CN107109397B

CN107109397B - 小型rna的表达量的修正方法和装置

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Publication number: CN107109397B
Application number: CN201580062576.3A
Authority: CN
Inventors: 近藤哲司; 小园聪子
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: EP3225689A4; JP6705171B2; CA2974433C; US20170351809A1; CA2974433A1; JPWO2016084848A1; EP3225689A1; KR102380453B1; KR20170081169A; WO2016084848A1; EP3225689B1; US10622093B2; CN107109397A; BR112017009009A2

Abstract

为了在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析，而公开了能够利用标准物质正确地修正该表达量的测定值的方法。在本发明的小型RNA表达量的修正方法中，使用核酸长度为200个碱基以上的核酸作为标准物质。将一定量的上述标准物质添加到一定量的各样本中，从样本提取核酸，测定提取的各目标小型RNA和标准物质的量，使用标准物质的提取量的测定值修正目标小型RNA的表达量。根据本发明，能够比现有方法更正确地进行各样本之间的小型RNA的表达量的修正。

Description

小型RNA的表达量的修正方法和装置

技术领域

本发明涉及用于对多个样本所含的目标小型RNA的表达量进行比较分析的表达量修正方法和进行该表达量修正的装置。

背景技术

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是不编码蛋白质的RNA的总称，大致分为持家RNA和调控类RNA。存在各种长度的ncRNA，特别是小于200个碱基的分子被称为小型RNA(small RNA)。

作为持家RNA，已知核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、参与剪接的核内小分子RNA(snRNA)、参与rRNA的修饰的核仁小分子 RNA(snoRNA)等。

调控类RNA作为对生物体功能的阐明发挥重要功能的因子近年来特别受到关注，最近逐渐明确了其调节基因表达、RNA的细胞内分布，对基因表达抑制机制发挥重要作用。由该调控类RNA发挥功能的基因表达抑制机制被称为RNA干涉(RNAi)，1988年在使用线虫的实验中被发现，然后证明了在果蝇、哺乳类细胞中也存在同样的机制。作为该调控类RNA的ncRNA链长为约20～25个碱基，其作用机制大体分为通过微 RNA(miRNA)的翻译抑制，和利用小干涉RNA(small interference RNA， siRNA)的目标mRNA的切割以及介由目标DNA区域的异染色质化的基因沉默。

miRNA由基因组DNA作为发夹样结构的RNA(前体)转录出来。该前体被具有特定的酶RNase III切割活性的dsRNA切割酶(Drosha、Dicer) 切割后，变成双链的形态，然后变成单链。并且，认为一条反义链被称为 RISC的蛋白质复合体摄入，参与mRNA的翻译抑制。这样，因为miRNA 在转录后各阶段其形态不同，所以通常在以miRNA为目标(检测对象)的情况下，需要考虑发夹结构体、双链结构体、单链结构体等各种形态。miRNA 由15～25个碱基的RNA组成，在各种生物中确认了其存在。

近年来发现，miRNA不仅在细胞内存在，在不含细胞的样本(生物体试样)血清、血浆、尿、脊髓液等体液中也较多存在，启示其表达量可能成为以癌为代表的各种疾病的生物标志物。miRNA在2014年6月的现在，在人中存在2500种以上(miRBase Release 20)，在利用高灵敏度的DNA 微阵列等测定体系的情况下，其中超过1000种的miRNA能够在血清·血浆中同时检测到表达。于是，进行了使用DNA微阵列法以血清·血浆、尿、脊髓液等体液为对象的生物标志物探索研究。

已知在使用DNA微阵列进行基因表达分析时，根据样本、实验者、实验条件不同，所得的测定值(数据)可能产生误差。因此，考察了用于修正误差的测定值的修正方法。修正中通常常用以对于任何样本，在取多个基因的表达量的测定值一起作为基因表达数据群的情况下，表达量都没有差异这样的原理为前提的方法，是整体归一化(globalnormalization)法、分位数(quantile)法、局部加权回归散点平滑法(lowess)法、75％分位数(75 percentile)法等。但是这些修正方法有仅能在某一定数量以上整体地检测基因时使用这样的缺点。

另一方面，还进行了着眼于样本之间表达量相同的特定的基因(β-肌动蛋白、GAPDH等)，对样本逐个修正数据使得该基因的测定值为一定的方法。

即使在通过DNA微阵列分析小型RNA的情况下，也使用如上所述的在基因表达分析中使用的整体归一化(global normalization)法、分位数 (quantile)法、局部加权回归散点平滑法(lowess)法、75％分位数(75 percentile)法这样的修正方法，但在仅检测特定基因的情况下不能使用这些方法。另一方面，作为修正使得特定基因的表达量为一定的方法，提出了使用样本中表达的小型RNA中的持家RNA(U1snoRNA、U2snoRNA、 U3snoRNA、U4snoRNA、U5snoRNA、U6snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNA) 进行修正的方法(专利文献1、专利文献2)。

在专利文献1、专利文献2中，修正miRNA的检测结果使在检测作为小型RNA的miRNA时同时检测的5S rRNA的检测值在全部样本中为一定，但不能保证它们在样本之间以一定量表达。

另外，在专利文献3中，在检测作为小型RNA的miRNA时同时检测 mRNA，以其代表值修正miRNA的检测结果，但该方法也是能够在保证所检测的mRNA的正态分布的某一定数量以上的数量的mRNA的检测中应用的方法。

因此，为了修正实验之间的基因表达量的误差，提出了在实验的工序中使用作为核酸的标准物质，使用其检测到的存在量来修正实验之间的误差的方案(专利文献4～6)。专利文献4、5提示了作为核酸的标准物质或检测该标准物质的探针核酸的序列及设计方法，显示了其扩增工序、检测工序中的精度，由此能够评价检测方法的性能，但没有实际显示进行包含从样本提取核酸的提取工序的实验之间的误差的修正。另外，专利文献6也显示了作为用于修正样本中的基因表达的检测值的误差的核酸的标准物质的序列，但从核酸的扩增工序开始使用该序列，仅能够修正扩增工序的实验之间的误差。

即，上述专利文献4～6所示的方法仅限于有充分量的从样本提取的核酸、能够高精度地定量所使用的核酸的情况，能够进行包括核酸的扩增、检测在内的测定工序的精度评价和误差修正，但实际进行实验之间的测定结果的修正时，特别是在处理微量的样本的情况、作为样本处理体液的情况下，提取的目标小型RNA量非常微量，不能高精度地测定该小型RNA 量，因此实质上不可能通过这样的方法进行修正。因此，对不仅包含小型 RNA的检测工序、也包含从样本的提取工序在内的实验之间的误差进行修正非常重要。

因此，作为对也包含从样本的提取工序的实验之间的误差进行评价·修正的方法，一直以来研究了使用标准物质的方法，到目前为止，研究了使用作为与小型RNA同样碱基长度的核酸的标准物质进行修正。例如，提出了如非专利文献1所示的使用与miRNA同样的碱基长度的20个碱基左右的短RNA作为标准物质，将其在样本中加入一定量进行提取，从而修正各实验的提取工序中的目标小型RNA的提取工序的误差的方法。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-75095号公报

专利文献2：日本特开2007-97429号公报

专利文献3：日本特开2014-007995号公报

专利文献4：日本特开2011-239708号公报

专利文献5：日本特许第5229895号公报

专利文献6：美国专利申请公开第2010/0184608号说明书

非专利文献

非专利文献1：Nobuyuki Kosaka Edit.,“Circulating MicroRNAs: Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)”,p1-p10,Human Press,New York(2013)

发明内容

发明要解决的课题

在样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析时，需要修正样本之间的实验条件的误差、特别是从样本提取核酸的工序中的提取效率的差。作为一直以来常用的方法，有整体归一化(global normalization)、使用持家RNA的方法，但如上所述对于小型RNA，有需要整体地检测大量小型RNA、不存在能在样本之间保证一定量的表达的持家RNA等缺点，在比较分析中不能说有效。

另外，关于使用标准物质的修正方法，如上所述一直以来研究了使用作为与目标小型RNA同样碱基长度的核酸的标准物质进行修正，但实际上如果使用这些与小型RNA同样碱基长度的RNA作为标准物质，特别在使用体液作为样本的情况下，由于样本的各种条件、其所含的各种夹杂物的影响，从样本提取标准物质的提取效率不稳定，作为结果测定值变得不稳定，不能保证精度，因此不能在实验之间的测定结果的修正中使用。

如上所述，到目前为止没有用于对从各样本提取的目标小型RNA的表达量进行比较分析的、能够正确地修正样本之间的表达量的测定值的、利用标准物质的有效修正方法。

用于解决课题的方法

本申请发明者们进行深入研究，结果发现，在用于对多个样本所含的目标小型RNA的表达量进行比较分析的表达量的修正方法中，通过相对于多个样本一定量，在样本中添加作为核酸长度比小型RNA长得多的200 个碱基以上的核酸的标准物质，从样本提取核酸，在测定提取的各目标小型RNA的表达量的同时测定标准物质的存在量，使用标准物质的存在量的测定值进行修正，从而能够比以往更正确地进行各样本之间的表达量的修正，从而完成了以下发明。

(1)一种修正方法，是用于对多个样本中的目标小型RNA的表达量进行比较分析的表达量的修正方法，包括：

提取工序，对所述多个样本的各样本添加至少1种标准物质，然后从各样本提取核酸而获得核酸试样，所述标准物质是核酸长度为200个碱基以上的核酸；

测定工序，分别测定所提取的各核酸试样中存在的目标小型RNA和标准物质的量，对于各样本获得目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量的测定值；

代表值获得工序，对于各样本，从标准物质的提取量的测定值获得代表值；

修正系数获得工序，作为用于各样本的目标小型RNA表达量的修正系数，获得对于标准物质的提取量任意设定的基准值、与通过代表值获得工序获得的各样本的标准物质的代表值的差或比；

