CN109609671B - 一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记选自：(a)Bra009510基因的模板链第358位核酸多态性为G或A；(b)芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种中与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸多态性为G，和/或芸薹种叶缘裂刻性状品种中与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸多态性为A；所述芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种和/或芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种选自：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种；其中，所述Bra009510基因的模板链的序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明所提供的分子标记及其所对应的引物无论在叶缘裂刻还是在全缘材料中的选择准确率均为100％，可用于分子标记辅助选择育种。

Description

一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的SNP分子标记及其应用。

背景技术

芸薹种蔬菜包括大白菜、芜菁和小白菜，具有种类多、遗传资源丰富、栽培面积广、生长周期短等特点，是我国蔬菜的重要组成部分。作为重要的叶菜类蔬菜，叶缘形态直接影响芸薹种蔬菜的商品性，而且随着市场需求变化，研究叶缘形态的分子机理，创制芸薹属蔬菜叶形特异新种质是解决市场对芸薹属蔬菜品种多样化需求的有效手段。

叶缘裂刻是植物对环境适应性的一种表现。首先，叶缘适度裂刻可以改变植株的株型，提高植物通风透光性，增强植株整体的光合作用效率，在一定程度上减缓病虫害的发生；其次，叶缘适度裂刻能够提高植物对高温、干旱等逆境胁迫的适应性；因此，研究芸薹种蔬菜叶缘裂刻调控的分子机制，对于培育商品价值高、环境适应性强的新品种具有重要意义。目前，关于叶缘发育的研究主要集中在拟南芥、番茄等模式植物上，芸薹种中叶缘裂刻基因克隆、调控机理等基础研究还十分薄弱。

曾国平和曹寿椿 (1996) 对不结球白菜的叶缘裂刻性状探究表明：不结球白菜叶缘裂刻对不裂表现为显性，是受一对核基因控制的质量性状。葛颂和洪德元 (1995) 对泡沙参复合体研究表明叶缘锯齿数目和深度属于数量性状，由多对基因控制。在白菜中，A10染色体末端是一个控制白菜类作物叶缘裂刻主效QTL（或基因）的 “Hotspot”区间。惠麦侠（2011）利用“矮抗青” F4:7重组近等基因系群体在 A10 染色体上标记位置为Bra009533-Bra009495处定位了一个199-kb的区间。Wang等（2015）利用叶缘有裂刻的欧洲白菜型油菜与叶缘无裂刻的大白菜杂交获得的 F₂ 及 F_2:3 家系在 A10 染色体上定位到一个控制叶裂的主效 QTL，位于标记 BrID10909-BrID10233 之间。本实验室利用 DH 群体及 F₂ 群体，根据亲本的重测序数据发展分子标记，在 A10 染色体上定位到控制叶裂的主效 QTL，位于标记 A1015686749- A1015850960 之间 164-kb 的区间。

利用与目标性状共分离的分子标记进行标记辅助选择（MAS）在遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在 DNA 水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种过程。 SNP 标记具有遗传稳定性高，多态性丰富，检测易实现自动化等特点，是目前最具发展潜力的分子标记，在基于分子标记辅助选择（MAS）技术的育种工作中发挥越来越重要的作用。芸薹种蔬菜的叶缘裂刻性状只有在真叶发育完全时期才能充分显现，用传统的方法受发育时期限制，且效率低。

所以，目前芸薹属蔬菜育种的科研和实践中，需要利用分子标记进行基因型鉴定，这样可以在早期对幼苗(甚至对种子)进行检测和选择，可以减少工作量，加快育种进程；因此开发与芸薹属蔬菜叶缘裂刻相关的分子标记显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴别待测芸薹种蔬菜的叶型，是否为叶缘裂刻的芸薹种蔬菜。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种芸薹种蔬菜SNP分子标记，所述SNP分子标记选自：

（a）Bra009510 基因的模板链第358位核酸多态性为G或A；（b）芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种中与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸多态性为G，和/或芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种中与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ IDNO.1第358位相对应的核酸多态性为A；所述芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种和/或芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种选自：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种；其中，所述Bra009510 基因的模板链的序列如SEQ ID NO.1所示。

一种PCR引物组，所述PCR引物组选自：

（a）Bra009510 基因的模板链第358位上游的引物、和Bra009510 基因的模板链第358位下游的引物；（b）芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应位置上游的引物、和芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置下游的引物；

所述芸薹种蔬菜品种选自芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种、芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种，包括：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种；其中，所述Bra009510 基因的模板链序列如SEQ ID NO.1所示。

一种竞争性等位基因特异性PCR引物组，所述引物组选自：

（a）以Bra009510 基因的模板链第357位及其上游一段序列为基础、以G为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；以Bra009510 基因的模板链第357位及其上游一段序列为基础、以A为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；以Bra009510 基因的模板链第358位的下游一段序列为基础设置第二方向引物；

（b）以Bra009510 基因的模板链第359位及其下游一段序列为基础、以C为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；以Bra009510 基因的模板链第359位及其下游一段序列为基础、以T为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；以Bra009510 基因的模板链第358位的上游一段序列为基础设置第二方向引物；

（c）以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第357位相对应位置及其上游一段序列为基础、以G为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第357位相对应位置及其上游一段序列为基础、以A为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置的下游一段序列为基础设置第二方向引物；

（d）以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第359位相对应位置及其下游一段序列为基础、以C为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第359位相对应位置及其下游一段序列为基础、以T为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置的上游一段序列为基础设置第二方向引物；

所述芸薹种蔬菜品种选自芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种、芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种，包括：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种。

