 고정한 수치를 「기준값」으로 하고, 이 고정 수치와 각 검체의 표준 물질량의 대표값의 차를 얻고, 이 차를 보정 계수로서 이용한다. 상기 방법에서는 1-1.에 나타낸 「기준 검체」는 존재하지 않으므로, 비교 해석 대상이 되는 복수의 검체 전체가 「보정되는 검체」로 되고, 비교 해석 대상이 되는 검체의 수만큼 보정 계수가 취득되게 된다.

구체적으로는 보정 계수는 식 3 또는 식 3'으로 구해진다.

r_1-2=(고정 수치(기준값))-(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)

···식 3

r_1-2'=(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)-(고정 수치(기준값))

···식 3'

예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 발현량의 측정을 실시하여 표준 물질량의 대표값으로서 대수값으로 나타내어진 평균값을 사용할 경우, 보정되는 검체를 위한 보정 계수는 식 4 또는 식 4'로 구할 수 있다.

여기에서, 식 4, 식 4' 중,

α는 기준값(고정 수치),

Yj는 검체에 있어서의, j번째(1≤j≤n)의 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역으로부터의 시그널 측정값이다.

식 2 및 식 2'에 있어서는 n 대신에 비교해야 할 모든 검체에서 공통되어서 유효 판정 양성이었던 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역의 총수 n'을 사용할 수도 있다.

고정 수치 보정법에서 기준값으로서 사용하는 고정 수치는 적어도 1회의 비교 해석에 있어서, 모든 검체에 대해서 일관해서 동일한 수치를 사용하는 한, 어떠한 수치(단 0 이외)를 사용해도 좋다. 동일한 발현 측정 시스템을 사용하고, 또한, 항상 동일한 수치를 고정 수치로서 사용하는 것으로 하면, 다른 날에 발현량의 측정을 행한 검체 사이에서도 비교 해석이 가능하다. 예를 들면 검체에 첨가하는 각 표준 물질의 양은 모든 검체에서 동일하므로, 표준 물질 첨가량에 의거하여 고정 수치를 결정해도 좋다. 무엇보다, 측정 공정에 있어서 사용하는 시스템에 의해 검출되는 시그널값의 크기는 변동할 수 있기 때문에, 사용하는 시스템에 따라 고정 수치는 자유롭게 선택할 수 있다.

<보정 계수 취득 공정-2>

보정 계수 취득 공정-2는 표준 물질량의 대표값과 기준값의 비를 이용하는 방법이다. 본 공정에는 하기의 2-1.기준 검체 취득법, 또는 2-2.고정 수치 보정법을 적용할 수 있다.

2-1.기준 검체 취득법

해석 대상으로 하는 복수의 검체 중에서 임의로 1검체(제 1 검체)를 선택하고, 이것을 「기준 검체」로 한다. 나머지의 제 2 이후의 검체가 「보정되는 검체」가 된다.

이 방법에서는 기준 검체의 표준 물질량의 대표값을 「기준값」으로 하고, 상기 기준값과, 제 2 이후의 각 검체(보정되는 검체)의 표준 물질량의 각 대표값의 비를 상기 제 2 이후의 각 검체를 위한 보정 계수로서 사용한다. 보정 계수는 보정되는 검체의 수만큼 취득되게 된다.

구체적으로는 보정 계수는 식 5 또는 식 5'로 구해진다.

c_2-1=(기준 검체의 표준 물질량의 대표값(기준값))

/(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값) ···식 5

c_2-1'=(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)

/(기준 검체의 표준 물질량의 대표값(기준값)) ···식 5'

예를 들면, 마이크로 어레이를 이용하여 발현량의 측정을 실시하고, 표준 물질량의 대표값으로서 대수값으로 나타내어진 평균값을 사용할 경우, 제 2 검체를 위한 보정 계수는 식 6 또는 식 6'으로 구할 수 있다.

여기에서, 식 6, 식 6' 중,

식 6 및 식 6'에 있어서는 n 대신에 비교해야 할 모든 검체에서 공통되어서 유효 판정 양성이었던 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역의 총수 n'을 사용할 수도 있다.

2-2.고정 수치 보정법

표준 물질량의 대표값에 대해서 모든 검체에 있어서 일정한 수치를 취하는 것이라고 미리 가정하는 방법이다. 즉, 고정한 수치를 「기준값」으로 하고, 이 고정 수치와 각 검체의 표준 물질량의 대표값의 비를 얻고, 이 비를 보정 계수로서 이용한다. 상기 방법에서는 2-1.에 나타낸 「기준 검체」는 존재하지 않으므로, 비교 해석 대상이 되는 복수의 검체 전체가 「보정되는 검체」로 되고, 비교 해석 대상이 되는 검체의 수만큼 보정 계수가 취득되게 된다.

구체적으로는 보정 계수는 식 7 또는 식 7'로 구해진다.

r_2-2=(고정 수치(기준값))/(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)

···식 7

r_2-2'=(보정되는 검체의 표준 물질량의 대표값)/(고정 수치(기준값))

···식 7'

예를 들면 마이크로 어레이를 이용하여 발현량의 측정을 실시하고, 표준 물질량의 대표값으로서 대수값으로 나타내어진 평균값을 사용할 경우, 보정되는 검체를 위한 보정 계수는 식 8 또는 식 8'로 구할 수 있다.

여기에서, 식 8, 식 8' 중,

α는 고정 수치,

Yj는 검체에 있어서의 j번째(1≤j≤n)의 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역으로부터의 시그널 측정값이다.

식 8 및 식 8'에 있어서는 n 대신에 비교해야 할 모든 검체에서 공통되어서 유효 판정 양성이었던 표준 물질 포착 프로브 고정화 영역의 총수 n'을 사용할 수도 있다.

여기에서 기준값으로서 사용하는 「고정 수치」의 상세한 것은 「1-2.고정 수치 보정법」에 있어서의 고정 수치와 동일하다.

<보정 공정>

이어서, 보정 계수 취득 공정-1 또는 보정 계수 취득 공정-2에서 얻어진 보정 계수를 이용하여 보정 공정-1 또는 보정 공정-2의 방법을 이용하여 보정되는 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행한다.

<보정 공정-1>

보정 공정-1은 보정 계수 취득 공정-1에서 얻어진 보정 계수를 이용하여 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 방법이며, 표적 소형 RNA의 발현량에 보정 계수를 가산, 또는 상기 발현량으로부터 보정 계수를 감산함으로써 보정을 행한다. 본 공정에는 보정 계수 취득 공정-1의 기준 검체 취득법과 고정 수치 보정법에 각각 대응한 2가지의 보정 방법이 있다.

1-1.기준 검체 취득법

제 2 이후의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량의 보정은 제 2 이후의 검체를 위한 보정 계수를 각각 사용해서 실시한다. 즉, 제 2 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량을 보정할 경우에는 제 2 검체를 위한 보정 계수(c2_1-1 또는 c2_1-1')를 사용하고, 제 3 검체에 대해서 표적 miRNA 발현량을 보정할 경우에는 제 3 검체를 위한 보정 계수(c3_1-1 또는 c3_1-1')를 사용한다.