修正工序，分别使用获得的各修正系数，来修正对于各样本测定的目标小型RNA的表达量。

(2)根据(1)所述的修正方法，标准物质的核酸长度为200个碱基～1200 个碱基。

(3)根据(2)所述的修正方法，至少1种标准物质包含选自作为序列号 1～5和15～17所示碱基序列的核酸的标准物质中的至少1种。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的修正方法，使用2种以上的标准物质。

(5)根据(1)～(4)的任一项所述的修正方法，样本是来自体液的样本。

(6)根据(1)～(5)的任一项所述的修正方法，目标小型RNA是miRNA。

(7)根据(1)～(6)的任一项所述的修正方法，所述提取工序中的核酸试样的提取通过酚-氯仿法来进行。

(8)根据(1)～(7)的任一项所述的修正方法，所述测定工序包括：使被标记物质标记的核酸试样，与固定化在支持体上的用于捕捉多个目标小型 RNA的探针和用于捕捉至少1种标准物质的探针接触而进行杂交，作为信号强度测定值获得各目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量。

(9)根据(1)～(8)的任一项所述的修正方法，通过所述代表值获得工序获得的代表值是由至少1种标准物质提取量的测定值计算出的、用对数值表示的平均值或中央值。

(10)根据(1)～(9)的任一项所述的修正方法，所述基准值是，对于标准物质的提取量任意设定的固定数值，或者对于从所述多个样本中任意选择的第1样本获得的标准物质提取量的代表值。

(11)根据(1)～(10)的任一项所述的方法，在所述修正工序中，如下进行所述修正，

(a)在所述修正系数获得工序中将所述代表值减去所述基准值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值减去修正系数来进行所述修正，

(b)在所述修正系数获得工序中将所述基准值减去所述代表值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值加上修正系数来进行所述修正，

(c)在所述修正系数获得工序中将所述代表值除以所述基准值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值除以修正系数来进行所述修正，或

(d)在所述修正系数获得工序中将所述基准值除以所述代表值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值乘以修正系数来进行所述修正。

(12)一种装置，是为了对多个样本中的目标小型RNA的表达量进行比较分析而对表达量进行修正的装置，所述装置包含：

记忆单元，记忆对于各样本使用核酸试样测定的目标小型RNA表达量和标准物质提取量的测定值，所述核酸试样是通过对多个样本的各样本添加至少1种标准物质，然后从各样本提取核酸而获得的，所述标准物质是核酸长度为200个碱基以上的核酸；

代表值获得单元，对于各样本，从标准物质提取量的测定值获得代表值；

修正系数获得单元，作为用于各样本的目标小型RNA表达量的修正系数，分别获得对于标准物质的提取量任意设定的基准值、与通过所述代表值获得单元获得的各样本的代表值的差或比；和

修正单元，使用通过所述修正系数获得单元获得的各修正系数，来进行在该各样本中测定的目标小型RNA的表达量的修正。

(13)根据(12)所述的装置，所述代表值是由至少1种标准物质提取量的测定值计算出的、用对数值表示的平均值或中央值。

(14)根据(12)或(13)所述的装置，目标小型RNA是miRNA。

(15)根据(12)～(14)的任一项所述的装置，所述修正单元如下进行所述修正，

(a)在所述修正系数获得单元中将所述代表值减去所述基准值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值减去修正系数来进行所述修正，

(b)在所述修正系数获得单元中将所述基准值减去所述代表值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值加上修正系数来进行所述修正，

(c)在所述修正系数获得单元中将所述代表值除以所述基准值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值除以修正系数来进行所述修正，或

(d)在所述修正系数获得单元中将所述基准值除以所述代表值而得的值作为修正系数获得的情况下，通过目标小型RNA的表达量的测定值乘以修正系数来进行所述修正。

(16)根据(12)～(15)的任一项所述的装置，所述记忆单元中记忆的、多个样本中的目标小型RNA的表达量和标准物质提取量的测定值，是使被标记物质标记的核酸试样，与固定化在支持体上的用于捕捉多个目标小型 RNA的探针和用于捕捉至少1种标准物质的探针接触而进行杂交，作为信号强度测定值分别测定各目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量而得的值。

(17)一种程序，用于为了进行表达量的修正而使1台或多台计算机执行以下工序，所述表达量的修正用于在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析，

测定工序，使用核酸试样，分别测定各核酸试样中存在的目标小型 RNA和标准物质的量，对于各样本获得目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量的测定值，所述核酸试样是通过对多个样本的各样本添加至少 1种标准物质，然后从各样本提取核酸而获得的，所述标准物质是核酸长度为200个碱基以上的核酸；

修正系数获得工序，作为用于各样本的目标小型RNA表达量的修正系数，获得对于标准物质的提取量任意设定的基准值、与通过代表值获得工序获得的各样本的标准物质的代表值的差或比；和

(18)一种程序，用于为了进行表达量的修正而使1台或多台计算机作为以下单元发挥功能，所述表达量的修正用于在多个样本之间对目标小型 RNA的表达量进行比较分析，

(19)一种计算机可读取的记录介质，记录了(17)或(18)所述的程序。

(20)一种小型RNA表达分析用芯片，包含固定化了用于捕捉多个目标小型RNA的探针和用于捕捉至少1种标准物质的探针的支持体，所述至少1种标准物质选自作为序列号1～5和15～17所示碱基序列的核酸的标准物质。

发明的效果

根据本发明，在测定从样本提取的小型RNA的表达量、在样本之间对小型RNA表达量进行比较时，能够比以往更正确地修正目标小型RNA 表达量。由此，能够更正确地进行样本之间的目标小型RNA的比较分析。

附图说明

图1是本发明的方法的概念图。

图2是显示本发明的分析装置的构成的概略的方框图。

图3是本发明的目标小型RNA的表达量的修正处理的流程图的一例。

图4：(A)是进行实施例2的修正后的散点图，以及(B)是进行比较例2 的修正后的散点图。

具体实施方式

本发明所说的标准物质，是为了在提取工序至测定工序中，与包含目标小型RNA的样本稳定地共存，通过在测定作为目的的小型RNA的表达量的同时测定该标准物质的存在量，从而获得用于修正多个样本的测定之间的目标小型RNA的表达量的测定值的变化(测定之间的偏差或误差)的基准而使用的物质。即，可以以标准物质的存在量为基准，修正多个样本的测定之间的目标小型RNA的表达量的测定值。

首先，关于使用本发明标准物质的目标小型RNA的表达量的修正方法的概念，基于图1进行说明。

在图1中，将从样本提取的核酸进行标记，用固定了用于捕捉多种目标小型RNA的探针(以下也称为“小型RNA捕捉探针”)和用于捕捉标准物质的探针(以下也称为“标准物质捕捉探针”)的微阵列进行检测，将结果通过信号值的直方图示意性地显示。以下，也将用于捕捉小型RNA的探针或用于捕捉标准物质的探针总称为“捕捉探针”或仅称为“探针”。

在图1A中，分别使用DNA微阵列来分析从样本A和样本B提取的目标小型RNA，将分析结果用直方图显示。分别显示从装载于微阵列的多个目标小型RNA捕捉探针获得的测定值的代表值。在样本A与样本B之间，小型RNA的直方图较大地偏离。这可以解释为在样本之间小型RNA 的表达量有较大差异。另一方面，也可以解释为由于实验误差、特别是从样本的提取核酸的核酸提取工序中的核酸提取效率而产生差异。哪一种解释正确，仅从miRNA的直方图无法判断。

图1A所示的、从作为核酸的标准物质捕捉探针获得的测定值的代表值在样本A与样本B之间显示几乎相同的分布。即，可以判断样本A与样本B正确地供给实验，无实验误差。此时，样本AB之间小型RNA的表达量有较大差异，在进行样本之间的比较时不需要修正小型RNA的测定值。

在图1B中，示意性地显示使用DNA微阵列分析样本C和样本D的结果。分别显示从小型RNA捕捉探针得到的测定值的直方图、和从标准物质捕捉探针得到的测定值的代表值。

在样本C与样本D之间，小型RNA的测定值的直方图显示相同的分布。另一方面，从标准物质捕捉探针得到的测定值的代表值在样本C与样本D之间较大地偏离。由此可知样本C与样本D的检测结果由于某些原因而产生了实验误差。在这样的情况下，在进行样本CD之间的比较时需要适当修正小型RNA的测定值。

将按照本发明修正目标小型RNA的测定值之后的直方图示于图1C。修正的具体方法如后所述。修正样本C的数据，使得从样本C与样本D 的标准物质捕捉探针得到的测定值一致。通过该修正，从标准物质捕捉探针得到的测定值的代表值在样本C与样本D之间变得一致，使用相同的修正系数修正后的目标小型RNA捕捉探针的测定值的直方图较大地偏离。即，样本CD之间小型RNA的表达量有较大差异。

在本发明中，在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析(测定)。样本数可以为2个，也可以为3个以上。这里所说的多个样本之间的测定包括多种不同的目标小型RNA的测定、多次测定同一目标小型RNA时的各样本的测定、或组合了这两者的测定。

本发明中的“小型RNA”是指在生物体内产生的碱基长度小于200个碱基的RNA。可例示例如，核糖体RNA(5S rRNA、5.8S rRNA)、转运 RNA(tRNA)、核仁小分子RNA(smallnuclear ribonucleoprotein particle RNA，snoRNA)、核内小分子RNA(small nuclearRNA，snRNA)、微 RNA(miRNA)、作为受到加工前的未成熟miRNA的颈环状的前体小干涉 RNA(pre-miRNA)及双链的miRNA/miRNA duplex(双链体)等，但不限于这些。作为优选的小型RNA的例子可列举miRNA。

＜标准物质＞

在本发明中，在用于对目标小型RNA的表达量进行比较分析的提取工序和测定工序中，相对于目标小型RNA，标准物质以一定的含量存在。特别是在提取工序中，优选以与目标小型RNA同样的提取效率提取作为核酸的标准物质。