作为优选的实施方式，所述引物组包含引物1、引物2和引物3；

所述第一方向第一引物为引物1，具体序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 2所示；

其中，特异性部分为：

5’-CACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 3所示；

5’端第一接头序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 4所示；

所述第一方向第二引物为引物2，具体序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 5所示；

其中，特异性部分为：

5’-TACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 6所示；

5’端第二接头序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，如SEQ ID NO. 7所示；

所述第二方向引物为引物3，具体序列为：

5’-GCTCAGGCAAGAGTACGAAGTTGTT，如SEQ ID NO. 8所示；

优选地，所述竞争性等位基因特异性引物组还包含F探针与H探针；

所述F探针的序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 9所示；

所述F探针的5’端带有第一荧光基团，优选地，所述第一荧光基团为FAM荧光基团；

所述H探针的序列为：

5’ - GAAGGTCGGAGTCAACGGAT，如SEQ ID NO. 10所示；

所述H探针的5’端带有第二荧光基团，优选地，所述第二荧光基团为HEX荧光基团。

一种检测如权利要求1所述的芸薹种蔬菜SNP分子标记的方法，选自：

方法1：对芸薹种蔬菜基因组进行测序；方法2：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行完全测序或部分测序或外显子测序；方法3：对芸薹种蔬菜转录组进行全长测序或部分测序；方法4：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行cDNA完全测序或部分测序；方法5：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于杂交的检测；方法6：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于核酸扩增的检测；方法7：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于核酸扩增与荧光信号的检测；或方法8：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行竞争性等位基因特异性检测； 其中，所述Bra009510 基因的模板链序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选的实施方式，所述方法6是使用如权利要求2所述的PCR引物组进行的；和/或所述方法8是使用如权利要求3所述的引物组进行的；优选地，所述方法8是使用如权利要求4所述的引物组进行的。

作为优选的实施方式，所述竞争性等位基因特异性PCR检测的步骤包括：

S1：提取芸薹种蔬菜模板DNA；S2：加样品：在微孔板中加入待测 DNA 模板，55-65°C 烘干；S3：加液：向每个反应孔中加入Master mix；S4：加引物：向每个反应孔中加入引物预混液，其中引物预混液包括所述引物1、所述引物2和所述引物3的混合液；S5：封膜；S6：扩增反应；S7：荧光信号分型。

作为优选的实施方式，所述竞争性等位基因特异性PCR检测的步骤中：

步骤S1为采用CTAB 法提取待测芸薹种蔬菜组织的基因组DNA，优选将该基因组DNA稀释为DNA浓度为5-15ng /μl的待测DNA；和/或，所述微孔板是384 微孔板或 1536 微孔板；和/或，在微孔板中加入待测 DNA 模板是利用 K-pette 分液工作站进行的；和/或，向每个反应孔中加入Master mix 是在Kraken 操作系统下利用 Meridian 加样工作站进行的；和/或，所述引物1、所述引物2、所述引物3的摩尔浓度比为2:（1-3）: （4-6），优选为2:2:5 混合；优选地，各引物终浓度为8-12μM/L ，更优选为10μM/L；和/或，将微孔板依次放在Kube 热封仪和 Fusion 激光封膜仪上进行所述封膜；

和/或，步骤S6的反应体系如下：

当所述反应体系为384孔反应体系时，组分包括：

Master mix，3μl；浓度为10umol/L的引物混合液的终浓度为1/72μmol/L；DNA干粉，30-90ng，每个样品的总体积为；3μl；

当所述反应体系为1536孔反应体系时，组分包括：

Master mix，1μl；浓度为10umol/L的引物混合液的终浓度为1/72μmol/L；DNA干粉，10-30ng，每个样品的总体积为：1μl；

和/或，步骤S6的程序如下：

S6.1：94°C 预变性， 15 分钟；S6.2：先于94°C变性20s，再在61-55℃之内touchdown 程序扩增 10 个循环，每循环降低0.6℃，每个循环的时间为1min；S6.3：先于94°C变性20s，再在55°C复性和延伸总时间1min，共扩增26个循环，得到PCR扩增产物；

和/或，在步骤S6中，PCR 反应是在高通量水浴系统 Hydrocycler 中进行的；和/或，步骤S7是利用 BMG PHERAstar 仪器检测该扩增产物的荧光信号并查看分型情况进行的。

一种试剂盒，含有所述PCR引物组，或所述竞争性等位基因特异性引物组。

所述SNP分子标记、或所述引物组、或所述检测方法、或所述试剂盒在如下A-F任一种中的应用：

A、在监测、鉴别或辅助鉴别芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用；B、在选育叶缘裂刻芸薹种蔬菜品种中的应用；C、在芸薹种蔬菜育种中的应用；D、预测芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用；E、在制备鉴别或辅助鉴别芸薹种蔬菜叶缘形状产品中的应用；F、在制备预测芸薹种蔬菜叶缘形状产品中的应用。

本发明的有益效果为：

利用本发明所提供的分子标记SNP位点A1015797093A/G 位点的多态性或基因型及其所对应的引物无论在叶缘裂刻还是在全缘材料中的选择准确率均为 100%。由此表明，本发明所提供的分子标记（SNP位点）A1015797093A/G 位点及其所对应的引物将有助于叶缘裂刻芸薹种蔬菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

附图说明

图1为预测的白菜的Bra009510 基因多态性为G和A的蛋白结构模型示意图。

图2为拟南芥分生组织调控基因互作模型示意图。

图3为 实施例2中A1015797093A/G 位点在 73 份 DH 群体中的基因分型鉴定图。

具体实施方式

本发明中定义如下：“与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸”指，当与Bra009510同源的同源基因与SEQ ID NO.1相互比较同源性的时候，以SEQ ID NO.1第358位为中心，以SEQ ID NO.1第357位向上游拓展以及第359位向下拓展，对同源基因与SEQ ID NO.1进行最大的匹配，将突变基因中与SEQ ID NO.1第358位对应的核酸定义为“与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸”。

在这样的定义下，当相对于SEQ ID NO.1第358位对应的上下游发生了删除、插入后，不是以该同源基因的起点计算目标SNP的位置序号，而是以与SEQ ID NO.1第357位向上游拓展以及第359位向下拓展对齐匹配最好后第358位点相应位点为目标SNP检测的位点。