보정 계수로서 기준 검체의 표준 물질량의 대표값으로부터 제 2 이후의 검체의 표준 물질량의 대표값을 감산한 차를 사용할 경우, 즉 상기 식 1의 경우에는 제 2 이후의 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값에 보정 계수를 가산함으로써, 제 2 이후의 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 9에 의해 구할 수 있다.

여기에서, Wi는 i번째의 소형 RNA 포착 프로브 고정화 영역으로부터의 시그널 측정값이다.

이것과는 반대로, 보정 계수로서 제 2 이후의 검체의 표준 물질량의 대표값으로부터 기준 검체의 표준 물질량의 대표값을 감산한 차를 사용할 경우, 즉 상기 식 1'의 경우에는 제 2 이후의 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값으로부터 보정 계수를 감산함으로써, 제 2 이후의 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 9'에 의해 구할 수 있다.

여기에서, Wi의 정의는 상기 식 9와 동일하다.

제 2 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA 발현량을 보정하는 것이라면, 상기 제 2 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값에 c2를 가산하거나, 또는 c2'를 감산하면 좋다. 제 3 이후의 검체에 관해서도 동일하다. 또, 기준 검체로 한 제 1 검체의 대표값과 기준값의 차는 당연 0이지만, 프로그램의 구성 상, 제 1 검체의 표적 소형 RNA 발현량에 0을 가산 또는 감산한다는 계산을 실시해도 지장이 없다.

1-2.고정 수치 보정법

표적 소형 RNA 발현량의 보정은 대표값과 고정 수치(기준값)의 차에 의해 얻어진 보정 계수를 각각 사용해서 실시한다. 즉, 어떤 검체에 대해서 표적 소형 RNA 발현량을 보정할 경우에는 그 검체를 위한 보정 계수(r_1-2 또는 r_1-2')를 사용한다.

보정 계수로서 고정 수치로부터 검체의 표준 물질량의 대표값을 감산한 차를 사용할 경우, 즉 상기 식 3의 경우에는 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값에 보정 계수를 가산함으로써, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 10에 의해 구할 수 있다.

이것과는 반대로, 보정 계수로서 검체의 표준 물질량의 대표값으로부터 고정 수치를 감산한 차를 사용할 경우, 즉 상기 식 3'의 경우에는 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값으로부터 보정 계수를 감산함으로써, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 10'에 의해 구할 수 있다.

Wi의 정의는 상기 식 10과 동일하다.

<보정 공정-2>

보정 공정-2는 보정 계수 취득 공정-2에서 얻어진 보정 계수를 이용하여 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 방법이며, 표적 소형 RNA의 발현량을 보정 계수로 제산, 또는 상기 발현량에 보정 계수를 승산함으로써 보정을 행한다. 본 공정에도 보정 계수 취득 공정-2의 기준 검체 취득법과 고정 수치 보정법에 각각 대응한 2가지의 보정 방법이 있다.

2-1.기준 검체 취득법

제 2 이후의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량의 보정은 제 2 이후의 검체를 위한 보정 계수를 각각 사용해서 실시한다. 즉, 제 2 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량을 보정할 경우에는 제 2 검체를 위한 보정 계수(c2_2-1 또는 c2_2-1')를 사용하고, 제 3 검체에 대해서 표적 소형 RNA 발현량을 보정할 경우에는 제 3 검체를 위한 보정 계수(c3_2-1 또는 c3_2-1')를 사용한다.

보정 계수로서 보정되는 제 2 이후의 검체의 표준 물질량의 대표값을 분모로 하고, 기준 검체의 표준 물질량의 대표값을 분자로 한 비를 사용할 경우, 즉 상기 식 5의 경우에는 제 2 이후의 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값또는 상기 측정값의 대수값에 보정 계수를 승산함으로써, 제 2 이후의 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 11에 의해 구할 수 있다.

이것과는 반대로, 보정 계수로서 기준 검체의 표준 물질량의 대표값을 분모로 하고, 제 2 이후의 검체의 표준 물질량의 대표값을 분자로 한 비를 사용할 경우, 즉 상기 식 5'의 경우에는 제 2 이후의 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값을 보정 계수로 제산함으로써, 제 2 이후의 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 11'에 의해 구할 수 있다.

여기에서, Wi의 정의는 상기 식 11과 동일하다.

제 2 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA 발현량을 보정하는 것이라면, 상기 제 2 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값에 c2_2-1을 제산하거나, 또는 c2_2-1'을 승산하면 좋다. 제 3 이후의 검체에 대해서도 동일하다. 식 5 및 식 11의 순서에서도, 식 5' 및 식 11'의 순서에서도, 최종적으로 얻어지는 보정 완료 표적 소형 RNA의 발현량 Ei의 값은 동일하다. 또, 기준 검체로 한 제 1 검체의 대표값과 본 방법에 있어서의 고정 수치(기준값)의 비는 당연 1이지만, 프로그램의 구성 상, 제 1 검체의 표적 소형 RNA 발현량에 1을 승산 또는 상기 표적 소형 RNA 발현량을 1로 제산한다는 계산을 실시해도 지장이 없다.

2-2.고정 수치 보정법

표적 소형 RNA 발현량의 보정은 고정 수치(기준값)와의 비에 의해 얻어진 보정 계수를 각각 사용해서 실시한다. 즉, 어떤 검체에 대해서 표적 소형 RNA 발현량을 보정할 경우에는 그 검체를 위한 보정 계수(r_2-2 또는 r_2-2')를 사용한다.

보정 계수로서 검체의 표준 물질량의 대표값을 분모로 하고, 고정 수치를 분자로 한 비를 사용할 경우, 즉 상기 식 7의 경우에는 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값에 보정 계수를 승산함으로써, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA의 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 12에 의해 구할 수 있다.

이것과는 반대로, 보정 계수로서 검체의 표준 물질량의 대표값을 분모로 하고, 고정 수치를 분자로 한 비를 사용할 경우, 즉 상기 식 7'의 경우에는 검체에 있어서의 각 표적 소형 RNA 발현량의 측정값 또는 상기 측정값의 대수값을 보정 계수로 제산함으로써, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량의 보정이 실시된다. 이 경우의 보정을 식으로 나타내면, 어떤 「보정되는 검체」에 있어서의 i번째의 표적 소형 RNA의 보정 완료 발현량 Ei는 하기 식 12'에 의해 구할 수 있다.

여기에서, Wi의 정의는 상기 식 12와 동일하다.

<비교 해석 공정>

보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량을 사용해서 복수의 검체간에서 표적 소형 RNA 발현량을 대비한다. 기준 검체 취득법에 의해 보정이 실시될 경우에는 기준 검체로 한 제 1 검체의 표적 소형 RNA 발현량은 보정을 받고 있지 않으므로, 예를 들면 제 1 검체와 제 2 검체 사이의 대비는 보정되어 있지 않은 제 1 검체의 표적 소형 RNA 발현량과, 보정 완료의 제 2 검체의 표적 소형 RNA 발현량 사이에서의 대비가 되지만, 대비하는 검체 중 적어도 1개는 반드시 보정된 검체가 된다. 따라서, 「보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량에 의해, 복수의 체액 검체간에서 표적 소형 RNA 발현량을 대비한다」라는 경우에는 보정되어 있지 않은 기준 검체와 보정된 다른 검체 사이에서 대비하는 형태도 포함된다.