本发明中使用的标准物质是核酸。其核酸长度是比目标小型RNA长的200个碱基以上，优选为200个碱基～1200个碱基，更优选为500个碱基～1200个碱基。一般来说，单链RNA如果核酸长度为200～300个碱基以上，则链内容易形成氢键而能够保持物理地稳定化的状态，和/或通过与各种盐、脂质类、蛋白质等结合而能够保持化学地稳定化的状态。另一方面，如果作为核酸的标准物质的核酸长度小于200个碱基，则从样本的提取效率、测定结果受提取时的条件、样本的条件、样本所含的夹杂物的影响而在实验之间有较大偏差，特别令人担心以与小型RNA以不同的提取效率被提取。

另外，标准物质优选具有以下(1)、(2)的性质。

(1)GC含量为30～70％的范围。

(2)Tm值为10℃～95℃。

其中(1)GC含量可以从所使用的标准物质的碱基序列中的A,T,G,C全部碱基中的G,C的存在比例求出。GC含量越高则氢键数越增加，因而核酸的结构、性质倾向于稳定，但过高则测定时的序列特异性降低。因此，标准物质的GC含量优选为30～70％的范围，更优选为40～60％的范围。

(2)Tm值可以基于标准物质的碱基序列使用最近接碱基对(Nearest Neighbor)法(PNAS,1998,95:1460-1465)等计算出。一般可以说Tm值越高则核酸的结构稳定性越高，标准物质的Tm值优选为10℃～95℃，更优选为30℃～95℃，进一步优选为86℃～95℃。

本发明中使用的标准物质如果考虑测定工序，则优选选择与所使用的样本中所含的基因转录产物不交叉杂交的核酸。具体地，可以利用同源性检索程序，相对于公共数据库中收录的与目标小型RNA相同生物种的所有基因转录产物序列，选择同源性为50％以下的核酸。其中，作为同源性检索程序，不特别限定，可以应用例如FASTA、BLAST、MegaBlast这样的公共程序。另外，作为公共数据库，不特别限定，可以使用存储了基因转录产物的序列信息的Genbank(NCBI)、EMBL(EBI)、Ensembl、 miRbase等数据库。

本发明中使用的标准物质可以应用核酸的有机化学合成法来制作，或者应用生物合成方法来制作，所述生物合成方法是使用将标准物质的序列插入质粒等中而得的载体在大肠杆菌等微生物宿主内合成的方法，在标准物质的序列的上游部插入能够识别T7启动子等RNA合成酶的序列、通过 T7聚合酶等酶来合成的方法等。另外，能够作为用于分析装置、分析方法的妥当性评价、精度管理的基准利用的核酸标准物质是公知的，也有市售品，所以本发明中也可以使用这样的公知的核酸标准物质作为标准物质。

标准物质不仅包含单链状态的核酸，还可以包含与互补链一起形成双链的核酸。另外，为了与目标小型RNA化学性质一致，可以一部分包含天然存在的核酸的碱基序列，也可以包含天然不存在的碱基序列。另外，同一的碱基序列可以是多次重复或随机多次配置的序列，序列的一部分可以包含起始密码子、终止密码子。另外，序列的两侧或一侧可以付与多聚 A等引物位点。

标准物质优选为DNA或RNA，也可以使用PNA、LNA等人工核酸等核酸衍生物。其中，核酸衍生物是指包含利用荧光基团等的标记化衍生物、修饰核苷酸(例如，包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸、和受到碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的置换等的核苷酸等)的衍生物。另外，末端可以被各种官能基修饰，作为这样的官能基，可列举磷酸基、氨基、硫醇基等。

在本发明的方法中，标准物质可以使用1种，也可以使用多种。另外，也可以以与蛋白质结合的状态、内包在由脂质类形成的囊泡中的状态使用。

＜样本＞

作为能够在本发明的方法中使用的样本，不特别限定，可列举例如，血液、血清、血浆、尿、便、髓液、唾液、拭子液、脑脊髓液、汗、泪液、精液、淋巴液、关节液等各种组织液或体液、各种组织、细胞的冷冻样本或石蜡包埋样本(FFPE)或其切片、培养细胞、组织而得的培养液等、从生物体分离的样本即生物体试样。另外，可列举各种饮食物或其稀释物等。因为在一定量的样本中添加一定量的标准物质使用，所以特别优选是体液。另外，进行比较分析的多个样本可以是来自不同组织的多个样本，也可以是来自从不同生物体分离的同一组织的多个样本，另外，也可以是来自同一组织内的不同部位(例如，肿瘤等病变部与非病变部)的多个样本。

＜向样本添加标准物质＞

在本发明的方法中，相对于一定量的样本添加一定量的标准物质。对于此时的量的单位不特别限定，可以是重量也可以是体积。另外，在添加一定量的标准核酸的溶液时，测定标准物质的溶液的一定量时的单位可以使重量、体积、摩尔数等任何单位。作为测定标准物质的量的方法，可以采取吸光度测定法、电泳法、柱法、毛细管电泳法等已知的各种方法。

在提取核酸之前，相对于一定量的样本添加一定量的标准物质。在本发明中，优选将样本混合在提取溶液中，在通过胍盐等使可能在样本中存在的核酸分解酶失活之后添加标准物质，更优选在分离包含RNA的溶液之前添加标准物质。

标准物质可以以溶液状态添加也可以以干燥的固体状态对样本添加，为了正确地添加一定量，优选以溶液状态添加，更优选以几μL～几百μL 的量添加。以溶液添加时，通常使用移液器，但难以正确地秤量为不足μL 级别，如果为mL级别以上，则相对于样本的体积变大，提取溶液的组成变大，因此担心影响之后的提取操作。在制作此时的标准物质的溶液时，其溶剂优选使用水或PBS等缓冲溶液。

另外，添加的标准物质的量优选以与最终样本所含的目标小型RNA 相同程度的浓度的方式对样本添加。小型RNA根据样本的种类所含的浓度不同，在样本是体液的情况下，优选以摩尔浓度单位为z(zepto)mol/mL～ p(pico)mol/mL，更优选为a(atto)mol/mL～f(femto)mol/mL的浓度对样本添加标准物质。其浓度的测定方法可列举吸光度测定法、荧光法、电泳法、柱法、毛细管电泳法等。

另外，核酸提取之后可以通过用吸光度测定法、荧光法、电泳法、柱法、毛细管电泳法等测定提取溶液，确认目标小型RNA和标准物质的存在，或者测定其量。

＜提取工序＞

在本发明中，在标准物质共存下进行从各样本提取包含目标小型RNA 的核酸的提取处理(提取工序)。添加在各样本中的标准物质也与目标小型 RNA一起被提取，所以通过该提取工序从各样本得到的核酸试样包含目标小型RNA和标准物质。

关于从样本提取核酸的方法，可以使用已知的各种方法，优选使用作为提取RNA的方法一般使用的AGPC法、酚-氯仿法。此时，优选作为提取溶液，优选为包含2～5M的胍和40～60％的苯酚的溶液。进而，作为能够有效地除去蛋白质等夹杂物的提取溶液，优选相对于提取溶液的总量使用包含以下(a)～(e)的提取溶液。

(a)超过50体积％的苯酚，

(b)相对于溶液的总量为3～10体积％的多元醇，

(c)相对于溶液的总量为0.5～2.0M浓度的胍盐，

(d)相对于溶液的总量为0.1～0.5M浓度的硫氰酸盐，和

(e)用于将溶液的pH维持在4～6的缓冲剂。

另外，为了容易提取核酸，可以在提取溶液中添加各种盐。

作为具体的提取工序，例如，可以应用将样本在提取溶液中均质化，形成匀浆，将用于分离包含RNA的水溶液的有机溶剂加入该匀浆中，然后将其离心分离的方法。在这样的工序中，如上所述，优选将样本与提取溶液混合，然后在离心分离之前添加标准物质。

将所提取的包含小型RNA的溶液进一步供于沉淀、层析、离心分离、电泳和亲和分离等工序进行纯化。例如，在沉淀工序中，可以应用在包含小型RNA的溶液中添加低级醇使小型RNA沉淀，回收沉淀的小型RNA 的工序。作为层析工序，可以应用使在包含小型RNA的溶液添加低级醇沉淀而得的小型RNA吸附于能吸附RNA的担体、例如硅胶膜柱，然后从担体(柱)溶出而回收的工序。

＜测定工序＞

在本发明的方法中，测定通过以上的提取工序从多个样本分别提取的核酸试样所含的目标小型RNA和标准物质的量(测定工序)。

作为测定方法，使用PCR法、测序法等扩增法、RNA杂交(Northern blotting)法、DNA杂交(southern blotting)法、阵列法等杂交法等各种方法。杂交法中，优选通过使用将与对象RNA或标准物质特异性地结合的探针固定化在支持体上而得的微阵列等阵列芯片的阵列法进行测定。具体地，可以优选使用包含排列固定化了目标小型RNA捕捉探针和标准物质捕捉探针的支持体的阵列芯片。

“捕捉探针”或“用于捕捉的探针”是指能与捕捉对象miRNA直接或间接地、优选直接地、且选择地结合的物质，作为代表例，可以列举核酸、蛋白质、糖类和其他抗原性化合物。在本发明中，可以优选使用核酸探针。核酸探针除了DNA、RNA之外，还可以使用PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)等核酸衍生物来制备。其中核酸衍生物是指包含利用荧光基团等的标记化衍生物、修饰核苷酸(例如，包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸、和受到碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的置换等的核苷酸等)的衍生物。

核酸探针的碱基长度从确保杂交的稳定性的观点出发优选为20个碱基以上。通常如果为20～100个碱基左右的链长，则探针能够充分发挥与对象RNA的选择结合性。这样的链长短的寡核酸探针可以通过周知的化学合成法等容易地调制。