第一方面，本发明提供一种检测芸薹种蔬菜叶裂性状的SNP分子标记，该SNP位点的多态性为G或者为A。

上述SNP分子标记选自：

（1）Bra009510 基因的模板链5’-3’方向上第358位核酸多态性为G或A；

（2）芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应的核酸为G或A-；

所述芸薹种蔬菜品种选自芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种、芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种，包括：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种。

其中，所述Bra009510 基因的模板链的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，该SNP位点A1015797093A/G对应白菜的Bra009510 基因模板链（也可称为反义链）序列；该Bra009510基因的模板链的编号起止位点：A10:15796736-A10:15798370。

使用在线预测蛋白质结构模型的工具SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）对野生型和突变体的蛋白结构模型进行预测，结果如图1所示。

该Bra009510基因的模板链在拟南芥中的高度同源基因LMI1是调控开花及花发育关键基因 LFY（LEAFY）（Weigel et al.,1993）的靶基因，在拟南芥叶片的形态建成中起着关键作用，是维持叶片简单锯齿所必须的。在 lmi1 的突变体中，CAL（CAULIFLOWER）基因（Kempin et al., 1995）表达出现了明显的下调，表明 LMI1 是 CAL 的直接上游调控基因，进一步研究表明，LMI1 与 LFY 共同诱导 CAL 的表达，而 CAL 又是 AP1 (APETALA1)的上游调控基因（Mandel et al.,1992; Liljegren et al., 1999），在此基础上提出了分生组织调控模型，如图2所示。

第二方面，本发明提供用于检测上述SNP分子标记的引物组。

1、用于普通PCR扩增的引物时，该引物组选自：

（a）Bra009510 基因的模板链第358位上游的引物、和Bra009510 基因的模板链第358位下游的引物；

（b）芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中，与SEQ ID NO.1第358位相对应位置上游的引物、和芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置下游的引物；

所述芸薹种蔬菜品种选自芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种、芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种，包括：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种；

其中，所述Bra009510 基因的模板链的序列如SEQ ID NO.1所示。

2、用于竞争性等位基因特异性PCR（KASP）扩增的引物时，该引物组选自：

（a）以Bra009510 基因的模板链第357位及其上游一段序列为基础、以G为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；

以Bra009510 基因的模板链第357位及其上游一段序列为基础、以A为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；

以Bra009510 基因的模板链第358位的下游一段序列为基础设置第二方向引物；

（b）以Bra009510 基因的模板链第359位及其下游一段序列为基础、以C为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；

以Bra009510 基因的模板链第359位及其下游一段序列为基础、以T为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；

以Bra009510 基因的模板链第358位的上游一段序列为基础设置第二方向引物；

（c）以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第357位相对应位置及其上游一段序列为基础、以G为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；

以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第357位相对应位置及其上游一段序列为基础、以A为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；

以芸薹种蔬菜品种中与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置的下游一段序列为基础设置第二方向引物；

（d）以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第359位相对应位置及其下游一段序列为基础、以C为3’端设置第一方向第一引物的特异部分；

以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第359位相对应位置及其下游一段序列为基础、以T为3’端设置第一方向第二引物的特异部分；

以芸薹种蔬菜品种与Bra009510同源的同源基因中与SEQ ID NO.1第358位相对应位置的上游一段序列为基础设置第二方向引物；

上述芸薹种蔬菜品种选自芸薹种蔬菜保持叶全缘性状品种、芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状品种，包括：自然界的品种、杂交品种、人工诱变品种。

作为优选的实施方式，该KASP引物包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组，具体为：

引物1为上述第一方向第一引物，具体序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 2所示；

其中，特异性部分为：

5’-CACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 3所示；

5’端第一接头序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 4所示；

引物2上述为第一方向第二引物，具体序列为：

5’- GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 5所示；

其中，特异性部分为：

5’-TACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 6所示；

5’端第二接头序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，如SEQ ID NO. 7所示；

引物3为上述第二方向引物，具体序列为：

5’-GCTCAGGCAAGAGTACGAAGTTGTT，如SEQ ID NO. 8所示；

优选地，所述KASP引物组还包含F探针与H探针；

所述F探针的序列为：

5’ -GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 9所示；

所述F探针的5’端带有第一荧光基团，优选地，所述第一荧光基团为FAM荧光基团；

所述H探针的序列为：

5’ - GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，如SEQ ID NO. 10所示；

所述H探针的5’端带有第二荧光基团，优选地，所述第二荧光基团为HEX荧光基团。

第三方面，本发明提供SNP分子标记检测芸薹种蔬菜叶裂性状的KASP试剂盒，该试剂盒包括：由上述引物1、引物2和引物3所组成的引物组；

优选地，上述试剂盒还包括：探针F，其核苷酸碱基序列为：

5’ GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’，且5’端带有一个FAM荧光基团；

探针H，其核苷酸碱基序列为：

5’ GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’，且5’端带有一个HEX荧光基团；

dNTP：体系中终浓度为20-200μmol/L，优选为100μmol/L，

氯化镁：体系中终浓度为0.1-2mmol/L，优选为1.5mmol/L，

DNA聚合酶：体系中终浓度为0.1-0.5U /μL，

PCR缓冲液：由体系中终浓度为10-50mmol/L的氯化钾与体系中终浓度为1-10mmol/L 的Tris-HCL（pH7.5-9.0）配制而成。

优选地，上述试剂盒采用LGC有限公司提供的配套试剂，包括：

上述引物1、引物2和引物3在加入体系之前被配制为10 μmol/L的工作液，在体系中的终浓度为1/72μmol/L，

反应体系由适用于SNP分型的工作液a配制。

第四方面，本发明提供一种鉴别或辅助鉴别待测芸薹种蔬菜是否为叶缘裂刻芸薹种蔬菜的检测方法，包括如下步骤：

检测待测芸薹种蔬菜基因组A1015797093A/G位点的多态性或基因型，若上述待测芸薹种蔬菜基因组A1015797093A/G位点的多态性或基因型为AA或AG，则上述待测芸薹种蔬菜为叶缘裂刻芸薹种蔬菜或候选叶缘裂刻芸薹种蔬菜；若上述待鉴别芸薹种蔬菜基因组A1015797093A/G位点的多态性或基因型为GG，则上述待鉴别芸薹种蔬菜为非叶缘裂刻芸薹种蔬菜或非候选叶缘裂刻芸薹种蔬菜。