비교 해석 공정 자체는 종래법과 마찬가지로 행할 수 있다. 예를 들면 스캐터 플롯이라고 불리는 발현량 데이터의 산포도를 작성하면 좋다. 비교해야 할 검체가 3개인 경우, 예를 들면 3개 중 어느 하나의 검체와 나머지의 각 검체를 비교 해석한 스캐터 플롯을 2개(예를 들면 제 1 검체-제 2 검체간의 스캐터 플롯과 제 1 검체-제 3 검체간의 스캐터 플롯) 작성하면 되고, 필요에 따라서, 또한 나머지 2개의 검체간(전술의 예의 경우에는 또한 제 2 검체-제 3 검체간)에서 비교 해석한 스캐터 플롯을 작성해도 좋다. 4개이상의 검체의 비교 해석도 마찬가지로 행할 수 있다. 또, 3검체의 비교 해석이면, 3차원적으로 스캐터 플롯을 작성할 수도 있다. 기준 검체 취득법의 경우이어도 반드시 기준 검체와 다른 2검체를 각각 비교하지 않으면 안되는 것은 아니고, 예를 들면 제 2 검체-기준 검체간의 비교와 제 2 검체-제 3 검체간의 비교를 행하는 것으로 해도 좋다.

또한 보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량에 의해 어느 1개의 검체와 나머지의 다른 검체 사이에서 표적 소형 RNA의 발현량의 차를 계산하고, 그 차를 가지고 대수화된 변화 배율(fold-change)로서 비교 해석 결과를 나타내어도 좋다. 예를 들면 기준 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량(기준 검체 취득법의 경우) 또는 제 1 검체에 있어서의 보정 완료의 표적 소형 RNA의 발현량(고정 수치 보정법의 경우)과, 제 2 이후의 검체에 있어서의 보정 완료의 표적 소형 RNA의 발현량의 차를 계산해도 좋다. 이 경우에도 상기 경우와 마찬가지로, 제 1 검체와 다른 검체의 차를 계산하는 것에 한정되지 않고, 제 2 이후의 검체 중 어느 1개와 다른 검체의 차를 계산하는 것으로 해도 좋다. 또한, 보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량을 사용해서 평균값이나 표준편차, 표준오차, 변동계수의 산출, 군간 비교나 유의차 검정, 클러스터 해석 등, 복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량을 사용한 통계적인 해석에 의해 대비나 평가를 실시하는 것도 가능하다.

본 발명의 장치는 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위해서 상기 발현량을 보정하는 장치이다. 상기 장치는,

복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출해서 얻어진 핵산 시료를 이용하여 측정된 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단과;

각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 대표값, 바람직하게는 대수값으로 나타내어진 대표값을 취득하는 대표값 취득 수단과;

표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 상기 대표값 취득 수단에 의해 취득된 각 검체의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단과;

상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 보정 계수를 이용하여 상기 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단을 포함한다.

어떤 1개의 형태에 있어서 기준값은 임의로 선택된 제 1 검체(기준 검체)의 표준 물질량의 대표값이며, 제 2 이후의 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량이 보정된다. 즉, 이 형태에 있어서, 본 발명의 장치는,

임의로 선택된 제 1 검체를 기준 검체로 하고, 기준 검체의 표준 물질 추출량의 대표값을 기준값으로 해서 상기 기준값과 나머지의 제 2 이후의 검체의 대표값의 차 또는 비를, 상기 제 2 이후의 검체를 위한 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단과;

상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 제 2 이후의 검체를 위한 보정 계수를 각각 사용해서 제 2 이후의 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단을 포함한다.

다른 형태에 있어서 기준값은 표준 물질 추출량에 관해서 임의로 정해진 고정 수치이며, 제 1 검체를 포함하는 모든 검체에 대해서 표적 소형 RNA 발현량의 보정이 행해진다. 즉, 이 형태에 있어서, 본 발명의 장치는,

고정 수치를 기준값으로 해서 상기 기준값과 각 검체의 대표값의 차는 비를, 상기 검체를 위한 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단과;

상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 검체를 위한 보정 계수를 각각 사용해서 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단을 포함한다.

상기한 보정 장치를 구비하는 소형 RNA 발현량의 비교 해석 장치는 또한, 보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량에 의해 적어도 2개의 검체 사이에서 표적 소형 RNA 발현량을 대비한 결과를 출력하는 출력 수단을 포함할 수 있다.

상기 보정 장치를 구비한 해석 장치의 구성의 개략을 나타내는 블럭도를 도 2에 나타낸다. 해석 장치(10)는 입력부(110), 표시부(120), 출력부(130), 기억부(140), 제어부(150), 변환부(160), 해석부(170)를 구비한다. 또한 도 3에는 본 발명에 의한 표적 소형 RNA 발현량의 보정처리의 플로챠트의 일례를 나타낸다.

입력부(110)는 해석 장치(10)의 동작에 관한 정보를 입력하는 수단이다. 키보드 등의 종래 공지의 입력 수단을 바람직하게 사용할 수 있다. 마이크로 어레이를 사용했을 경우, 하이브리다이제이션 앳세이에 의해 얻어지는 소형 RNA 발현량이나 표준 물질 추출량의 데이터는 예를 들면 본 발명의 장치와는 다른 스캐너 등의 판독 수단으로 판독되며, 수치 데이터로 변환된 후, 입력부(110)로부터 상기 수치 데이터를 해석 장치(10)에 입력해도 좋다. 또는 스캐너 등의 판독 수단이 본 발명의 해석 장치(10)에 포함되어 있어도 좋다(도면에는 나타내지 않는다).

입력부(110)로부터 입력된 발현량이나 추출량의 데이터, 또는 해석 장치(10)에 장착된 판독 수단에 의해 판독되어 수치화된 발현량이나 추출량의 데이터는 기억부(140)에 기억된다. 이 때, 기억부(140)는 복수의 검체의 각각에 대해서 동시에 측정된 복수의 표적 소형 RNA의 발현량 및 적어도 1종의 표준 물질의 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단으로서 작용한다.

기억부(140)에 격납된 각 검체의 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값 데이터는 경우에 따라서는 변환부(160)에 의해 밑이 2 등의 대수로 변환된다. 이어서, 해석부(170)에 의해, 각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값의 대표값이 취득된다. 대표값은 보정 방법에 대한 설명에서 설명한 바와 같이, 예를 들면 적어도 1종의 표준 물질량 측정값의 평균값 또는 중앙값(1종류의 표준 물질만을 보정에 사용하는 경우에도, 그것을 측정하기 위한 프로브 고정화 영역이 어레이 상에 복수개 존재하는 경우에는 대표값이 평균값 또는 중앙값이 될 수 있다), 또는 특정의 1종류의 표준 물질량의 측정값일 수 있다.