核酸探针优选为与对象核酸(目标小型RNA或作为核酸的标准物质) 完全互补的碱基序列，但即使一部分不同，只要是能与对象核酸在严格条件下杂交的程度的同源性高的碱基序列，就能够作为捕捉探针使用。

已知杂交时的严格度是温度、盐浓度、探针的链长、探针的核苷酸序列的GC含量和杂交缓冲液中的离液剂的浓度的函数。作为严格条件，例如，可以使用“Sambrook,J.etal.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)” 所记载的条件等。严格的温度条件为约30℃以上。作为其他条件，为杂交时间、清洗剂(例如，SDS)的浓度、和载体DNA(carrier DNA)的存在与否等，通过将这些条件进行组合，能够设定各种严格度。本领域技术人员能够适宜决定所期望的为了检测样本所含的目标小型RNA或使用的标准物质而准备的核酸探针能够适当发挥作为捕捉探针的功能的条件。

小型RNA的序列信息可以从GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)等数据库获得。另外，miRNA的序列信息可以从例如miRbase网站(http://www.mirbase.org/ftp.shtml)获得。小型RNA捕捉核酸探针可以基于能够从这些站点获得的序列信息来设计。

对固定化于支持体上的小型RNA捕捉探针的数量不特别限定。例如，可以使用将包括鉴定了序列的公知的全部miRNA的数量的小型RNA捕捉探针固定化于支持体上而得的阵列芯片来测定小型RNA的表达量，也可以使用将针对所期望的数量的小型RNA的捕捉探针探针固定化于支持体上而得的阵列芯片，例如，可以使用与特定疾病、生物体状态相关的特定 1个～多个小型RNA捕捉探针。

用于捕捉标准物质的探针只要是能够互补地捕捉所使用的标准物质的探针即可。优选与标准物质的碱基序列的同源性为50％以上且不采取高级结构，例如，可以通过日本特开2011-239708号公报所记载那样地方法来设计。

作为固定化捕捉探针的支持体，可以使用与在公知的微阵列、宏阵列等中使用的支持体同样的支持体，例如可以使用载玻片、膜、珠等。还可以使用日本特许第4244788号等中记载的、表面具有多个凸部的形状的支持体。对支持体的材质不特别限定，可列举玻璃、陶瓷、硅等无机材料；聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶等聚合物等。

作为在支持体上固定化捕捉探针的方法，已知在支持体表面上合成寡 DNA的方法、和将预先合成的寡DNA滴加到支持体表面而固定的方法。

作为前者的方法，可列举Ronald等的方法(美国专利第5705610号说明书)、Michel等的方法(美国专利第6142266号说明书)、Francesco等的方法(美国专利第7037659号说明书)。这些方法中在DNA合成反应时使用有机溶剂，因而优选支持体是对有机溶剂有耐性的材质。另外，在Francesco 等的方法中，从支持体的背面照射光来控制DNA合成，因而优选支持体是具有透光性的材质。

作为后者的方法，可列举广田等(日本特许第3922454号)的方法、使用点样机的方法。作为点样的方式，可列举利用针尖与固相的机械接触的针方式、利用了喷墨打印机的原理的喷墨方式、利用毛细管的毛细管方式等。点样处理后，根据需要进行利用UV照射的交联、表面的封闭等后处理。为了在经表面处理的支持体表面通过共价键固定化寡DNA，在寡DNA 的末端导入氨基、SH基等官能基。支持体的表面修饰通常通过具有氨基等的硅烷偶联剂处理来进行。

捕捉探针可以针对1种小型RNA或标准物质固定在支持体的多个固定化区域而进行检测。例如，可以将捕捉1种小型RNA或标准物质的同一捕捉探针固定在支持体上的多个位置，另外在能够针对1种小型RNA 或标准物质设计多种捕捉探针时，可以将以相同小型RNA或标准物质为目标的多个捕捉探针固定在支持体上。

与固定化在支持体上的各探针的杂交可以如下进行：使从添加了至少 1种标准物质的样本提取的核酸试样与标记物质结合，制备被标记物质标记的核酸试样，使该被标记的核酸试样与探针将接触。在本发明中，“核酸试样”这样的术语除了包含从样本提取的RNA之外，还包含由该RNA 通过逆转录反应制备的cDNA和cRNA。因此，被标记的核酸试样可以是将核酸试样中的目标小型RNA和标准物质直接或间接地用标记物质标记而得的，另外，也可以是将由核酸试样中的RNA制备的cDNA或cRNA(在标准物质是RNA的情况下，包含由目标小型RNA和标准物质通过逆转录反应而得的cDNA或cRNA)直接或间接地用标记物质标记而得的。

作为使核酸试样与标记物质结合的方法，可列举使核酸试样的3’末端结合标记物质的方法、使5’末端结合标记物质的方法、使结合了标记物质的核苷酸掺入核酸的方法。在使3’末端结合标记物质的方法、使5’末端结合标记物质的方法中，可以使用酶反应。酶反应中可以使用T4RNA连接酶、末端脱氧核苷酸转移酶、多聚腺苷酸聚合酶等。任一标记方法均可参考“Shao-Yao Ying编、miRNA実験プロトコー(miRNA实验规程)、羊土社、2008年”中记载的方法。另外，用于使RNA的末端直接或间接地结合标记物质的试剂盒有各种市售。例如，作为使3’末端直接或间接地结合标记物质的试剂盒，可以例示miRCURY miRNAHyPower labeling kit(エキシコン社)、NCode miRNA Labeling system(ライフテクノロジーズ社)、 FlashTag Biotin RNA Labeling Kit(ジェニスフィア社)等。ライフテクノロジーズ社的NCode miRNA Labeling system是对miRNA添加多聚A尾，然后使用交联形成寡聚dT在3’末端连接捕获序列，使其与阵列杂交后，添加具有与捕获序列杂交的序列的标记物质，介由捕获序列标记miRNA 的系统，是使miRNA间接地结合标记物质的方法。如果作为标准物质使用3’末端被磷酸化的RNA，则可以使用这些方法进行标记。

此外，与现有方法同样地，也可以采用如下方法：通过在标记的脱氧核糖核酸或标记的核糖核酸存在下由从样本提取的RNA合成cDNA或 cRNA，制备掺入了标记物质的cDNA或cRNA，使其与阵列上的探针杂交。在作为标准物质使用RNA时，可以采用该方法。

在本发明中使用多个样本，但可以任一样本都使用同一标记物质，也可以使用多个不同的标记物质。

作为能够在本发明中使用的标记物质，可列举在公知的微阵列分析中也使用的各种标记物质。具体可列举荧光色素、磷光色素、酶、放射性同位素等，但不限于这些。优选测定简便、信号容易检测的荧光色素。具体可列举菁(菁2)、氨甲基香豆素、荧光素、吲哚碳菁(菁3)、菁3.5、四甲基若丹明、若丹明红、德克萨斯红、吲哚碳菁(菁5)、菁5.5、菁7、牡蛎(oyster) 等公知的荧光色素，但不限于这些。

另外，作为标记物质，也可以使用具有发光性的半导体微粒。作为这样的半导体微粒，可列举例如硒化镉(CdSe)、碲化镉(CdTe)、磷化铟镓 (InGaP)、银铟硫化锌(AgInZnS)等。

使如上所述标记的、包含来自样本的核酸(目标小型RNA)和标准物质的核酸试样与支持体上的探针接触而进行杂交。该杂交工序可以与以往完全同样地进行。反应温度和时间可根据杂交的核酸的链长适宜选择，在核酸的杂交的情况下，通常在30℃～70℃左右1分钟～十几小时。进行杂交，清洗后，检测支持体上的各个探针固定化区域中的来自标记物质的信号强度。信号强度的检测根据标记物质的种类使用适当的信号读取装置来进行。在使用荧光色素作为标记物质的情况下，可以使用荧光显微镜、荧光扫描仪等。

将检测到的测定值(信号值)与周围噪声进行比较。具体地，将从探针固定化区域获得的测定值与从除了探针固定化区域以外的位置获得的测定值进行比较，将前者的数值较高的情况作为检测到(有效判定阳性)。

在检测到的测定值包含背景噪声的情况下，也可以减去背景噪声。也可以将周围噪声作为背景噪声，从检测到的信号值中减去。此外，还可以使用“マイクロアレイデータ统计解析プロトコール(微阵列数据统计分析规程)(羊土社)”所记载的方法。

通过上述方法，将各核酸试样中存在的目标小型RNA和标准物质的量、即各样本中的目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量的测定值作为信号强度获得。

＜代表值获得工序＞

在本发明的方法中，接下来，对于各样本，由提取的核酸试样中的标准物质存在量的测定值获得代表值(代表值获得工序)。此外，核酸试样中的标准物质存在量这样的术语与来自样本的标准物质提取量这样的术语含义相同，在本说明书，以相同的含义使用“标准物质存在量”和“标准物质提取量”这样的术语。核酸试样中的标准物质存在量、和来自样本的标准物质提取量有时仅称为“标准物质量”。即，在本说明书中，提到“样本的标准物质量”时，不是指在样本中添加的标准物质量，而是指核酸试样中的标准物质存在量或来自样本的标准物质提取量。

在标准物质为1种的情况下，该1种的存在量的测定值成为代表值，在标准物质为2种以上的情况下，通过以下各种方法获得代表值。

作为代表值的典型例，可列举平均值和中央值。平均值是指由多个标准物质的提取量的测定值(例如，使用微阵列得到的信号强度的测定值)计算出的平均值。中央值是指使用多个标准物质的提取量的测定值(例如，使用微阵列得到的信号强度的测定值)得到的中央值。

这些平均值或中央值可以是用对数值表示的平均值或中央值。“用对数值表示的平均值”是指用将多个标准物质的提取量的测定值(例如，使用微阵列得到的信号强度的测定值)转换为以2为底的对数而得的对数值求得的平均值。“用对数值表示的中央值”是指将多个标准物质的提取量的测定值(例如，使用微阵列得到的信号强度的测定值)转换为以2为底的对数而得的对数值的中央值、或将多个标准物质的提取量的测定值的中央值转换为以2为底的对数而得的对数值。在中央值的情况下，将测定值的对数转换先进行或后进行都得到相同的值。