其中，上述检测待鉴别芸薹种蔬菜基因组A1015797093A/G位点的多态性或基因型的方法为如下：

方法1：对芸薹种蔬菜基因组进行测序；

方法2：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行完全测序或部分测序或外显子测序；

方法3：对芸薹种蔬菜转录组进行全长测序或部分测序；

方法4：对Bra009510 基因或其同源基因进行cDNA完全测序或部分测序；

方法5：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于杂交的检测；

方法6：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于核酸扩增的检测；该方法采用上述PCR引物组；

方法7：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行基于核酸扩增与荧光信号的检测；

方法8：对芸薹种蔬菜Bra009510 基因或其同源基因进行KASP检测；该方法采用上述KASP引物组。

其中，所述Bra009510 基因的模板链的序列如SEQ ID NO.1所示；检测方法引物的组成详见第二方面所述。

优选地，上述检测方法8包括如下步骤：

步骤一、DNA 提取：

优选采用CTAB 法分别提取待测植株的基因组DNA，并将该基因组DNA稀释为DNA浓度为5-15ng /μl ，优选为10ng /μl的待测DNA。

步骤二、竞争性等位基因特异性PCR（KASP）扩增反应：

对上述待测样品进行等位基因特异性PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。

作为优选的实施方式，上述竞争性等位基因特异性PCR扩增反应按照英国 LGC(Laboratory of the Government Chemist 政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性 PCR 技术的实验流程进行实验，试剂除特殊说明为均为 LGC 公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照 LGC 公司的操作指南 GenetypingAssay，Manual Part#15004070 Rev.B 进行。KASP 反应在 384 微孔板或1536 微孔板(Cat. No. 04729749001, Roche)中进行，反应体系为 3ul或1ul。优选采用应该LGC 公司提供的配套试剂中的PCR体系（单个反应）：

组分	384反应体系	1536反应体系
			适用于SNP分型的工作液a（即为Master mix）	3μl	1μl
引物混合液（10umol/L）	终浓度1/72μmol/L	终浓度1/72μmol/L
			DNA干粉	30-90ng	10-30ng
总体积/每样品	3μl	1μl

上述适用于SNP分型的工作液a可通过商业途径购买到。

具体步骤如下：

（1）加样品：利用 K-pette 分液工作站在微孔板中加入待测 DNA 模板，55-65°C，优选60°C 烘干。

（2）加液：Kraken 操作系统下利用 Meridian 加样工作站向每个反应孔中加入Master mix（KBS-1016-002或Cat. No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist；其中包括F探针与H探针）。

（3）加引物：再向每个反应孔中加入引物预混液(引物1、引物2、引物3的摩尔浓度比为2：（1-3）：（4-6），优选为2:2:5 混合，各引物预先配制成8-12μM/L，优选为10μM/L的溶液，再按照上述摩尔浓度配制成预混液)，混合。

（4）封膜：将微孔板依次放在 Kube 热封仪和 Fusion 激光封膜仪上封膜。

（5）反应程序：该PCR 反应在高通量水浴系统 Hydrocycler 中进行，反应程序如下：

（5.1）94°C 预变性， 15 分钟。

（5.2）先于94°C变性20s，再在61-55℃之内touch down 程序扩增 10 个循环，每循环降低0.6℃，每个循环的时间（即复性和延伸的总时间）为1min。此步骤的目的在于避免非特异性PCR产物的出现，一开始61℃温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。

（5.3）先于94°C变性20s，再在55°C复性和延伸总时间1min，共扩增26个循环，得到PCR扩增产物。此步骤的目的是为了将上一步获得的特异目标序列大规模扩增。

在上述步骤（5.1）、（5.2）中，完成了以下3个反应：

反应I：变性的DNA模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。

3、扩增结束后，利用 BMG PHERAstar 仪器检测该扩增产物的荧光信号并查看分型情况：若分型不充分，则继续扩增，每 3 个循环查看分型情况，直至分型完全。

作为另一种实施方式，等位基因特异性PCR扩增反应的体系如下：

待测DNA：体系中终浓度为5-40mg/L，优选为10-30mg/L；

引物1-3的摩尔比为2：2：5，三者总的终浓度为10-15mmol/L，优选为13.9mmol/L，该摩尔比如果不符合上述比例则会影响PCR反应的效果，

探针F、Ｈ的摩尔比为1：1，二者总的终浓度为：10-15mmol/L，

dNTP：体系中终浓度为20-200μmol/L，优选为100μmol/L，

氯化镁：体系中终浓度为0.1-2mmol/L，优选为1.5mmol/L，

DNA聚合酶：体系中终浓度为0.1-0.5U /μL，

PCR缓冲液：由体系中终浓度为10-50mmol/L的氯化钾与体系中终浓度为1-10mmol/L 的Tris-HCL（pH7.5-9.0）配制而成。

上述PCR 反应优选在高通量水浴系统 Hydrocycler 中进行，其PCR程序同上。

第六方面，本发明提供上述SNP分子标记、上述引物、上述试剂盒、上述方法在如下A-F任一中的应用：

A、在鉴别或辅助鉴别芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用；

B、在选育叶缘裂刻芸薹种蔬菜品种中的应用；

C、芸薹种蔬菜育种中的应用；

D、预测芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用；

E、在制备鉴别或辅助鉴别芸薹种蔬菜叶缘形状产品中的应用；

F、在制备预测芸薹种蔬菜叶缘形状产品中的应用。

第七方面，本发明提供一种芸薹种蔬菜的育种方法，该方法包括检测待测芸薹种蔬菜基因组中权利上述SNP分子标记，选择该SNP分子标记为AA的待测芸薹种蔬菜作为亲本进行育种。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