대표값이 취득된 후, 해석부(170)에 의해, 각 검체에 대해서 기준값과 각 검체의 표준 물질량의 대표값의 차 또는 비가 산출되어 보정 계수가 각각 취득된다. 보정 계수의 취득의 상세한 것은 보정 방법의 <보정 계수 취득 공정>에서 설명한 바와 같다. 또, 기준 검체 취득법이 채용될 경우에는 프로그램의 구성 상, 기준 검체로 된 제 1 검체에 관해서도 보정 계수 0(차를 산출할 경우) 또는 보정 계수 1(비를 산출할 경우)을 취득하는 구성으로 해도 지장이 없다.

장치(10)에 있어서 기준값을 입력하거나 또는 기준 검체를 선출하는 경우에는 장치(10)를 조작하는 자가 입력부(110)로부터 임의의 1검체를 지정함으로써 행해져도 좋다. 또는 장치(10)가 자동적으로 기준값을 선정해도 좋고, 기준 검체가 되는 1검체를 선출해도 좋다. 예를 들면 입력부(110)로부터 데이터가 입력되어 기억부(140)에 최초로 데이터가 기억된 검체가 장치(10)에 의해 기준 검체로서 선출될 수 있다. 이 기준 검체의 선출 또는 입력의 스텝은 도 3에서는 편의적으로 대표값 취득 공정(S-3) 후에 위치되어 있지만, 이것에 한정되지 않고, 보다 빠른 스텝에서, 예를 들면 데이터의 수용시에 실행되어도 좋다. 또는 또한, 미리 지정한 고정 수치를 기준값으로 해서 변환부(160) 등에 등록해 두어도 좋다.

이어서, 해석부(170)는 각 검체를 위한 보정 계수를 각각 사용해서 측정된 표적 소형 RNA 발현량 데이터를 보정한다. 보정 조작의 상세한 것은 보정 방법의 <보정 공정>에서 설명한 바와 같다. 또, 기준 검체 취득법이 채용될 경우에는 프로그램의 구성 상, 기준 검체로 된 제 1 검체의 표적 소형 RNA 발현량 데이터에 관해서도 보정 계수 0(차를 산출할 경우) 또는 보정 계수 1(비를 산출할 경우)을 사용한 보정 조작을 실행하는 것으로 해도 지장이 없다.

이어서, 해석부(170)에 의해 각 검체의 표적 소형 RNA 발현량의 대비나 통계적인 해석이 행해진다. 대비나 통계적인 해석의 결과는 출력부(130)에 의해, 표시부(120)에 출력되어 표시된다. 또한, 프린터 등의 출력 장치나 기록 매체 등에 대비 결과나 통계 해석 결과가 출력될 수 있다. 또한, 출력부(130)는 네트워크를 통해 장치 외부에 존재하는 데이터 베이스 등의 외부 기억 장치에 대비 해석 결과나 통계 해석 결과를 출력하도록 구성할 수도 있다.

기억부(140)는 복수의 소형 RNA의 발현량 및 복수의 표준 물질의 추출량의 측정값을 기억하는 것 이외에, 상기 각 공정에서 생기는 중간의 해석 결과도 적당하게 기억한다.

장치(10)의 상기한 각종 동작은 제어부(150)에 의해 제어된다. 구체적으로는 도 2의 파선 화살표로 나타내듯이, 입력부(110), 표시부(120), 출력부(130), 기억부(140), 제어부(150), 변환부(160), 해석부(170)의 각 수단에 대해서 제어부(150)로부터 제어 정보가 출력되고, 이 제어 정보에 의거하여 각 수단이 연휴해서 동작하여 장치(10) 전체가 동작한다.

또한 본 발명은 컴퓨터를 상기한 보정 장치 내지는 해석 장치로서 기능시키기 위한 프로그램을 제공한다. 상기 프로그램은 구체적으로는 컴퓨터를 상기한 각 수단(즉, 기억 수단, 대표값 취득 수단, 보정 계수 취득 수단, 보정 수단, 및, 해석 장치에 있어서는 또한 출력 수단)으로서 기능시키기 위한 프로그램이다. 또는 또한, 본 발명은 컴퓨터에 상기한 본 발명의 보정 방법 내지는 상기 보정 방법을 포함하는 비교 해석 방법의 각 공정을 실행시키기 위한 프로그램을 제공한다. 보정 방법에는 상기한 측정 공정, 대표값 취득 공정, 보정 계수 취득 공정, 및 보정 공정이 포함되고, 비교 해석 방법에 있어서는 또한, 보정 완료의 표적 소형 RNA 발현량에 의해 복수의 검체간에서 표적 소형 RNA 발현량을 대비하는 비교 해석 공정이 포함될 수 있다. 이들의 프로그램은 마이크로 어레이 등에 의해 표적 소형 RNA의 발현량과 동시에 측정된 표준 물질 추출량의 측정값의 데이터를 이용하여 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 컴퓨터에 실행시키는 프로그램이다.

또한 본 발명은 상기 중 어느 하나의 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체를 제공한다.

「기록 매체」는 플렉시블 디스크, 광자기 디스크, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD 등의 임의의 「가반용의 물리매체」(비일과성의 기록 매체)일 수 있다. 또는 LAN, WAN, 인터넷으로 대표되는, 네트워크를 통해 프로그램을 송신하는 경우의 통신회선이나 반송파와 같이, 단기에 프로그램을 유지하는 「통신 매체」일 수 있다.

「프로그램」이란 임의의 언어나 기술 방법으로 기술된 데이터 처리 방법이며, 소스 코드나 바이너리 코드 등의 형식을 묻지 않는다. 또, 「프로그램」은 반드시 단일적으로 구성되는 것에 한정되지 않고, 복수의 모듈이나 라이브러리로서 분산 구성되는 것이나, OS(Operating System)로 대표되는 별개의 프로그램과 협동 해서 그 기능을 달성하는 것도 포함한다. 또, 실시형태에 나타낸 각 장치에 있어서 기록 매체를 판독하기 위한 구체적인 구성, 판독 수순, 또는 판독후의 인스톨 수순 등에 대해서는 주지의 구성이나 순서를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직하게 사용될 수 있는, 복수의 표적 소형 RNA 포착 프로브와, 적어도 1종, 바람직하게는 복수의 표준 물질 포착 프로브가 고정화된 지지체를 포함하는 어레이 칩은 소형 RNA 발현 해석용 칩으로서 제공할 수 있다. 상기 칩에 대한 바람직한 조건은 본 발명의 측정 공정에 있어서 설명한 바와 같다.

실시예

이하, 본 발명을 인간 혈청 검체를 이용하여 본 발명의 보정 방법을 적용한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(표준 물질)

핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 실시예용의 표준 물질로서 독립행정법인 산업기술 종합 연구소로부터 정량 해석용 리보핵산(RNA) 수용액으로서 구입할 수 있는, 5종류의 RNA 수용액: 시료명 RNA500-A(서열 번호 1), RNA500-B(서열 번호 2), RNA500-C(서열 번호 3) (이상, 모두 핵산 길이 약 500염기의 RNA), RNA1000-A(서열 번호 4), 및 RNA1000-B(서열 번호 5) (이상, 모두 핵산 길이 약 1000염기의 RNA)로 이루어지는 인증 표준 물질 NMIJ CRM 6204-a, 및 본원 발명자들이 설계하여 유로핀제노믹스사에서 위탁 합성한 3종류의 RNA, hsncs_071028(서열 번호 15), hsncs_404161(서열 번호 16), hsncs_647981(서열 번호 17) (이상, 모두 핵산 길이 약 200염기의 RNA)의 RNA를 사용했다.