平均值和中央值可以是使用作为测定对象的多个标准物质的全部测定值求得的，也可以是使用从该多个标准物质中选出的一部分测定值求得的。例如，可以使用通过搭载于微阵列的标准物质捕捉探针获得的全部测定值来求，也可以对于标准物质捕捉探针中的一部分(例如，当搭载于微阵列的标准物质捕捉探针为10种时，取其中5种)来求。例如，可以仅选出在应比较分析的全部样本中都为有效判定阳性的标准物质捕捉探针，获得标准物质的代表值。另外，在求出代表值之前，可以从标准物质的存在量的测定值除去偏离值(外れ値)。

另外，通过对1种标准物质使用多种捕捉探针，或使用将1种捕捉探针点样在多个位置而得的阵列进行检测，有时对1种标准物质得到多个测定值。此时，也与使用2种以上的标准物质的情况同样地，可以使用由多个测定值计算出的平均值或中央值、例如用对数值表示的平均值或中央值作为代表值。另外，可以使用全部这些测定值来求代表值，也可以使用一部分测定值来求代表值。

另外，在使用多个标准物质的方式中，在将针对1种标准物质的1种捕捉探针分别点样在阵列上的多个位置的情况下，首先对每个标准物质求出来自多个捕捉探针点的信号测定值的平均值，将各平均值进行对数转换，使用各对数值在多个标准物质之间求平均值或中央值。这样求得的平均值或中央值也包含在“用对数值表示的平均值或中央值”中。

多个样本中的代表值的CV值(变异系数)优选为0.5以下。通常，使用微阵列时的测定值的CV值为0.5以下。如果CV值为0.5以上则偏差大，提取工序中的标准物质的提取效率不稳定，作为结果可预测修正后的数据的精度降低。

＜修正系数获得工序＞

接下来，使用代表值获得工序中得到的各样本的标准物质提取量的代表值和对于标准物质提取量任意设定的基准值，获得在目标小型RNA的表达量的修正中使用的修正系数(修正系数获得工序)。在该修正系数获得工序中，可以利用代表值与基准值的差求修正系数，也可以利用代表值与基准值的比求修正系数。不特别限定，但优选使用未进行对数转换的代表值时利用比求修正系数，使用用对数表示的代表值时利用差求修正系数。以下，对于这2种工序进行说明。

＜修正系数获得工序-1＞

修正系数获得工序-1是利用标准物质提取量的代表值与基准值的差的方法。本工序中，可以应用下述1-1.基准样本获得法、或1-2.固定数值修正法。

1-1.基准样本获得法

从作为分析对象的多个样本中任意选择1个样本(第1样本)，将其作为“基准样本”。其余的1或1个以上样本(第2以后的样本)成为“被修正的样本”。

此外，在本说明书中，“第2以后的样本”这样的术语也包含第2样本。例如，如果应比较的多个样本是2个，则被修正的样本仅为第2样本，如果应比较的多个样本是3个，则被修正的样本是第2样本和第3样本2 个。

在该方法中，以基准样本的标准物质量的代表值作为“基准值”。使用该基准值与第2以后的各样本(被修正的样本)的标准物质量的代表值之差作为用于该第2以后的各样本的修正系数。获得与被修正的样本的数量相同的修正系数。

具体地，修正系数通过式1或式1’来求。

c_1-1＝(基准样本的标准物质量的代表值(基准值))

-(被修正的样本的标准物质量的代表值)···式1

c_1-1’＝(被修正的样本的标准物质量的代表值)

-(基准样本的标准物质量的代表值(基准值))···式1’

例如，在使用微阵列进行表达量的测定，作为标准物质的代表值使用用对数值表示的平均值的情况下，用于被修正的样本的修正系数可以通过式2或式2’来求。

其中，式2、式2’中，

n为支持体上的标准物质捕捉探针固定化区域的总数，

Aj是基准样本的来自第j(1≤j≤n)标准物质捕捉探针固定化区域的信号测定值，

Xj是第2样本的来自第j(1≤j≤n)标准物质捕捉探针固定化区域的信号测定值。

在探针与标准物质一一对应的情况下，n等于作为支持体上的标准物质捕捉探针的靶标的标准物质的数量。

在式2和式2’中，可以使用在应比较的全部样本中都为有效判定阳性的标准物质捕捉探针固定化区域的总数n’来代替n。

1-2.固定数值修正法

是预先假定标准物质量的代表值在全部样本中取一定的数值的方法。即，以固定的数值作为“基准值”，获得该固定数值与各样本的标准物质量的代表值的差，利用该差作为修正系数。因为在该方法中不存在1-1.所示的“基准样本”，所以成为比较分析对象的多个样本全部成为“被修正的样本”，获得与成为比较分析对象的样本数量相同的修正系数。

具体地，修正系数通过式3或式3’来求。

r_1-2＝(固定数值(基准值))-(被修正的样本的标准物质量的代表值)

···式3

r_1-2’＝(被修正的样本的标准物质量的代表值)-(固定数值(基准值))

···式3’

例如，在使用微阵列进行表达量的测定，作为标准物质量的代表值使用用对数值表示的平均值的情况下，用于被修正的样本的修正系数可以通过式4或式4’来求。

其中，式4、式4’中，

α是基准值(固定数值)，

n是支持体上的标准物质捕捉探针固定化区域的总数，

Yj是样本的来自第j(1≤j≤n)标准物质捕捉探针固定化区域的信号测定值。

在固定数值修正法中作为基准值使用的固定数值只要在至少1次比较分析中对全部样本统一使用同一数值，就可以使用任何数值(但除了0以外)。只要使用同一表达测定系统，且经常使用同一数值作为固定数值，则在不同天进行表达量的测定的样本之间也能够进行比较分析。例如，因为添加在样本中的各标准物质的量在全部样本中相同，所以可以基于标准物质添加量确定固定数值。本来，通过在测定工序中使用的系统检测的信号值的大小可以变化，因此根据使用的系统，固定数值可以自由选择。

＜修正系数获得工序-2＞

修正系数获得工序-2是利用标准物质量的代表值与基准值之比的方法。本工序中，可以应用下述2-1.基准样本获得法、或2-2.固定数值修正法。

2-1.基准样本获得法

从作为分析对象的多个样本中任意选择1个样本(第1样本)，将其作为“基准样本”。其余的第2以后的样本成为“被修正的样本”。

在该方法中，以基准样本的标准物质量的代表值作为“基准值”，使用该基准值与第2以后的各样本(被修正的样本)的标准物质量的各代表值之比作为用于该第2以后的各样本的修正系数。获得与被修正的样本的数量相同的修正系数。

具体地，修正系数通过式5或式5’来求。

c_2-1＝(基准样本的标准物质量的代表值(基准值))

/(被修正的样本的标准物质量的代表值)···式5

c_2-1’＝(被修正的样本的标准物质量的代表值)

/(基准样本的标准物质量的代表值(基准值))···式5’

例如，在使用微阵列进行表达量的测定，使用用对数值表示的平均值作为标准物质量的代表值的情况下，用于第2样本的修正系数可以通过式 6或式6’来求。

其中，式6、式6’中，

n是支持体上的标准物质捕捉探针固定化区域的总数，

在式6和式6’中，可以使用在应比较的全部样本中都为有效判定阳性的标准物质捕捉探针固定化区域的总数n’来代替n。

2-2.固定数值修正法

是预先假定标准物质量的代表值在全部样本中取一定的数值的方法。即，以固定的数值作为“基准值”，获得该固定数值与各样本的标准物质量的代表值的差，利用该差作为修正系数。因为在该方法中不存在2-1.所示的“基准样本”，所以成为比较分析对象的多个样本全部成为“被修正的样本”，获得与成为比较分析对象的样本数量相同的修正系数。

具体地，修正系数通过式7或式7’来求。

r_2-2＝(固定数值(基准值))/(被修正的样本的标准物质量的代表值)

···式7

r_2-2’＝(被修正的样本的标准物质量的代表值)/(固定数值(基准值))

···式7’

例如，在使用微阵列进行表达量的测定，使用用对数值表示的平均值作为标准物质量的代表值的情况下，用于被修正的样本的修正系数可以通过式8或式8’来求。

其中，式8、式8’中，

α是固定数值，

n是支持体上的标准物质捕捉探针固定化区域的总数，

在式8和式8’中，可以使用在应比较的全部样本中都为有效判定阳性的标准物质捕捉探针固定化区域的总数n’来代替n。

其中，关于作为基准值的“固定数值”，详细与“1-2.固定数值修正法” 中的固定数值是同样的。

＜修正工序＞

接下来，使用通过修正系数获得工序-1或修正系数获得工序-2获得的修正系数，利用修正工序-1或修正工序-2的方法，进行被修正的样本中的目标小型RNA的表达量的修正。

＜修正工序-1＞

修正工序-1是使用通过修正系数获得工序-1获得的修正系数来进行目标小型RNA的表达量的修正的方法，通过目标小型RNA的表达量加上修正系数或该表达量减去修正系数来进行修正。本工序有与修正系数获得工序-1的基准样本获得法和固定数值修正法分别对应的2种修正方法。

1-1.基准样本获得法

第2以后的样本中的目标小型RNA的表达量的修正分别使用用于第2 以后的样本的修正系数来进行。即，在对于第2样本修正目标小型RNA 的表达量时，使用用于第2样本的修正系数(c2_1-1或c2_1-1’)，在对于第3 样本修正目标小型RNA表达量时，使用用于第3样本的修正系数(c3_1-1或c3_1-1’)。

