CN109161609B - 小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记、检测方法及应用 - Google Patents

小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记TC113325、利用该分子标记检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法及其应用，该分子标记通过以下引物扩增得到，其中上游引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，利用上述SNP分子标记TC113325检测小麦抗叶锈病基因Lr42具有检测通量高、时间短、准确性高、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点，有利于在育种工作中进行规模化应用。

Description

小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，尤其涉及一种小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记、检测方法及其应用。
背景技术
小麦作为世界40％人口的主粮，是我国三大主粮之一，我国是世界第一人口大国，粮食供应安全是我国一项需要始终坚持的战略性任务。叶锈病是小麦一种主要叶部病害，由真菌Puccinia triticina Eriks引起，病害严重的年份可以引发小麦减产40％(Knott1989)。选育和推广抗病样品是防治病害发生最有效的策略，通过分子标记将多个抗病基因聚合于同一个品种是抗病育种的主要方法。
Lr42是来自于小麦近缘种节节麦(A.tauschii(TA2450))的一个抗叶锈病基因，该基因被定位于小麦1DS染色体，本研究所用抗病亲本材料KS93U50是一个A.tauschii的渐渗系材料(Bacon et al.,2006；Singh et al.,2007)，对叶锈病具有显著的抗性，Martin etal.(2003)报道了Lr42基因对于小麦增产也具有明显的促进作用。目前Lr42仍是美国中部“硬红冬”麦区的主要抗源之一，该基因在我国的应用很少，中国农科院研究表明该基因在我国毒性频率较低，具有优异的抗病应用前景。
Sun等(2010)开发了3个与Lr42连锁的SSR分子标记，分别是Xwmc432、Xcfd15、Xgdm33，这三个标记在应用过程中存在检测程序复杂、时间长、准确性较差的问题，不能满足现代育种的需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记TC113325、利用该分子标记检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法及其应用，通过该分子标记可以更好的满足育种过程中对Lr42基因快速、低成本的精确性检测需求。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记，通过以下引物扩增得到，其中上游引物序列如SEQ ID NO.1：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTGTTTGGCAGCATCATCACC
和SEQ ID NO.2：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTGTTTGGCAGCATCATCACG所示；下游引物序列如SEQ IDNO.3：GACAACTTGAGACACTAGATATCAGAGAT所示。
进一步地，该分子标记和小麦抗叶锈病基因Lr42的遗传距离为0.2cM。
进一步地，该分子标记的突变位点为C/G。
进一步地，检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，采用上述引物扩增得到的SNP分子标记的产物进行检测。
进一步地，检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，包括以下步骤：
(1)提取小麦叶片DNA；
(2)将步骤(1)提取的小麦叶片DNA进行分子标记的PCR扩增，所用引物的序列如SEQ ID NO.1-3所示；
(3)对PCR产物进行检测，判断是否含有小麦抗叶锈病基因Lr42。
进一步地，上述步骤(2)中SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3的用量比例为12:12:30。
进一步地，上述步骤(2)中PCR扩增程序为：
(1)94℃变性15min；
(2)95℃变性30s，69℃退火35s，72℃延伸35s，然后依次每个循环退火温度降低1℃，连续10个循环；
(3)95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，连续35个循环；
(4)72℃延伸8min，扩增程序结束。
进一步地，上述步骤(3)中PCR产物检测过程为：
(1)将PCR产物离心，观察PCR反应板底部，确保没有气泡；
(2)将PCR产物放入酶标仪或荧光定量PCR仪中进行扫描；
(3)将扫描结果进行数据基因分型分析；
(4)按照突变位点基因分型对检测样品进行基因判定：基因型CC代表不含有Lr42，基因型GC代表Lr42是杂合态，基因型GG代表Lr42是纯合态。
小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记在小麦种质资源鉴定、改良及分子标记辅助育种中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记TC113325可以准确检测Lr42的存在与否，利用上述SNP分子标记TC113325检测小麦抗叶锈病基因Lr42具有检测通量高、时间短、准确性高、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点，有利于在育种工作中进行规模化应用。
附图说明
图1为本发明的小麦抗叶锈病基因Lr42的遗传连锁图；
图2为分子标记TC113325在Lr42遗传分离群体中的检测结果图；
图中：A区的检测样品基因分型为GG，B区的检测样品基因分型为CC，C区的检测样品基因分型为CG，D区的检测样品为无模板对照。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记TC113325的获取方法，包括以下步骤：
(1)构建高世代遗传分离群体：
利用Lr42已有的分子标记：Xcfd15和Xwmc432对KS93U50/Morocco的F4代群体进行扫描，发现其中的遗传分离单株即在抗病位点呈现杂合态的基因型，将单株收获后，再种植成为高世代遗传分离群体；
(2)获得SNP分子标记及设计扩增引物：
利用Lr42已有的分子标记Xcfd15和Xwmc432的小麦染色体区段在水稻、短柄草、大麦等近缘种属中的同源区段序列，寻找具有抗病结构域的基因，对找到的基因利用其保守结构域设计引物，经过KS93U50/Morocco高世代分离群体验证后，获得了3个来自水稻的连锁标记，其均位于Lr42的远着丝粒方向，将所获标记对来自Aegilops tauschii Coss.的BAC文库筛选，获得了17个阳性单株克隆，所有阳性单株克隆利用ABI3730进行双端测序后，所得序列设计STS标记，在Lr42抗病、感病亲本材料间共获得了11个SNP突变位点，所有SNP位点通过引物设计软件Primer3.0全部转化为KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)标记，获得的11个KASP标记，通过对KS93U50/Morocco组合的F5分离群体验证扫描，发现其中一个新的Lr42紧密连锁SNP分子标记TC113325与Lr42高度连锁，可以在分离群体和种质资源材料间准确检测Lr42的存在与否，如图1所示，该标记与Lr42遗传距离0.2cM，其突变位点为C/G。
实施例2
小麦抗叶锈病基因Lr42的检测方法，包括以下步骤：
(1)取KS93U50/Morocco的一个F5代分离群体的种子93个种于温室中，群体长至三叶一心时，提取群体DNA：使用QIAGEN公司的DNeasy Plant MiniKit，按照使用说明进行提取；所有群体样品DNA提取完成后，进行DNA完整性电泳检测，并利用浓度仪测定样品DNA浓度，并根据测定结果将所有样品浓度稀释至50-100ng/ul；
(2)分子标记的PCR扩增：PCR扩增体系为：DNA 2.5ul(50-100ng/ul)；混合引物0.07ul(SEQ ID NO.1:SEQ ID NO.1:SEQ ID NO.1:H2O＝12:12:30:46)；MasterMix 3ul(2×)；ddH2O 0.493ul；PCR反应总体积6.0ul；
PCR扩增程序为：94℃变性15min；95℃变性30s，69℃退火35s，72℃延伸35s，然后依次每个循环退火温度降低1℃，连续10个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，连续35个循环；72℃延伸8min，扩增程序结束。
(3)对PCR产物进行检测，判断是否含有小麦抗叶锈病基因Lr42：将PCR产物离心，观察PCR反应板底部，确保没有气泡；将PCR产物放入酶标仪(Omega，FLUOstar)或荧光定量PCR仪(Bio-red CFX96、ABI7900)中进行扫描，将扫描结果用LGC公司的Klustercaller软件进行数据基因分型分析，按照突变位点基因分型对检测样品进行基因判定：基因型CC代表不含有Lr42，基因型GC代表Lr42是杂合态，基因型GG代表Lr42是纯合态，该93个样本中基因型CC(纯合lr42)的共36个，基因型GG的共24个，杂合态的基因型CG共33个，结果如表1所示，其中表1中基因型顺序和图2中的PCR反应板顺序一一对应。
表1
Figure BDA0001834954070000061
为了进一步验证检测结果的准确性，利用叶锈病专化小种PNMR在检测样品生长至三叶一心时进行人工接菌，接菌过程为：将样品放入一个大的生长间，保持室温为20±1℃、维持100％湿度12h，然后将样品转移回温室，温室室温为20±1℃，光照12h/d，在接菌后约2周后，样品开始充分发病时进行抗性调查，抗病性分级标准如表2所示，样品的分子标记检测结果和抗病反应表型结果如表3所示。
表2
Figure BDA0001834954070000062
Figure BDA0001834954070000071
表3
Figure BDA0001834954070000072
Figure BDA0001834954070000081
Figure BDA0001834954070000091
注:-表示在原级别基础上，实际性状表型稍低于原判定级别，+表示在原级别基础上，实际性状表型稍高于原判定级别。
93个样本的抗病统计结果显示，基因型和抗病表型对应关系良好，所有GG和CG基因型的抗病表型都属于抗病范围0-2(包含0、0；、1-、1、1+、2)，基因型CC的抗病反应级别均属于感病范围3-4(包含3、3+、4)，上述结果表明，小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记TC113325可以准确的检测Lr42基因是否存在，同时具有检测通量高、时间短、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点，有利于在育种工作中进行规模化应用。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院小麦研究所
<120> 小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记、检测方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tggtgtttgg cagcatcatc acc 43
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tggtgtttgg cagcatcatc acg 43
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacaacttga gacactagat atcagagat 29