핵산 길이가 200염기미만의 핵산인 비교예용의 표준 물질로서 비특허문헌 1에서 나타내어져 있는 핵산 길이가 20염기인 비인간 유래의 miRNA인 cel-miR-39(서열 번호 6), cel-miR-54(서열 번호 7), ath-mir-159a(서열 번호 8), cel-miR-238(서열 번호 9)을 선택했다. 각 miRNA에 대해서 유로핀제노믹스사에서 5' 말단에 인산기 수식을 넣은 RNA로서 합성을 행했다. 또한, 유로핀제노믹스사로부터 판매되고 있는 비생물 유래이며 핵산 길이가 60염기인 5종류의 RNA, H2NC000001(서열 번호 10), H2NC000002(서열 번호 11), H2NC000003(서열 번호 12), H2NC000005(서열 번호 13), H2NC000006(서열 번호 14)을 사용했다.

각 표준 물질의 물리적 성질 등을 표 1에 나타낸다. 사용한 모든 표준 물질에 대해서 공공 데이터 베이스 BLAST에 수록되어 있는 모든 인간 유전자 전사 산물에 대해서 서열 상동성이 50%이하인 것을 확인했다.

(포착 프로브의 설계)

표적 소형 RNA로서 miRBase 릴리스 19로부터 입수한 2555종의 인간 miRNA를 선택하고, 그 상보 서열을 갖는 DNA를 표적 소형 RNA 포착 프로브로서 사용했다(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml).

실시예용의 표준 핵산 물질 포착 프로브로서는 상기 RNA500-A, RNA500-B, RNA500-C, RNA1000-A, RNA1000-B, hsncs_071028, hsncs_404161, hsncs_647981의 서열의 상보 서열을 갖는 DNA를 사용했다.

또한 비교예용의 표준 물질 포착 프로브로서는 miRBase로부터 입수한 cel-miR-39(22염기), cel-miR-54(24염기), ath-mir-159a(21염기), cel-miR-238(23염기)의 상보 서열을 갖는 DNA를 사용했다. 또한 시판의 상기 5종류의 RNA(H2NC000001, H2NC000002, H2NC000003, H2NC000005, H2NC000006)의 상보 서열을 갖는 DNA를 사용했다.

상기 표적 소형 RNA 포착 프로브 및 표준 핵산 물질의 포착 프로브는 3' 말단에 아미노기를 도입한 합성 DNA(유로핀제노믹스사에서 위탁 합성)를 사용했다.

(DNA 마이크로 어레이의 제작)

3' 말단에 아미노기를 도입한 상기 2555종의 표적 소형 RNA(miRNA) 포착 프로브 및 전체 17종의 표준 물질 포착 프로브를 도레이 카부시키가이샤제의 「3D-Gene」 (등록상표) 기판(3000주 기판)의 볼록부에 고정화하고, DNA 마이크로 어레이를 제작했다. 또, 표준 물질 포착 프로브는 각 8점에서 고정을 행했다. 이 DNA 마이크로 어레이를 이용하여 이하의 실험을 행했다.

(혈청 검체에의 표준 물질의 첨가와 핵산의 추출 공정)

혈청검체 300μL에 대해서 RNA 추출 시약인 3D-Gene RNA extraction reagent from liquid sample(도레이)을 900μL 혼합하고, 실시예에 있어서는 상기한 실시예용의 표준 물질인 RNA500-A, RNA500-B, RNA500-C, RNA1000-A, RNA1000-B, hsncs_071028, hsncs_404161 및 hsncs_647981 중 적어도 1종을 각 10f몰 첨가하고, 비교예에 있어서는 상기한 비교예용 표준 물질인 cel-miR-39, cel-miR-54, ath-mir-159a, cel-miR-238, H2NC000001, H2NC000002, H2NC000003, H2NC000005 및 H2NC000006 중 적어도 1종을 각 10f몰 첨가하고, 원심 분리 조작에 의해, 상층의 수층을 회수하고, miRNeasy mini 키트(키아겐사)를 이용하여 RNA를 정제했다.

(DNA 마이크로 어레이에 의한 표적 소형 RNA(miRNA)의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정 공정)

얻어진 표적 소형 RNA(miRNA)를 3D-Gene miRNA labeling kit(도레이)를 이용하여 표지했다. 표지한 miRNA는 3D-Gene miRNA chip(도레이사)의 표준 프로토콜에 따라 하이브리다이제이션과 세정을 행했다. 반응이 완료된 DNA 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 스캐너(도레이사)를 이용하여 형광 시그널을 검출했다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100%, 포토 멀티 플라이어의 전압 설정을 42%로 했다.

<실시예 1>

상기 수순에 따라 서열 번호 1∼5로 나타내어지는 실시예용 표준 물질(5종 모두) 또는 서열 번호 15∼17로 나타내어지는 실시예용 표준 물질(3종 모두)을 시판의 혈청검체 300μL에 첨가하고, 핵산의 추출 공정, 및 DNA 마이크로 어레이에 의한 표적 소형 RNA(miRNA)의 발현량 및 표준 물질의 존재량의 측정 공정을 실시했다. 이상의 공정은 그 측정 실험간에서의 발현량의 측정값의 변동(편차)을 보정하는 효과를 비교하기 위해서, 10회 반복해서 행했다.

그 결과, 2555종의 miRNA 중 약 1000종류의 miRNA가 검출되었다. 이 검출된 약 1000종류의 각 miRNA의 발현량의 10회의 측정 실험간에 있어서의 CV값(변동계수)의 검출된 약 1000종류의 miRNA 전체에서의 중앙값은 보정전에 있어서 0.45였다.

각 miRNA의 발현량의 보정은 이하와 같이 행했다. 우선, 각 회의 실험에 있어서의 각 표준 물질의 존재량을 DNA 마이크로 어레이 상의 8점의 측정값의 평균값으로서 구하고, 이것을 대표값으로서 산출했다. 다음에 1회째의 실험에 있어서의 표준 물질의 대표값을 기준값으로 하고, 2∼10회째의 실험의 대표값의 비를 보정 계수로서 취득했다. 이 보정 계수를 이용하여 2∼10회째의 실험에 있어서의 miRNA의 발현량의 측정값의 보정을 실시했다. 그 결과, 보정후에 있어서, 각 miRNA의 발현량의 10회의 측정 실험간에 있어서의 CV값의 검출된 약 1000종류의 miRNA 전체에서의 중앙값은 각각 0.32(서열 번호 1), 0.40(서열 번호 2), 0.40(서열 번호 3), 0.38(서열 번호 4), 0.30(서열 번호 5), 0.41(서열 번호 15), 0.36(서열 번호 16), 0.39(서열 번호 17)였다.