在作为修正系数，使用基准样本的标准物质量的代表值减去第2以后的样本的标准物质量的代表值而得的差的情况下，即上述式1的情况下，通过对第2以后的样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值加上修正系数，来对于第2以后的各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量Ei可以通过下述式9来求。

Ei＝log₂Wi+c_1-1···式9

其中，Wi是来自用于捕捉第i miRNA的探针固定化区域的信号测定值。

与此相反，在作为修正系数，使用第2以后的样本的标准物质量的代表值减去基准样本的标准物质量的代表值而得的差的情况下，即上述式1’ 的情况下，通过从第2以后的样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值减去修正系数，来对于第2以后的各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量Ei可以通过下述式9’来求。

Ei＝log₂Wi-c_1-1'···式9’

其中，Wi的定义与上述式9相同。

如果修正在第2样本中测定的目标小型RNA表达量，则对该第2样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值加上c2，或减去c2’即可。对于第3以后的样本也是同样的。此外，作为基准样本的第1样本的代表值与基准值之差当然为0，但在程序的构成上也可以进行第1样本的目标小型RNA表达量加上或减去0这样的计算。

1-2.固定数值修正法

目标小型RNA表达量的修正分别使用通过代表值与固定数值(基准值) 的差而获得的修正系数来进行。即，对于某一样本修正目标小型RNA表达量时，使用用于该样本的修正系数(r_1-2或r_1-2’)。

在作为修正系数，使用固定数值减去样本的标准物质量的代表值而得的差的情况下，即上述式3的情况下，通过对样本中的各目标小型RNA 的表达量的测定值或该测定值的对数值加上修正系数，来对于各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量Ei可以通过下述式10来求。

Ei＝log₂Wi+r_1-2···式10

其中，Wi是来自第i小型RNA捕捉探针固定化区域的信号测定值。

与此相反，在作为修正系数，使用样本的标准物质量的代表值减去固定数值而得的差的情况下，即上述式3’的情况下，通过样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值减去修正系数，来对于各样本进行目标小型RNA表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量 Ei可以通过下述式10’来求。

Ei＝log₂Wi-r_1-2'···式10’

Wi的定义与上述式10相同。

＜修正工序-2＞

修正工序-2是使用通过修正系数获得工序-2获得的修正系数来进行目标miRNA的表达量的修正的方法，通过目标miRNA的表达量除以修正系数、或该表达量乘以修正系数来进行修正。本工序中也有与修正系数获得工序-2的基准样本获得法和固定数值修正法分别对应的2种修正方法。

2-1.基准样本获得法

第2以后的样本中的目标小型RNA的表达量的修正分别使用用于第2 以后的样本的修正系数来进行。即，对于第2样本修正目标小型RNA的表达量时，使用用于第2样本的修正系数(c2_2-1或c2_2-1’)，对于第3样本修正目标小型RNA表达量时，使用用于第3样本的修正系数(c3_2-1或 c3_2-1’)。

在作为修正系数，使用以被修正的第2以后的样本的标准物质量的代表值为分母、以基准样本的标准物质量的代表值为分子而得的比的情况下，即上述式5的情况下，通过对第2以后的样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值乘以修正系数，来对于第2以后的各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量 Ei可以通过下述式11来求。

Ei＝log₂Wi×c_2-1···式11

与此相反，在作为修正系数，使用以基准样本的标准物质量的代表值为分母、以第2以后的样本的标准物质量的代表值为分子而得的比的情况下，即上述式5’的情况下，通过第2以后的样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值除以修正系数，来对于第2以后的各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量Ei可以通过下述式11’来求。

Ei＝log₂Wi÷c_2-1'···式11’

其中，Wi的定义与上述式11相同。

如果修正在第2样本中测定的目标小型RNA表达量，则该第2样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值除以c2_2-1、或乘以c2_2-1'即可。对于第3以后的样本也是同样的。无论按照式5和式11 的步骤，还是按照式5’和式11’的步骤，最终获得的修正后目标小型RNA 的表达量Ei的值都相同。此外，作为基准样本的第1样本的代表值与基准值之比当然为1，但在程序的构成上也可以进行第1样本的目标小型RNA 表达量乘以1或该目标小型RNA表达量除以1这样的计算。

2-2.固定数值修正法

目标小型RNA表达量的修正分别使用通过与固定数值(基准值)的比获得的修正系数来进行。即，对于某一样本修正目标小型RNA表达量时，使用用于该样本的修正系数(r_2-2或r_2-2’)。

在作为修正系数，使用以样本的标准物质量的代表值为分母、以固定数值为分子而得的比的情况下，即上述式7的情况下，通过对样本中的各目标小型RNA的表达量的测定值或该测定值的对数值乘以修正系数，来对于各样本进行目标小型RNA的表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA的修正后表达量Ei可以通过下述式12来求。

Ei＝log₂Wi×r_2-2···式12

与此相反，在作为修正系数，使用以样本的标准物质量的代表值为分母、以固定数值为分子而得的比的情况下，即上述式7’的情况下，通过样本中的各目标小型RNA表达量的测定值或该测定值的对数值除以修正系数，从而对于各样本进行目标小型RNA表达量的修正。如果将这种情况下的修正用方程式表示，则某一“被修正的样本”中的第i目标小型RNA 的修正后表达量Ei可以通过下述式12’来求。

Ei＝log₂Wi÷r_2-2'···式12’

其中，Wi的定义与上述式12相同。

＜比较分析工序＞

使用修正后的目标小型RNA表达量，在多个样本之间对比目标小型 RNA表达量。在通过基准样本获得法进行修正的情况下，由于作为基准样本的第1样本的目标小型RNA表达量不受到修正，因此例如第1样本与第2样本之间的对比成为未修正的第1样本的目标小型RNA表达量与修正后的第2样本的目标小型RNA表达量之间的对比，但所对比的样本中至少1个必然是经修正的样本。因此，提到“根据修正后的目标小型RNA 表达量，在多个体液样本之间对比目标小型RNA表达量”的情况下，也包含在未修正的基准样本与经修正的其他样本之间进行对比的方式。

比较分析工序本身可以与现有方法同样地进行。例如，可以制成被称为散点图(Scatter plot)的表达量数据的散布图。在应比较的样本是3个的情况下，例如，可以制成2幅将3个中的任1样本与其余的各样本进行比较分析而得的的散布图(例如，第1样本-第2样本之间的散布图和第1样本-第3样本之间的散布图)，根据需要，也可以进一步制成在其余的2个样本之间(在前述的例子的情况下，进一步在第2样本-第3样本之间)进行比较分析而得的散布图。4个以上的样本的比较分析也可以同样地进行。此外，如果是3个样本的比较分析，则也可以3维地制成散布图。即使在基准样本获得法的情况下，也不是必须将基准样本与其他2个样本分别进行比较，也可以进行例如第2样本-基准样本之间的比较和第2样本-第3 样本之间的比较。

另外，可以根据修正后的目标小型RNA表达量，在任1样本与其余的其他样本之间计算目标小型RNA的表达量的差，作为将该差进行对数化而得的变化倍率(fold-change)显示比较分析结果。例如，可以计算基准样本中的目标小型RNA的表达量(基准样本获得法的情况)或第1样本中的修正后的目标小型RNA的表达量(固定数值修正法的情况)、与第2以后的样本中的修正后的目标小型RNA的表达量之差。这种情况下也与上述情况同样地，不限于计算第1样本与其他样本之差，也可以计算第2以后的样本的任一个与其他样本之差。此外，另外，使用修正后的目标小型RNA 表达量，也可以通过平均值、标准偏差、标准误差、变异系数的计算、群之间比较、显著性差异检验、聚类分析等使用了多个样本中的目标小型 RNA的表达量的统计分析来进行对比、评价。

本发明的装置是为了对目标小型RNA的表达量进行比较分析而对该表达量进行修正的装置。该装置包含：

记忆单元，记忆对于各样本使用核酸试样测定的目标小型RNA表达量和标准物质提取量的测定值，所述核酸试样是对多个样本的各样本添加至少1种标准物质，然后从各样本提取核酸而获得的，所述标准物质是核酸长度为200个碱基以上的核酸；

代表值获得单元，对于各样本，从标准物质提取量的测定值获得代表值、优选为用对数值表示的代表值；

在某一方式中，基准值是任意选择的第1样本(基准样本)的标准物质量的代表值，在第2以后的样本中测定的目标小型RNA的表达量被修正。即，在该方式中，本发明的装置包含：

修正系数获得单元，以任意选择的第1样本作为基准样本，以基准样本的标准物质提取量的代表值作为基准值，分别获得该基准值与其余的第 2以后的样本的代表值的差或比作为用于该第2以后的样本的修正系数；

修正单元，分别使用通过所述修正系数获得单元获得的用于第2以后的样本的修正系数，来进行在第2以后的样本中测定的目标小型RNA的表达量的修正。

在其他方式中，基准值是对于标准物质提取量任意设定的固定数值，对于包含第1样本的全部样本进行目标小型RNA表达量的修正。即，在该方式中，本发明的装置包含：

修正系数获得单元，以固定数值为基准值，分别获得该基准值与各样本的代表值的差或比作为用于该样本的修正系数；

修正单元，分别使用通过所述修正系数获得单元获得的用于各样本的修正系数，来进行在各样本中测定的目标小型RNA的表达量的修正。

具备上述修正装置的小型RNA表达量的比较分析装置可以进一步包含输出单元，根据修正后的目标小型RNA表达量，输出在至少2个样本之间对比目标小型RNA表达量而得的结果。

将显示具备该修正装置的分析装置的构成的概略的方框图示于图2。分析装置10具备输入部110、显示部120、输出部130、记忆部140、控制部150、转换部160、分析部170。另外，图3显示本发明的目标小型RNA 的表达量的修正处理的流程图的一例。