分子标记及其引物的获得

一、获得分子标记：

本发明的实施基础为：发明人课题组将大量叶缘表型各异的芸薹种蔬菜品种通过Illumina HiSeq2000平台进行重测序，获得大量品种间的SNP变异位点。

实施内容为：通过对叶缘裂刻表型进行QTL分析及精细定位获得候选基因后，用位于候选基因上的分型良好的SNP位点来进行叶缘裂刻性状的SNP位点分析，所以本发明的分子标记能够准确地检测出品种的叶型。

步骤一：获取主效 QTL：为了更好更快地筛选获得叶缘裂刻芸薹种蔬菜资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行，通过对由 73 个株系构成的 DH 群体（详见表1）进行叶缘裂刻 QTL 定位，在 A10 染色体上获得了一个控制叶缘裂刻性状的主效 QTL。具体包括：

1、构建自然群体：首先根据所研究的叶缘裂刻表型性状，选取表型具有极端差异的材料作为亲本构建群体：叶缘深裂的芜菁种质‘MM’和叶全缘的大白菜高代自交系 “白阳”杂交获得F₁代，再利用游离小孢子培养获得 DH 群体，将F₁代自交得到F₂群体。

2、基因型鉴定及表型调查：将群体及亲本在多个年份和多个环境下种植，获得群体的叶缘表型数据，并对群体单株进行基因组DNA提取，并采用在双亲中有多态性SNP分子标记进行基因型鉴定。

3、QTL定位：利用joinmap等软件结合基因型数据和叶裂表型数据进行QTL定位，分析每个QTL的遗传效应，将LOD值>3且表型贡献率大的QTL作为主效QTL。

步骤二：在该主效QTL的区间进一步设计并筛选 SNP 标记，最终发现在 A10 染色体第 15797093 位的碱基有一个 A/G 变异的SNP位点（序列表序列1中第358位核苷酸），该SNP位点命名为 A1015797093A/G SNP位点。根据 A1015797093A/G 位点，设计如下可用于KASP 技术的特异的引物作为分子标记：上游第一荧光引物 A1015797093A/G-FF 、上游第二荧光引物 A1015797093A/G-FV 和下游引物 A1015797093A/G-R。

具体包括：1、遗传定位区间：首先确定主效QTL在 A10染色体的遗传定位区间，挑选在该定位区间内基因型为杂合的交换单株进行下一步的精细定位。

2、精细定位和获取标记：筛选出在该区间内双亲间存在多态性且分型良好的SNP标记，并对挑选出的交换单株进行基因的鉴定，结合交换单株的表型进一步缩小定位区间，找到该区间内与叶缘裂刻表型紧密连锁的SNP标记。该SNP位点A1015797093A/G对应白菜的Bra009510 基因（Brassica Database中的编号）； Bra009510基因模板链的编号起止位点：A10:15796736-A10:15798370。

其中，使用的数据库为Brassica Database（ http://brassicadb.org），基因编号为Bra009510，显示为以下Bra009510基因的模板链（SEQ ID NO.1）。