<비교예 1>

표준 물질로서 서열 번호 1∼5로 나타내어지는 실시예용 표준 물질 대신에 서열 번호 6∼14로 나타내어지는 비교예용의 표준 물질 9종을 사용하고, 실시예 1과 동일한 실험을 행했다.

보정전에 있어서의 검출된 약 1000종류의 각 miRNA의 발현량의 CV값의 중앙값은 0.45였다.

보정후에 있어서의 각 miRNA의 발현량의 CV값의 중앙값은 각각 1.07(서열 번호6), 1.14(서열 번호7), 0.98(서열 번호8), 0.99(서열 번호9), 0.94(서열 번호 10), 0.95(서열 번호 11), 0.84(서열 번호 12), 0.82(서열 번호 13), 0.88(서열 번호 14)이었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 실시예 1에서는 보정후의 표적 소형 RNA의 검출값의 CV값의 중앙값이 보정전의 0.45보다 작아진 것에 대해서 비교예 1에서는 보정전의 0.45보다 커졌다. 즉, 동일한 검체를 사용해서 핵산의 추출로부터 DNA 마이크로 어레이 실험까지를 동일 조건에서 복수회 행한 실험에 있어서의 그 실험간에서의 발현량의 변동(편차)의 보정에 있어서 비교예 1에 비해 실시예 1에서 사용한 표준 물질을 이용하여 보정을 행함으로써, 보정의 정확성이 향상되는 것이 나타내어졌다.

<실시예 2>

3명의 인간으로부터 채취한 혈청 A∼C의 3종류를 사용하고, 표준 물질로서 서열 번호 1∼5로 나타내어지는 실시예용 표준 물질을 사용해서 각 혈청에 대해서 핵산의 추출일과 실험자가 다른 조건에서 각 2회(1회째, 2회째)씩, 상기 순서로 혈청 검체에의 표준 물질의 첨가와 핵산의 추출 공정 및 DNA 마이크로 어레이에 의한 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 존재량의 측정 공정을 행했다. 표적 소형 RNA(miRNA)로서는 실시예 1과 마찬가지로 검출된 약 1000종류의 miRNA를 사용했다.

표적 소형 RNA인 각 miRNA의 측정값의 보정은 이하와 같이 행했다.

우선, 측정 공정에서 얻어진 각 표준 물질의 존재량을 DNA 마이크로 어레이 상의 8점의 측정값의 평균값으로서 산출하고, 이것을 밑이 2인 대수값으로 변환했다. 다음에 얻어진 5종의 표준 물질의 대수 변환값의 평균값을 산출하고, 이것을 대표값으로 했다. 이상과 같이 해서 각 혈청 A∼C에 대해서 1회째 및 2회째의 대표값을 산출했다. 각 표준 물질의 대수 변환값 및 그 평균값(대표값)을 표 2에 나타낸다.

혈청 A∼C의 2회의 실험간의 각 miRNA의 발현량의 보정은 1회째의 대표값을 기준값으로 하고, 2회째의 대표값과의 차(2회째-1회째)를 각 혈청에 있어서의 보정 계수로 했다(표 3).

다음에 각 혈청에 있어서의 miRNA의 발현량의 측정값을 각각 밑이 2인 대수로 변환하고, 각 혈청의 2회째의 대수 변환값으로부터 상기 각 혈청에 있어서의 보정 계수를 감산해서 보정을 실시했다.

이상의 조작에 의해, 2회째의 실험의 miRNA의 발현량의 측정값의 보정이 실시되었다.

<실시예 3>

표준 물질로서 서열 번호 15∼17로 나타내어지는 실시예용 표준 물질을 사용해서 실시예 2와 동일한 실험을 실시했다.

<비교예 2>

표준 물질로서 서열 번호 6∼9로 나타내어지는 비교예용 표준 물질을 사용해서 실시예 2와 동일한 실험을 실시했다.

<비교예 3>

표준 물질로서 서열 번호 10∼14로 나타내어지는 비교예용 표준 물질을 사용해서 실시예 2와 동일한 실험을 실시했다.

실시예 2, 실시예 3, 비교예 2, 비교예 3의 각 실험에 관해서 1회째(기준 검체)의 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값과 2회째(보정되는 검체)의 보정된 miRNA의 발현량의 측정값의 회귀 직선을 계산한 결과를 표 4에, 또한 가로축에 1회째(기준 검체, 보정 없음), 세로축에 2회째(보정되는 검체, 보정 있음)의 발현량을 플롯한 스캐터 플롯(혈청 A)을 도 4((A):실시예 2의 보정의 결과, (B):비교예 2의 보정의 결과)에 나타냈다.

1회째와 2회째의 실험은 동일한 혈청을 사용하고 있기 때문에, 본래, 양자의 결과(1회째의 검체의 결과와 보정을 받은 2회째의 검체의 결과)는 일치할 것이며, 그 경우, 회귀 직선은 y=x의 직선 상에 겹칠 것이다. 실시예 2, 3과 비교예 2, 3을 비교하면, 모두 그 경사는 동일했다. 그러나, 실시예 2, 3에서는 절편의 절대값이 <0.5이며 y=x의 직선과 거의 겹치는 결과가 얻어지는 것에 대해, 비교예 2, 3에서는 절편의 절대값이 >0.5이며, y=x의 직선으로부터는 크게 벗어났다.

이상과 같이, 실시예 2, 3에서는 2회의 측정 실험간에 있어서, 회귀 직선의 절편의 절대값이 0이며 y=x에 가까운 보정 데이터가 얻어지고 있으며, 보정후의 데이터의 정확성이 높은 것이 나타내어져 있다라고 할 수 있다. 한편, 비교예 2, 3에서는 회귀 직선의 절편의 절대값이 0.5보다 크고, 보정후의 데이터의 정확성이 낮은 것이 나타내어져 있다라고 할 수 있다.

이상의 실시예 1∼3 및 비교예 1∼3에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 보정 방법을 사용함으로써, 복수의 검체에 포함되는 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 정확한 데이터를 얻을 수 있어 표적 소형 RNA의 발현량의 정확한 해석이 가능하게 된다.