输入部110是输入与分析装置10的运作相关的信息的单元。可以优选使用键盘等现有公知的输入单元。在使用微阵列的情况下，通过杂交测定获得的小型RNA表达量、标准物质提取量的数据可以通过例如与本发明的装置分别设置的扫描仪等读取单元读取，转换成数值数据之后，从输入部110将该数值数据输入分析装置10。或者，扫描仪等读取单元也可以包含在本发明的分析装置10中(未图示)。

从输入部110输入的表达量、提取量的数据，或通过组装在分析装置 10中的读取单元读取并数值化的表达量、提取量的数据，被记忆部140记忆。此时，记忆部140作为记忆对于多个样本分别同时测定的多个目标小型RNA的表达量和至少1种标准物质的提取量的测定值的记忆单元发挥功能。

存储在记忆部140的各样本的小型RNA表达量和标准物质提取量的测定值数据根据情况通过转换部160被转换成以2等为底的对数。接着，通过分析部170对于各样本获得标准物质提取量的测定值的代表值。代表值如关于修正方法的说明中所述的那样，例如可以是至少1种标准物质量测定值的平均值或中央值(在修正中仅使用1种标准物质的情况下，如果在阵列上存在多个用于测定该标准物质的探针固定化区域，则代表值可以为平均值或中央值)、或特定的1种标准物质量的测定值。

获得代表值之后，通过分析部170对于各样本计算出基准值与各样本的标准物质量的代表值的差或比，分别获得修正系数。获得修正系数的详细描述如修正方法的＜修正系数获得工序＞中所述。此外，在采用基准样本获得法的情况下，程序的构成上，也可以是对于作为基准样本的第1样本也获得修正系数0(计算差的情况)或修正系数1(计算比的情况)的构成。

在装置10中输入基准值或选择基准样本时，可以通过由装置10的操作者从输入部110指定任意的1个样本来进行。或者，装置10可以自动地选择基准值，也可以选择成为基准样本的1个样本。例如，可以从输入部 110输入数据，通过装置10选择记忆部140最初记忆了数据的样本作为基准样本。该基准样本的选择或输入的步骤在图3中方便地位于代表值获得工序(S-3)之后，但不限于此，也可以在更早的步骤、例如数据存储时执行。此外，也可以将预先指定的固定数值作为基准值登记在转换部160等。

接下来，分析部170分别使用用于各样本的修正系数，来修正所测定的目标小型RNA表达量数据。修正操作的详细如修正方法的＜修正工序＞所述。此外，在采用基准样本获得法的情况下，程序的构成上，也可以对于作为基准样本的第1样本的目标小型RNA表达量数据也执行使用修正系数0(计算差的情况)或修正系数1(计算比的情况)的修正操作。

接下来，通过分析部170进行各样本的目标小型RNA表达量的对比、统计学分析。对比、统计学分析的结果通过输出部130而被输出到显示部 120显示。进而，可以将对比结果、统计分析结果输出到打印机等输出装置、记录介质等。此外，输出部130也可以介由网络向存在于装置外部的数据库等外部记忆装置输出对比分析结果、统计分析结果那样地构成。

记忆部140除了记忆多个小型RNA的表达量和多个标准物质的提取量的测定值之外，还适当记忆上述各工序产生的中间分析结果。

装置10的上述各种运作通过控制部150来控制。具体地，如图2的虚线箭头所示，对输入部110、显示部120、输出部130、记忆部140、控制部150、转换部160、分析部170的各单元，从控制部150输出控制信息，基于该控制信息各单元联合运作，从而装置10全体运作。

另外，本发明提供用于使计算机作为上述修正装置或分析装置发挥功能的程序。该程序具体地是使计算机作为上述的各单元(即，记忆单元、代表值获得单元、修正系数获得单元、修正单元、和分析装置中进一步包含的输出单元)发挥功能的程序。另外，本发明提供用于使计算机执行上述本发明的修正方法或包含该修正方法的比较分析方法的各工序的程序。修正方法中包含上述的测定工序、代表值获得工序、修正系数获得工序和修正工序，在比较分析方法中，可以进一步包含根据修正后的目标miRNA表达量在多个体液样本之间对比目标miRNA表达量的比较分析工序。这些程序是使用通过微阵列等与目标小型RNA的表达量同时测定的标准物质提取量的测定值的数据，使计算机执行目标小型RNA的表达量的修正的程序。

此外，本发明提供记录了上述任一程序的计算机可读取的记录介质。

“记录介质”可以是软盘、磁光盘、ROM、EPROM、EEPROM、 CD-ROM、MO、DVD等任意的“便携的物理介质”(非瞬时性的记录介质)。或者，也可以是像在介由以LAN、WAN、互联网为代表的网络传送程序时的通信回路、载波那样，短期保持程序的“通信介质”。

“程序”是用任意的语言、表述方法表述的数据处理方法，源代码、二进制代码等形式均可。此外，“程序”未必限于单一地构成的程序，也包含作为多个模块、库分散构成的程序、以OS(操作系统、Operating System) 为代表的与一个个程序协作实现其功能的程序。此外，关于实施方式中所示的各装置中用于读取记录介质的具体构成、读取步骤、或者读取后的安装步骤等，可以使用公知的构成、步骤。

能够在本发明中优选使用的、包含固定化了多个目标小型RNA捕捉探针和至少1种优选为多种标准物质捕捉探针的支持体的阵列芯片，可以作为小型RNA表达分析用芯片提供。关于该芯片的优选条件如本发明的测定工序中所说明的那样。

实施例

以下，基于使用人血清样本应用本发明的修正方法的实施例，具体地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。

(标准物质)

作为核酸长度为200个碱基以上的核酸的实施例用的标准物质，使用能够从独立行政法人产业技术综合研究所作为定量分析用核糖核酸(RNA) 水溶液购入的由5种RNA水溶液：试样名RNA500-A(序列号1)、 RNA500-B(序列号2)、RNA500-C(序列号3)(以上均为核酸长度约500个碱基的RNA)、RNA1000-A(序列号4)和RNA1000-B(序列号5)(以上均为核酸长度约1000个碱基的RNA)构成的认证标准物质NMIJ CRM 6204-a，以及由本申请发明者设计委托ユーロフィンジェノミクス社合成的3种 RNA即hsncs_071028(序列号15)、hsncs_404161(序列号16)、 hsncs_647981(序列号17)(以上均为核酸长度约200个碱基的RNA)的RNA。

作为核酸长度小于200个碱基的核酸的比较例用的标准物质，选择非专利文献1所示的作为核酸长度为20个碱基的非人来源的miRNA的 cel-miR-39(序列号6)、cel-miR-54(序列号7)、ath-mir-159a(序列号8)、 cel-miR-238(序列号9)。关于各miRNA，由ユーロフィンジェノミクス社作为在5’末端添加了磷酸基修饰的RNA进行合成。另外，使用由ユーロフィンジェノミクス社销售的非生物来源的核酸长度为60个碱基的5种 RNA即H2NC000001(序列号10)、H2NC000002(序列号11)、H2NC000003 (序列号12)、H2NC000005(序列号13)、H2NC000006(序列号14)。

将各标准物质的物理性质等示于表1。对于所使用的全部标准物质，相对于公共数据库BLAST中收录的全部人基因转录产物确认了序列同源性为50％以下。

表1

标准物质	序列号	碱基长度	GC含量(％)	Tm值(℃)
					RNA500-A	1	533	47	89.15
RNA500-B	2	533	49	89.83
					RNA500-C	3	533	45	88.96
RNA1000-A	4	1033	50	91.21
					RNA1000-B	5	1033	49	91.12
cel-miR-39	6	22	50	65.99
					cel-miR-54	7	24	42	62.93
ath-mir-159a	8	21	43	62.61
					cel-miR-238	9	23	43	64.19
H2NC000001	10	69	52	83.56
					H2NC000002	11	69	43	79.96
H2NC000003	12	69	55	85.51
					H2NC000005	13	69	46	81.42
H2NC000006	14	69	54	84.86
					hsncs_071028	15	201	51	89.95
hsncs_404161	16	200	51	89.54
					hsncs_647981	17	204	47	87.21

(捕捉探针的设计)

作为目标小型RNA，选择从miRBase Release 19获得的2555种人 miRNA，使用具有其互补序列的DNA作为目标小型RNA捕捉探针 (http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml)。

作为实施例用的标准核酸物质捕捉探针，使用具有上述RNA500-A、 RNA500-B、RNA500-C、RNA1000-A、RNA1000-B、hsncs_071028、 hsncs_404161、hsncs_647981的序列的互补序列的DNA。

另外，作为比较例用的标准物质捕捉探针，使用具有从miRBase获得的cel-miR-39(22个碱基)、cel-miR-54(24个碱基)、ath-mir-159a(21个碱基)、cel-miR-238(23个碱基)的互补序列的DNA。另外，使用具有市售的上述5种RNA(H2NC000001、H2NC000002、H2NC000003、H2NC000005、 H2NC000006)的互补序列的DNA。

上述的目标小型RNA捕捉探针和标准核酸物质的捕捉探针使用在3’ 末端导入了氨基的合成DNA(委托ユーロフィンジェノミクス社合成)。

(DNA微阵列的制作)

将在3’末端导入了氨基的上述2555种目标小型RNA(miRNA)捕捉探针和全部17种标准物质捕捉探针固定化在东丽株式会社制的“3D-Gene” (注册商标)基板(3000柱基板)的凸部，制作DNA微阵列。此外，标准物质捕捉探针各在8点进行固定。使用该DNA微阵列进行以下实验。

(对血清样本添加标准物质以及核酸提取工序)

对血清样本300μL混合作为RNA提取试剂的3D-Gene RNA extraction reagentfrom liquid sample(东丽株式会社)900μL，在实施例中，添加上述的作为实施例用的标准物质的RNA500-A、RNA500-B、 RNA500-C、RNA1000-A、RNA1000-B、hsncs_071028、hsncs_404161和 hsncs_647981中的至少1种各10fmol，在比较例中，添加上述的作为比较例用标准物质的cel-miR-39、cel-miR-54、ath-mir-159a、cel-miR-238、 H2NC000001、H2NC000002、H2NC000003、H2NC000005和H2NC000006 中的至少1种各10fmol，通过离心分离操作回收上层的水层，使用 miRNeasy mini kit(キアゲン社)纯化RNA。