>A10:15796736..15798370

TTACGGGAAAGGGGGCCAGCAAGAGGAAGCGATGAGCATCGGGTTGTTGTACTGATCAAC

AACGTAAATTTGATTTTCTCCATTGATTTGATTGTTGTTTAAATTTTCTTCTCTTGGATG

AGCTATCACCACCGATGGAATCTCCGTCATGTCTTCACCACCGGAGATCTGTTTCTTGAT

CAATCCCTGGTCTCTTAGTAGAGCTCTTAGCTTCTTCACCTGTGGTACAAATCAAGTTGT

GGGATGGGGTCTCTTTGATAGAATCAAGAACTAAGGGACAAAACAAGTTAATGAAAATAT

CTATGATTTTGAAAAATATTGCAATATGGTAAATGGTACACTAGACCTCCTCGTGCAG（突变位点）CA

TCTGCTTCTCTCTAGAAACAACTTCGTACTCTTGCCTGAGCGAATCGTATAGCTGCTCAA

GCTGCTTCGCCTTCCACCGTGCACGGCGGTTCTGGAACCAAACCGCGATCTGACGTGGCT

GCAAACCAAGCTCTCTCGACAGCTTCAGCTTCCTGTCTGAATCTAGTTTGATCTCTTCTT

GAAAGCTCCGTTCAAGTGAAGCTAATTGTCCACTCGTTAGTCTCTTCTTCTTTATCATCT

CGTTGTCGTAGCTTGGAAATTGGTACGCATTGATTATCTTTTCTGATTCCGGTACAGAGA

TAACCGGTCCGATTTGCGCATCTGTCGGTGTGCATGAATTTCCTAGTGTAACACAAAAAC

AACAACAGCAAATAGTATAAGCGAATCACAACTTATCAAAAGTGACGTTTTTAACTTTAG

AATTTGGATCCCAAGAAAAAAGTATTCTGGATCCCAAAAAGAAGAAGAAATTTAAATATT

AAATTTTCTAGACTGAAGATAAGAACATCTTAAATTCTCATCTCAGAAAGAGTAACGATT

TTAGGTAACATATATACCCCCAAGCAGTGGCGGACCCAGGATTTTTATAAACCTGGGTCA

GAAATTAATTGGGCTTTAAAATCAAAACTAAAAAAGGAAAAAAGTGGATGTCAAGAGAGG

TTTGAACCCTGGTTTAGAGGTGTCAGCCGAAGTCAAAACACCACTAGAGCTAGCGAAATT

CAGTTGTACATAATTAACAAACCAGATTTATAAAATTTAAGGGGTGTCAGCTGAACCCCC

TTCTTTATACATAGGTCCGCCACTGCCCCCAAGGTCTTTGGAATAAAGCCTATGAATACT

TTCTCAAATAAATAGTTCACAACAAAAGAAAATAACTTAGAACTTAAGAACACTTCCAAG

AAAGAAAAAAAGACAAGTGAAAGTGGGAAAGTACGTTTTTTTCTACTTTATGGATTTGTT

GGGACAAAAAAAAAAAGGTTCACGGACTTGTCAAACGTGAGATCAATTTGGAACTTACAA

TATAAACGAACATTTTGGTGAATATATATATGAATTGAAGCCTTAAGCCAAAAGAGATAG

AACAATGTATGCATCTAATTAAACAGAAACAAGAGCATCTATGTAGTCAAATGATCTATA

AATGTGTGCATATATACCTGAATAAGGATCATAGTTGGAGCTATGGAGCGAGTTAAATGA

GCTTGACTCCGGCCATGGCGGTGGCATAAAAGCAACTCTCACGTTTTCTAAGTTTCTTGT

CGTTGTCCATTCCAT

表1为73份DH群体材料在A1015797093A/G位点的基因分型及表型统计表。

二、获得引物和探针：

步骤一：设计识别SNP位点的特异性引物，各对应一个SNP的等位基因。

首先提交目标位点上下游各100bp的序列（ATAGAATCAAGAACTAAGGGACAAAACAAGTTAATGAAAATATCTATGATTTTGAAAAATATTGCAATATGGTAAATGGTACACTAGACCTCCTCGTGCA[G/A]CATCTGCTTCTCTCTAGAAACAACTTCGTACTCTTGCCTGAGCGAATCGTATAGCTGCTCAAGCTGCTTCGCCTTCCACCGTGCACGGCGGTTCTGGAAC）利用Kraken 软件进行SNP位点特异引物组的设计，包括两条末端碱基不同的等位基因正向引物（引物A1和引物A2）与一条反向引物（引物3）

引物A1核苷酸序列为：CACTAGACCTCCTCGTGCAG（本发明特异引物）；

引物A2核苷酸序列为：TACACTAGACCTCCTCGTGCAA（本发明特异引物）

引物3（A1015797093A/G-R）的核苷酸序列为：GCTCAGGCAAGAGTACGAAGTTGTT（本发明特异引物）

然后引物A1的5’端加上接头序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，组成引物1（上游引物A1015797093A/G-FF）：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTAGACCTCCTCGTGCAG；引物A2的5’端加上接头序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT组成引物2（上游引物A1015797093A/G-FV）：GAAGGTCGG AGTCAACGGATTTACACTAGACCTCCTCGTGCAA。

上述引物1-3可以委托英国 LGC (Laboratory of the Government Chemist 政府化学家实验室)有限公司，也可以委托华大基因等生物公司合成。

上述上游引物1、2的最后一位碱基 A/G 对应 A10 染色体上第 15797093 位的SNP 位点，即序列表序列 1 中第 358位核苷酸。

步骤二：准备带有不同荧光的两条探针：F探针与H探针。

F探针与引物1的接头序列一致，5’端带有一个FAM荧光基团，H探针与引物2的接头序列一致，5’端带有一个HEX荧光基团。

实施例2

本实施例为利用英国 LGC公司的配套试剂来检测A1015797093A/G 位点在鉴定的叶缘裂刻和全缘材料中的应用，即用实施例1获得的引物再来检测实施例1的73份材料的叶形，以验证检测效果。本实施例的检测方法包括以下步骤：

1、DNA 提取

常规 CTAB 法分别提取73 份DH群体单株的基因组 DNA。

具体为：

摘取幼苗期的上述73个品种的叶片，-40℃冷冻1天以上，然后置于真空干燥仪（CoolSafe 55-4）中脱水；再取20µg干粉状叶片，按照CTAB法提取DNA，具体如下；

ⅰ.向所述干粉状叶片中加入CTAB提取液（2% CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HClpH8.0，20mM EDTA pH8.0，1% PVP-40，0.2% β-巯基乙醇），混匀，于65℃水浴0.5小时，得到混合物A；

ⅱ.将混合物A停止水浴，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提两次，得到上清液A；

ⅲ.向上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液（75% 乙醇）洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4）溶解，得到溶液A；

ⅳ. 向溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/mL，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提一次，得到上清液B；

ⅴ.向取上清液B中加入1/10体积3M 醋酸钠pH7.5、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；

ⅵ. 用75%乙醇洗涤DNA沉淀，风干，加适量ddH₂O溶解DNA，得到材料基因组DNA；

用微量分光光度计以OD₂₆₀值（NanoDrop2000）测量浓度，将DNA工作液浓度调整为10ng/µL。

琼脂糖电泳和 Nanodrop2000 分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA 均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2000检测 A260/280 介于 1.8-2.0 之间 (DNA 样品没有蛋白污染) ；A260/230介于 1.8-2.0 之间 (DNA 样品盐离子浓度低) ；270nm 没有明显的光吸收(DNA 样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性 PCR 技术检测的 DNA 用量为 4-10ng/每样品。稀释DNA 浓度成为 10ng /μl 备用，得到待测 DNA。

2、基于竞争性等位基因特异性 PCR

按照英国 LGC (Laboratory of the Government Chemist 政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性 PCR 技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为 LGC 公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照 LGC 公司的操作指南 GenetypingAssay，Manual Part#15004070 Rev.B 进行。KASP 反应在 384 微孔板或 1536 微孔板(Cat. No. 04729749001, Roche)中进行，反应体系为 3ul或1ul。

具体步骤为：

（1）首先利用 K-pette 分液工作站在微孔板中加入待测 DNA 模板 (4ng /μl)1.5 ul，60°C 烘干。

（2）然后在 Kraken 操作系统下利用 Meridian 加样工作站向每个反应孔中加入1Í Master mix（KBS-1016-002或Cat. No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist）与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比2：2：5混合，其中各引物在加入反应孔之前已经配制为终浓度为 10μM的溶液)， Mix 分装完毕立即将微孔板依次放在 Kube 热封仪和 Fusion 激光封膜仪上封膜。