Claims (9)

1.小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记，其特征在于，通过以下引物扩增得到，其中上游引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记，其特征在于，该分子标记和小麦抗叶锈病基因Lr42的遗传距离为0.2cM。
3.根据权利要求1所述小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记，其特征在于，该分子标记的突变位点为C/G。
4.检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，其特征在于，采用权利要求1所述引物扩增得到的SNP分子标记的产物进行检测。
5.根据权利要求4所述检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取小麦叶片DNA；
(2)将步骤(1)提取的小麦叶片DNA进行分子标记的PCR扩增，所用引物的序列如SEQ IDNO.1-3所示；
(3)对PCR产物进行检测，判断是否含有小麦抗叶锈病基因Lr42。
6.根据权利要求5所述检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，其特征在于，上述步骤(2)中SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2：SEQ ID NO.3的用量比例为12:12:30。
7.根据权利要求5所述检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，其特征在于，上述步骤(2)中PCR扩增程序为：
(1)94℃变性15min；
(2)95℃变性30s，69℃退火35s，72℃延伸35s，然后依次每个循环退火温度降低1℃，连续10个循环；
(3)95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，连续35个循环；
(4)72℃延伸8min，扩增程序结束。
8.根据权利要求5所述检测小麦抗叶锈病基因Lr42的方法，其特征在于，上述步骤(3)中PCR产物检测过程为：
(1)将PCR产物离心，观察PCR反应板底部，确保没有气泡；
(2)将PCR产物放入酶标仪或荧光定量PCR仪中进行扫描；
(3)将扫描结果进行数据基因分型分析；
(4)按照突变位点基因分型对检测样品进行基因判定：基因型CC代表不含有Lr42，基因型GC代表Lr42是杂合态，基因型GG代表Lr42是纯合态。
9.如权利要求1所述小麦抗叶锈病基因Lr42的SNP分子标记在小麦种质资源鉴定、改良及分子标记辅助育种中的应用。
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