(利用DNA微阵列测定目标小型RNA(miRNA)的表达量和标准物质的提取量的测定工序)

将所得的目标小型RNA(miRNA)使用"3D-Gene"miRNA labeling kit(东丽株式会社)进行标记。标记后的miRNA按照3D-Gene miRNA chip(东丽株式会社)的标准规程进行杂交和清洗。反应后的DNA微阵列使用微阵列扫描仪(东丽株式会社)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光输出 100％、光电倍增管的电压设定为42％。

＜实施例1＞

按照上述步骤，在市售的血清样本300μL中添加序列号1～5所示的实施例用标准物质(全部5种)或序列号15～17所示的实施例用标准物质(全部3种)，进行核酸的提取工序、和利用DNA微阵列测定目标小型 RNA(miRNA)的表达量和标准物质的存在量的测定工序。以上工序为了比较对其测定实验之间的表达量的测定值的变化(偏差)进行修正的效果而重复10次。

其结果检测到2555种miRNA中的约1000种miRNA。该检测到的约 1000种各miRNA的表达量的10次测定实验之间CV值(变异系数)的、在检测到的全部约1000种miRNA中的中央值在修正前为0.45。

各miRNA的表达量的修正如下进行。首先，作为DNA微阵列上的8 点的测定值的平均值求得各次实验中的各标准物质的存在量，以此作为代表值计算出。接着，以第1次实验中的标准物质的代表值作为基准值，获得与第2～10次实验的代表值的比作为修正系数。使用该修正系数进行第 2～10次实验中的miRNA的表达量的测定值的修正。其结果在修正后，各miRNA的表达量的10次测定实验之间的CV值的、在检测到的全部约 1000种miRNA中的中央值分别为0.32(序列号1)、0.40(序列号2)、0.40(序列号3)、0.38(序列号4)、0.30(序列号5)、0.41(序列号15)、0.36(序列号16)、 0.39(序列号17)。

＜比较例1＞

作为标准物质，使用序列号6～14所示的9种比较例用的标准物质代替序列号1～5所示的实施例用标准物质，与实施例1同样地进行实验。

修正前的检测到的约1000种各miRNA的表达量的CV值的中央值为 0.45。

修正后的各miRNA的表达量的CV值的中央值分别为1.07(序列号6)、 1.14(序列号7)、0.98(序列号8)、0.99(序列号9)、0.94(序列号10)、0.95(序列号11)、0.84(序列号12)、0.82(序列号13)、0.88(序列号14)。

如上，在实施例1中修正后的目标小型RNA的检测值的CV值的中央值小于修正前的0.45，与此相对，在比较例1中大于修正前的0.45。即，在使用同一样本将从核酸的提取到DNA微阵列实验在同一条件下多次进行的实验中的其实验之间的表达量的变化(偏差)的修正中，显示与比较例1 相比，通过使用实施例1中使用的标准物质进行修正，修正的正确性提高。

＜实施例2＞

使用从3个人采取的3种血清A～C，作为标准物质使用序列号1～5 所示的实施例用标准物质，对各血清在核酸的提取日和实验者不同的条件下按上述的步骤将向血清样本添加标准物质和核酸的提取工序以及利用 DNA微阵列测定目标小型RNA的表达量和标准物质的存在量的测定工序进行各2次(第1次、第2次)。作为目标小型RNA(miRNA)，与实施例1 同样地使用检测到的约1000种miRNA。

作为目标小型RNA的各miRNA的测定值的修正如下进行。

首先，作为DNA微阵列上的8点的测定值的平均值计算出测定工序中得到的各标准物质的存在量，将其转换为以2为底的对数值。接着，计算出所得的5种标准物质的对数转换值的平均值，以此作为代表值。如上，对于各血清A～C计算出第1次和第2次的代表值。各标准物质的对数转换值及其平均值(代表值)示于表2。

关于血清A～C的2次实验之间的各miRNA的表达量的修正，以第1 次的代表值作为基准值，以与第2次的代表值的差(第2次-第1次)作为各血清中的修正系数(表3)。

接着，将各血清中的miRNA的表达量的测定值分别转换为以2为底的对数，通过各血清的第2次的对数转换值减去上述的各血清中的修正系数进行修正。

通过以上操作，进行第2次实验的miRNA的表达量的测定值的修正。

＜实施例3＞

作为标准物质，使用序列号15～17所示的实施例用标准物质，进行与实施例2同样的实验。

＜比较例2＞

作为标准物质，使用序列号6～9所示的比较例用标准物质，进行与实施例2同样的实验。

＜比较例3＞

作为标准物质，使用序列号10～14所示的比较例用标准物质，进行与实施例2同样的实验。

对于实施例2、实施例3、比较例2、比较例3的各实验，计算第1次 (基准样本)的目标小型RNA的表达量的测定值和第2次(被修正的样本)的修正后的miRNA的表达量的测定值的回归直线，将结果示于表4，另外，图4显示以第1次(基准样本、无修正)的表达量为横轴、第2次(被修正的样本、有修正)的表达量为纵轴作图而得的散点图(血清A)((A)：实施例2 的修正的结果、(B)：比较例2的修正的结果)。

第1次与第2次的实验使用同一血清，因而本来两者的结果(第1次的样本的结果与受到修正的第2次的样本的结果)应该一致，此时回归直线应与y＝x的直线重叠。将实施例2、3与比较例2、3比较，其斜率均相同。但是，在实施例2、3中，截距的绝对值为＜0.5，得到了与y＝x的直线基本重叠的结果，与此相对，在比较例2、3中，截距的绝对值为＞0.5，与y ＝x的直线较大地偏离。

如上，在实施例2、3中，2次测定实验之间，回归直线的截距的绝对值为0，得到了与y＝x接近的修正数据，可以说显示了修正后的数据的正确性高。另一方面，在比较例2、3中，回归直线的截距的绝对值大于0.5，可以说显示了修正后的数据的正确性低。

表2

表3

表4

如以上的实施例1～3和比较例1～3中所确认的那样，通过使用本发明的修正方法，能够获得用于对多个样本所含的目标小型RNA的表达量进行比较分析的正确的数据，能够进行目标小型RNA的表达量的正确的分析。

符号说明

10 装置

110 输入部

120 显示部

130 输出部

140 记忆部

150 控制部

160 转换部

170 分析部

Claims

1.一种修正方法，是用于对多个样本中的目标小型RNA的表达量进行比较分析的表达量的修正方法，包括：

2.根据权利要求1所述的修正方法，标准物质的核酸长度为200个碱基～1200个碱基。

3.根据权利要求2所述的修正方法，至少1种标准物质包含选自作为序列号1～5和15～17所示碱基序列的核酸的标准物质中的至少1种。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的修正方法，使用2种以上的标准物质。

5.根据权利要求1～4的任一项所述的修正方法，样本是来自体液的样本。

6.根据权利要求1～5的任一项所述的修正方法，目标小型RNA是miRNA。

7.根据权利要求1～6的任一项所述的修正方法，所述提取工序中的核酸试样的提取通过酚-氯仿法来进行。

8.根据权利要求1～7的任一项所述的修正方法，所述测定工序包括：使被标记物质标记的核酸试样，与固定化在支持体上的用于捕捉多个目标小型RNA的探针和用于捕捉至少1种标准物质的探针接触而进行杂交，作为信号强度测定值获得各目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量。

9.根据权利要求1～8的任一项所述的修正方法，通过所述代表值获得工序获得的代表值是由至少1种标准物质提取量的测定值计算出的、用对数值表示的平均值或中央值。

10.根据权利要求1～9的任一项所述的修正方法，所述基准值是，对于标准物质的提取量任意设定的固定数值，或者对于从所述多个样本中任意选择的第1样本获得的标准物质提取量的代表值。

11.根据权利要求1～10的任一项所述的方法，在所述修正工序中，如下进行所述修正，

12.一种装置，是为了对多个样本中的目标小型RNA的表达量进行比较分析而对表达量进行修正的装置，所述装置包含：

13.根据权利要求12所述的装置，所述代表值是由至少1种标准物质提取量的测定值计算出的、用对数值表示的平均值或中央值。

14.根据权利要求12或13所述的装置，目标小型RNA是miRNA。

15.根据权利要求12～14的任一项所述的装置，所述修正单元如下进行所述修正，

16.根据权利要求12～15的任一项所述的装置，所述记忆单元中记忆的、多个样本中的目标小型RNA的表达量和标准物质提取量的测定值，是使被标记物质标记的核酸试样，与固定化在支持体上的用于捕捉多个目标小型RNA的探针和用于捕捉至少1种标准物质的探针接触而进行杂交，作为信号强度测定值分别测定各目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量而得的值。

17.一种计算机可读取的记录介质，记录了用于为了进行表达量的修正而使1台或多台计算机执行以下工序的程序，所述表达量的修正用于在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析，

测定工序，使用核酸试样，分别测定各核酸试样中存在的目标小型RNA和标准物质的量，对于各样本获得目标小型RNA的表达量和标准物质的提取量的测定值，所述核酸试样是通过对多个样本的各样本添加至少1种标准物质，然后从各样本提取核酸而获得的，所述标准物质是核酸长度为200个碱基以上的核酸；

18.一种计算机可读取的记录介质，记录了用于为了进行表达量的修正而使1台或多台计算机作为以下单元发挥功能的程序，所述表达量的修正用于在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析，

19.一种小型RNA表达分析用芯片，包含固定化了用于选择性地捕捉多个目标小型RNA的核酸探针和用于选择性地捕捉至少1种标准物质的核酸探针的支持体，所述至少1种标准物质选自作为序列号15～17所示碱基序列的核酸的标准物质。