（3）PCR 反应在高通量水浴系统 Hydrocycler 中进行，具体程序为 94°C 预变性， 15 分钟；94°C，20 秒(变性) -61°C-55°C，1 分钟(复性&延伸：以touch down 程 序扩增 10 个循环，每循环降低0.6°C)；94°C，20秒(变性)-55°C，60 秒继续扩增 26 个循环。扩增结束后，利用 BMG PHERAstar 仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每 3 个循环查看分型情况，直至分型完全。

结果如图3所示，结果显示分型效果良好，两个纯合基因型（AA和GG）和杂合基因型（AG）各自分成一堆，没有交叉等情况出现；A1015797093A/G 位点的引物组（A1015797093A/G-FF、A1015797093A/G-FV和A1015797093A/G-R）能够特异区分该位点为纯合 AA、或纯合GG 或杂合A/G的材料。

若待测芸薹种蔬菜 A1015797093A/G 位点的核苷酸为 GG 纯合，则待测芸薹种蔬菜为叶缘全缘芸薹种蔬菜；若待测芸薹种蔬菜 A1015797093A/G 位点的核苷酸为 AA 纯合或 A/G 杂合，则待测芸薹种蔬菜为叶缘裂刻芸薹种蔬菜。

结果如表1所示，在41份表型为叶缘裂刻的材料中，分子标记鉴定A1015797093A/G位点为AA纯合的材料有37份，杂合A/G位点的有4份。在32份表型为绿色的材料中，A1015797093A/G位点为GG纯合的材料有32份，与实际完全相符，本发明方法的鉴定准确度为100%。

结果如表1所示在图3的视图中，如标记2所示的簇，在41份表型为叶缘裂刻的材料中，分子标记鉴定A1015797093A/G位点为AA纯合的材料有37份（包括DH-1到DH37），如标记3所示的簇，杂合GA/AG位点的有4份（包括DH-38到DH41）。如标记4所示的簇，在32份表型为叶缘全缘的材料中，A1015797093A/G位点为GG纯合的材料有32份（包括DH-42到DH73），与实际完全相符，本发明方法的鉴定准确度为100%。而NTC（标记5的点）位于原点。另外，本发明的重测序结果尚未公开，因此，本发明所检测的SNP位点是新的SNP位点。

由此可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测芸薹种蔬菜的叶缘形状（叶缘裂刻或全缘）。

实施例3

本实施例为利用英国 LGC公司的配套试剂来检测A1015797093A/G 位点在鉴定的叶缘裂刻和全缘材料中的应用，即用实施例1获得的引物再来检测其他品种的芸薹种蔬菜叶形，以验证检测效果。

本实施例的品种为：叶缘裂刻的芜菁品种：早生金町、白丽、新星圆、红圆、津田、白玉、长黄、purple top white globe、ECD-01、ECD-02、ECD-03、ECD-04共12份，全缘的芸薹种蔬菜品种：夏翠、春泉、刑都优丰、夏宝、伏强、536、胶二叶、优夏王、夏王子、二月白、改良青杂三号、津青60，共12份。

本实施例的检测方法的操作包括以下步骤：。

1、DNA 提取：与实施例2的操作步骤和参数相同。

2、基于竞争性等位基因特异性 PCR

按照LGC 公司的操作指南 GenetypingAssay，Manual Part#15004070 Rev.B 进行；KASP 反应在 384 微孔板或 1536 微孔板(Cat. No. 04729749001, Roche)中进行，反应体系为 3ul或1ul。

具体步骤为：

（1）首先利用 K-pette 分液工作站在微孔板中加入待测 DNA 模板 (4ng /μl)1.5 ul，60°C 烘干。

（2）然后在 Kraken 操作系统下利用 Meridian 加样工作站向每个反应孔中加入1Í Master mix（KBS-1016-002或Cat. No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist）与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比2：2：5混合，其中各引物在加入反应孔之前已经配制为终浓度为 10μM的溶液)， Mix 分装完毕立即将微孔板依次放在 Kube 热封仪和 Fusion 激光封膜仪上封膜。

（3）PCR 反应在高通量水浴系统 Hydrocycler 中进行，具体程序为 94°C 预变性， 15 分钟；94°C，20 秒(变性) -61°C-55°C，1 分钟(复性&延伸：以touch down 程 序扩增 10 个循环，每循环降低0.6°C)；94°C，20秒(变性)-55°C，60 秒继续扩增 26 个循环。扩增结束后，利用 BMG PHERAstar 仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每 3 个循环查看分型情况，直至分型完全。

分型结果表明，在12份表型为叶缘裂刻的材料中，分子标记鉴定A1015797093A/G位点为AA纯合的材料有11份，杂合A/G位点的有1份。在12份表型为叶全缘的材料中，A1015797093A/G位点为GG纯合的材料有12份，与实际完全相符，本发明方法的鉴定准确度为100%。

对比例1

本对比例为利用英国 LGC公司的配套试剂来检测A1015797093A/G 位点在鉴定的叶缘裂刻和全缘材料中的应用。

本实施例采用的蔬菜的品种、数量，检测方法的操作方式和参数均参见实施例3，与实施例3的区别为：引物1、2、3的摩尔比为5：5：2。

分型结果显示分型效果不佳，两个纯合基因型（AA和GG）和杂合基因型（AG）重叠严重。

<110>北京市农林科学院，京研益农（北京）种业科技有限公司

<120>一种检测芸薹种蔬菜叶缘裂刻性状的SNP分子标记及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213>白菜（Brassica rapa），十字花科（Crueiferae）芸薹属（Brassica）