10: 해석 장치
110: 입력부
120: 표시부
130: 출력부
140: 기억부
150: 제어부
160: 변환부
170: 해석부

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Method for correction of small RNA expression level and apparatus therefor <130> PF547-PCT <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 533 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 1 gggcucgacu aguuaauacg guacaggaua accgaucggc uugcaacaua acggcguuaa 60 gaaugcggga gugcaguuuc cgauucucac aucaaucgcc aauaaggccu ugucgcaaua 120 uagacucaac gguucuagua gcugaucggu auuacgugac gcaaccgauu agacaugcac 180 aauuccuugg ucgcuauacu acggaaaucg ucagguacua uaacccgucg caggccuaau 240 acgugucguc acaucgccaa ccuaucguca gucggaaaga cguugcuguc uaccaucgaa 300 acuauuuacc gcuccgagau ucacgaguac gaacucacga ggaaguugcc cuauguaagg 360 uaucacucca gguacugcgc cgauaguacc aggugaucaa acgguugcaa gaaggccacg 420 acguaucggg cucuuuagac guacgcucga gauuaaacgc gcacugauuc acuuuagccc 480 ggaaugucuc ggugcgaugu agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 533 <210> 2 <211> 533 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 2 gggagacuaa aucucggcgu cgguucauac gcgcgaucgu uugcugucag ggcauacucg 60 aauccggacu ccgacaauua uaggccaucc ugaauagccg aucaugcgag ucacgauaag 120 gcaggcucug cgauaucccg auauacugga gaagcugaau cccaccuaga gcgaacuguc 180 agaggaucga ccucaggcuc gcuaucauca uaacggcgga cgaccugugu cacauuccga 240 acgcuacgug acgauauuau cugucgaaag gcauagaacg ccggucaaua uccugcggca 300 uucucuuuau caccggcuau aacuacuagg uuccgcagau auagacugcg cacggaacau 360 guagauagau cgaguagggu agcgauuuaa cgacucgacu uacagacaga gacguagaac 420 gucagacgag ugguaugccc accagaggcg auacaggcug uaccugcgua gcacuagagu 480 cgugcgucau gcggacccua ucuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 533 <210> 3 <211> 533 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 3 gggacuaaac gcacugaaua ccguacuaca acagacgaag uuguaaauag ccgugguaau 60 uaugaacgaa uauggccaug uguccgcuaa uccgcgguac uagccaguua gcaacugcac 120 caaucgcuca cgucaguggu ucuaugcaau augcuccagu acccuguaag uucgcaauca 180 auagacgcgc cuuacuccuc ucaagaaggg uaucugcaug agccgacaca ucaagaccca 240 auggacguuu gagcgagugg cuuggagagu auuaacgcac uaacucuucg aaggcuuacu 300 ucggcaaauc cgcgagcucc acuauuaaca ugccaauacg acaggaucaa uucugcgacu 360 gcacgaccga auuaugcacc uacuuuguga ggcacgagau ucgucuugca gcuauuuaaa 420 ggguuccagc uuauggauag gcgacucuuc agugcguaau aaagcaacgc ccaaucggca 480 uguuaccgga uaguacgggc gauaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 533 <210> 4 <211> 1033 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 4 gggcgauucg aagagguacg aguggacgcg uaagcgaaug accuagaccu cggcguuaau 60 uaggacccuc uaaucgcaaa cucgacucuc gucccaaucc aauggauguc cagugcucgg 120 uagcaugauc guaugaugcg uaucgcugcg aguagaggcc gacaaguaga ccggugcgaa 180 uuuggaggua cuuagccuca uaugagagcg ccuugaaauc acccagugcc gaucguagcg 240 gaagauuacu agacuccgca gggaaauccc accuguaacg acggaagagc gucacgauag 300 ccucuaacua uccgguucgc gacuauccgc uuaugugccu ccaccuaaug ugagaguuca 360 ccgaggcaaa ugaucuguca accgguguga ucaggacaua cgcuuaaugc cguagaagcc 420 cguaagcucu ccgcccuuua agagguugua gacggcaguu cuaaggucgu cgggucuaug 480 ccuugcgacc uaauaauacg accgugugcu uaugcggacu guccucuaau gaauaucgcu 540 uguccuaagc uggcgguacu agugcuuagg aucgcacacc ucaccacagu gcgcauuuaa 600 cccuguagau aacaugguag acaccgguaa aucgcguucg aauuucgccc aaucgaaggc 660 ccacaucacu acgucgccug uauucugaac cuugcgcugc acguagcaua uagagcguac 720 auucaaucua ccaguugccu ccgacugaag ucggcuagcg uaugacauag cgagcucuua 780 guucggugac uacuucuagc acucccaauu caagcucugc guuaucaggg ucggaagguu 840 agguucgaau uucgacaggc uaacagagcg auaagugaug aauccgcucc gggagcaucu 900 agacaauaac cgcgguuaag agaagggcga cauaagcgcg ggugucaacg uucaaaccag 960 uuguagccau cgcgauuacc cguugggaau cugaggcgac cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaa 1033 <210> 5 <211> 1033 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 5 gggauuccua ggacuguacu cucggugcgu ugaccauacg uaaggcgauc cuuugagugg 60 aucccauuac uacgcgucac accugcuuac ccucccaaua guugguucag uagcucucag 120 cgguucuggc agaguucgga ugaguuucug ccuaucaguu cauaggugcc cacgcauugg 180 guccacuccu cgccagaauu ugcgcauugc accauuacua caggcggcuu ugguuguacg 240 ucuaacguuc gcaccaacag gagucucagc ugaucauagg cccggacccu caauguucga 300 ugcgauucgu aagagggugu ucguguaagg cccaauacgu ugucaugccg gcuuagaaac 360 ccagucggac gcgucucuaa cacucggaug ugcagguaau agccuuuacc agcgcuucug 420 uacgaccaua cuuagagcuc gagaugccga caugaaagga uuccggagua cugaccugaa 480 uacacguuca uagcguaaau cggccgagau ucaacuuuac ggcacggaua cagcuccucu 540 accuauuucc gucgaagucu cucacgauag ucgcguacau uuagugggcg guacacacag 600 cacgucaacg ccaucgcacu cugaguuccc acuccacggu acguucacag cacguugccu 660 uaauaagcua cuucgguucc gagcagucaa ccuacuguuu ccggguuagc gcucugauca 720 gcacccguuu acugacacga accgcuaucg aauacugagu aggucgugug ccaauaacuu 780 ugguugcagc uaagcuaauc ggacggcgac uuuagcaagu aacucagccg uauuguuacg 840 cugaccguaa acgacgugag cgauugucgu agguuagcca uaacauaaag guuucccgaa 900 cgguagcaua guuaggccug uguccaguca gguaauacga gagaguaauu aacgcgaucu 960 aaugagaagc cgugcauguc gauccuuguu acggguguga aauaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaa 1033 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 6 ucaccgggug uaaaucagcu ug 22 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 7 uacccguaau cuucauaauc cgag 24 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 uuuggauuga agggagcucu a 21 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 9 uuuguacucc gaugccauuc aga 23 <210> 10 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 10 aacauaccgg ccucguccgu gcauuaaggu gggaacgaug auaaaggagc ucgauccauc 60 gcaugugac 69 <210> 11 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequnece <400> 11 gcauuugcga uacaaacgga acuuauuagu agcuaaguca agguucuagc guucgucccg 60 aucgaauga 69 <210> 12 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 12 ccgaguucag cgauaaccgu gaccaguaac gguacccuag cgcauagcgc ggauguccga 60 gucaagaaa 69 <210> 13 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 13 gucuugcaua uacccaccgc auguugcucg ucgcgacaua aacgacgaua ccucauauag 60 cacuuaguu 69 <210> 14 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 14 aggucagauu cuuauuagaa cguguguccg cuccgaccau agggcgcccg uuacucagac 60 gcguuugug 69 <210> 15 <211> 201 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 15 aaccggccga auaguacgug auaaccggcc gaauaguacg ugauaaccgg ccgaauagua 60 cgugaucucg cuaguaggua cggcuucacu cgcuaguagg uacggcuuca cucgcuagua 120 gguacggcuu cacuuucuag cuaaacgccu cguugcuuuc uagcuaaacg ccucguugcu 180 uucuagcuaa acgccucguu g 201 <210> 16 <211> 200 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 16 uucgacgggu aucguuuuag gcuccgacgg guaucguuuu aggcuccgac ggguaucguu 60 uuaggcucgc ccgcuauugu cgcguaauug cccgcuauug ucgcguaauu gcccgcuauu 120 gucgcguaau ugugcaugcg uaguaaccuc ugaagugcau gcguaguaac cucugaagug 180 caugcguagu aaccucugaa 200 <210> 17 <211> 204 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> designed sequence <400> 17 ggauugcaau cucgaguacc guuggauugc aaucucgagu accguuggau ugcaaucucg 60 aguaccguuc ucagcgaaau uuucggcguu acucagcgaa auuuucggcg uuacucagcg 120 aaauuuucgg cguuagcauu cccacgccau accuuuaugc auucccacgc cauaccuuua 180 ugcauuccca cgccauaccu uuau 204

Claims

복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정 방법으로서,
상기 복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출해서 핵산 시료를 얻는 추출 공정;
추출된 각 핵산 시료중에 존재하는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 각각 측정하고, 각 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정값을 얻는 측정 공정;
각 검체에 대해서 표준 물질의 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는 대표값 취득 공정;
표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 대표값 취득 공정에서 취득된 각 검체의 표준 물질의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 취득하는 보정 계수 취득 공정;
취득된 각 보정 계수를 각각 사용해서 각 검체에 대해서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량을 보정하는 보정 공정;
을 포함하는 보정 방법.
제 1 항에 있어서,
표준 물질의 핵산 길이가 200염기이상 1200염기이하인 보정 방법.
제 2 항에 있어서,
적어도 1종의 표준 물질이 서열 번호 1∼5 및 15∼17에 나타내는 염기서열의 핵산인 표준 물질로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 보정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
2종류이상의 표준 물질을 사용하는 보정 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
검체가 체액 유래 검체인 보정 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
표적 소형 RNA가 miRNA인 보정 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출 공정에 있어서의 핵산 시료의 추출이 페놀·클로로포름법에 의해 행해지는 보정 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 측정 공정이, 표지 물질로 표지된 핵산 시료를 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브 및 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브와 접촉시켜서 하이브리다이제이션을 행하고, 각 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량을 시그널 강도 측정값으로서 얻는 것을 포함하는 보정 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대표값 취득 공정에서 취득되는 대표값이 적어도 1종의 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 산출된, 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값인 보정 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기준값은 표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 정해진 고정 수치, 또는 상기 복수의 검체로부터 임의로 선택된 제 1 검체에 대해서 취득된 표준 물질 추출량의 대표값인 보정 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보정 공정에서는,
(a) 상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 대표값으로부터 상기 기준값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값으로부터 보정 계수를 감산하는 것,
(b) 상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 기준값으로부터 상기 대표값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 가산하는 것,
(c) 상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 대표값을 상기 기준값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값을 보정 계수로 제산하는 것, 또는
(d) 상기 보정 계수 취득 공정에 있어서, 상기 기준값을 상기 대표값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 승산하는 것,
에 의해 상기 보정을 행하는 방법.
복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위해서 발현량을 보정하는 장치로서,
복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용하여 측정된, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단과;
각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는 대표값 취득 수단과;
표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 상기 대표값 취득 수단에 의해 취득된 각 검체의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단과;
상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 보정 계수를 이용하여 상기 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단
을 포함하는 상기 장치.
제 12 항에 있어서,
상기 대표값이 적어도 1종의 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 산출된, 대수값으로 나타내어진 평균값 또는 중앙값인 장치.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
표적 소형 RNA가 miRNA인 장치.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보정 수단은,
(a) 상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 대표값으로부터 상기 기준값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값으로부터 보정 계수를 감산하는 것,
(b) 상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 기준값으로부터 상기 대표값을 감산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 가산하는 것,
(c) 상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 대표값을 상기 기준값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값을 보정 계수로 제산하는 것, 또는
(d) 상기 보정 계수 취득 수단에 있어서, 상기 기준값을 상기 대표값으로 제산한 값을 보정 계수로서 취득할 경우, 표적 소형 RNA의 발현량의 측정값에 보정 계수를 승산하는 것,
에 의해 상기 보정을 행하는 장치.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기억 수단에 기억되는, 복수의 검체에 있어서의 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값은 표지 물질로 표지된 핵산 시료를, 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브 및 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브와 접촉시켜서 하이브리다이제이션을 행하고, 각 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량을 시그널 강도 측정값으로서 각각 측정한 값인 장치.
복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정을 하기 위해서 1개 또는 복수의 컴퓨터에,
복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용하여 각 핵산 시료중에 존재하는 표적 소형 RNA 및 표준 물질의 양을 각각 측정하고, 각 검체에 대해서 표적 소형 RNA의 발현량 및 표준 물질의 추출량의 측정값을 얻는 측정 공정;
각 검체에 대해서 표준 물질의 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는 대표값 취득 공정;
표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 대표값 취득 공정에서 취득된 각 검체의 표준 물질의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 취득하는 보정 계수 취득 공정; 및
취득된 각 보정 계수를 각각 사용하여 각 검체에 대해서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량을 보정하는 보정 공정
을 실행시키기 위한 프로그램.
복수의 검체간에서 표적 소형 RNA의 발현량을 비교 해석하기 위한 발현량의 보정을 하기 위해서 1개 또는 복수의 컴퓨터를,
복수의 각 검체에 핵산 길이가 200염기이상의 핵산인 적어도 1종의 표준 물질을 첨가한 후, 각 검체로부터 핵산을 추출함으로써 얻어진 핵산 시료를 이용하여 측정된, 각 검체에 대한 표적 소형 RNA 발현량 및 표준 물질 추출량의 측정값을 기억하는 기억 수단;
각 검체에 대해서 표준 물질 추출량의 측정값으로부터 대표값을 취득하는 대표값 취득 수단;
표준 물질의 추출량에 관해서 임의로 설정된 기준값과, 상기 대표값 취득 수단에 의해 취득된 각 검체의 대표값의 차 또는 비를, 각 검체를 위한 표적 소형 RNA 발현량의 보정 계수로서 각각 취득하는 보정 계수 취득 수단; 및
상기 보정 계수 취득 수단에 의해 취득된 각 보정 계수를 이용하여 상기 각 검체에 있어서 측정된 표적 소형 RNA의 발현량의 보정을 행하는 보정 수단
으로서 기능시키기 위한 프로그램.
제 17 항 또는 제 18 항에 기재된 프로그램을 기록한 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.
복수의 표적 소형 RNA를 포착하기 위한 프로브와, 서열 번호 1∼5 및 15∼17에 나타내는 염기서열의 핵산인 표준 물질로부터 선택되는 적어도 1종의 표준 물질을 포착하기 위한 프로브가 고정화된 지지체를 포함하는 소형 RNA 발현 해석용 칩.