<400> 1

ttacgggaaa gggggccagc aagaggaagc gatgagcatc gggttgttgt actgatcaac 60

aacgtaaatt tgattttctc cattgatttg attgttgttt aaattttctt ctcttggatg 120

agctatcacc accgatggaa tctccgtcat gtcttcacca ccggagatct gtttcttgat 180

caatccctgg tctcttagta gagctcttag cttcttcacc tgtggtacaa atcaagttgt 240

gggatggggt ctctttgata gaatcaagaa ctaagggaca aaacaagtta atgaaaatat 300

ctatgatttt gaaaaatatt gcaatatggt aaatggtaca ctagacctcc tcgtgcagca 360

tctgcttctc tctagaaaca acttcgtact cttgcctgag cgaatcgtat agctgctcaa 420

gctgcttcgc cttccaccgt gcacggcggt tctggaacca aaccgcgatc tgacgtggct 480

gcaaaccaag ctctctcgac agcttcagct tcctgtctga atctagtttg atctcttctt 540

gaaagctccg ttcaagtgaa gctaattgtc cactcgttag tctcttcttc tttatcatct 600

cgttgtcgta gcttggaaat tggtacgcat tgattatctt ttctgattcc ggtacagaga 660

taaccggtcc gatttgcgca tctgtcggtg tgcatgaatt tcctagtgta acacaaaaac 720

aacaacagca aatagtataa gcgaatcaca acttatcaaa agtgacgttt ttaactttag 780

aatttggatc ccaagaaaaa agtattctgg atcccaaaaa gaagaagaaa tttaaatatt 840

aaattttcta gactgaagat aagaacatct taaattctca tctcagaaag agtaacgatt 900

ttaggtaaca tatatacccc caagcagtgg cggacccagg atttttataa acctgggtca 960

gaaattaatt gggctttaaa atcaaaacta aaaaaggaaa aaagtggatg tcaagagagg 1020

tttgaaccct ggtttagagg tgtcagccga agtcaaaaca ccactagagc tagcgaaatt 1080

cagttgtaca taattaacaa accagattta taaaatttaa ggggtgtcag ctgaaccccc 1140

ttctttatac ataggtccgc cactgccccc aaggtctttg gaataaagcc tatgaatact 1200

ttctcaaata aatagttcac aacaaaagaa aataacttag aacttaagaa cacttccaag 1260

aaagaaaaaa agacaagtga aagtgggaaa gtacgttttt ttctacttta tggatttgtt 1320

gggacaaaaa aaaaaaggtt cacggacttg tcaaacgtga gatcaatttg gaacttacaa 1380

tataaacgaa cattttggtg aatatatata tgaattgaag ccttaagcca aaagagatag 1440

aacaatgtat gcatctaatt aaacagaaac aagagcatct atgtagtcaa atgatctata 1500

aatgtgtgca tatatacctg aataaggatc atagttggag ctatggagcg agttaaatga 1560

gcttgactcc ggccatggcg gtggcataaa agcaactctc acgttttcta agtttcttgt 1620

cgttgtccat tccat 1635

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tcactagacc tcctcgtgca g 41

<210> 3

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cactagacct cctcgtgcag 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> insμlin translated codon optimized DNA

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 5

<211>43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat ttacactaga cctcctcgtg caa 43

<210> 6

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacactagac ctcctcgtgc aa 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210>8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctcaggcaa gagtacgaag ttgtt 25

<210>9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210>10

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat 20

Claims (9)

1.一种竞争性等位基因特异性PCR引物组，其特征在于：所述引物组由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1的具体序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 2所示；

其中，特异性部分为：

5’-CACTAGACCTCCTCGTGCAG，如SEQ ID NO. 3所示；

5’端第一接头序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 4所示；

所述引物2的具体序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 5所示；

其中，特异性部分为：

5’-TACACTAGACCTCCTCGTGCAA，如SEQ ID NO. 6所示；

5’端第二接头序列为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，如SEQ ID NO. 7所示；

所述引物3的具体序列为：

5’-GCTCAGGCAAGAGTACGAAGTTGTT，如SEQ ID NO. 8所示。

2.一种竞争性等位基因特异性PCR引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合由如权利要求1所述的引物组、F探针和H探针组成；

所述F探针的序列为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，如SEQ ID NO. 9所示；

所述F探针的5’端带有第一荧光基团；

所述H探针的序列为：

5’ - GAAGGTCGGAGTCAACGGAT，如SEQ ID NO. 10所示；

所述H探针的5’端带有第二荧光基团。

3.如权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述第一荧光基团为FAM荧光基团。

4.如权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述第二荧光基团为HEX荧光基团。

5.一种检测芸薹种蔬菜SNP分子标记的方法，所述方法为：

对芸薹种蔬菜Bra009510 基因进行竞争性等位基因特异性PCR检测；

其中，所述Bra009510 基因的模板链序列如SEQ ID NO.1所示；所述方法是使用如权利要求1所述的引物组进行的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述竞争性等位基因特异性PCR检测的步骤包括：

S1：提取芸薹种蔬菜模板DNA；

S2：加样品：在微孔板中加入待测 DNA 模板，55-65°C 烘干；

S3：加液：向每个反应孔中加入Master mix；

S4：加引物探针组合：向每个反应孔中加入引物预混液、F探针和H探针，

其中引物预混液为权利要求1中所述引物1、引物2和引物3的混合液；

S5：封膜；

S6：扩增反应；和

S7：荧光信号分型。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物预混液中，引物1、引物2和引物3的摩尔浓度比为2:2:5。

8.一种试剂盒，所述试剂盒中含有如权利要求1所述的PCR引物组或如权利要求2-4任一项所述的引物探针组合。

9.如权利要求1所述的引物组、如权利要求2-4任一项所述的引物探针组合、如权利要求5-7任一项所述的方法或如权利要求8所述的试剂盒在如下A-D任一种中的应用：

A、在鉴别或辅助鉴别芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用；

B、在选育叶缘裂刻芸薹种蔬菜品种中的应用；

C、在芸薹种蔬菜叶缘形状育种中的应用；

D、预测芸薹种蔬菜叶缘形状中的应用。

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