CN108118100B

CN108118100B - 一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN108118100B
Application number: CN201810108752.8A
Authority: CN
Inventors: 汪维红; 张凤兰; 于拴仓; 苏同兵; 温常龙; 余阳俊; 张德双; 赵岫云; 李佩荣
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108118100A

Abstract

本发明公开了一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP位点为白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第300位核苷酸，为T/G多态。本发明通过白菜F₂群体的QTL定位，获得了1个与白菜低温黄化紧密连锁的主效QTL，进一步在此区间发开出1个与白菜低温黄化紧密连锁的SNP标记，通过对F₂群体1881个单株验证发现标记的准确率能达到95.9％，该标记完全可用于白菜耐低温分子标记辅助育种。本发明获得的分子标记在实际应用中成本低、通量高、特异性高，为加速白菜耐低温育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

Description

一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的SNP分子标记及其应用。

背景技术

叶绿素是光合作用过程中最主要的色素之一，对植物的生长发育具有重要作用，但是游离叶绿素及其前体会对植物细胞造成光氧化伤害，因此植物在漫长的进化过程中形成了一系列复杂的机制来精确调控叶绿素的生物合成，使其能够适应不断变化的生理生化状态以及外界环境，从而产生白化、黄化、常绿、深绿、淡绿、斑马和条纹等不同类型的叶色突变体。白化是最常见的叶色突变之一，其产生的机制涉及到很多调控代谢途径，并受到自身基因和外部环境的共同作用，目前已报道的白化突变体多是由叶绿素合成受阻所引起。在众多白化突变体中，有一些白化现象与温度密切相关。安吉白茶的嫩芽在低于15℃时，叶绿素合成受阻而发生白化，一旦温度上升至20℃以上，白化嫩芽就会重新变回绿色。低温诱导的白化突变体在水稻中也普遍存在，通过遗传连锁分析定位并克隆了一个位于9号染色体上的PPR基因和位于11号染色体短臂上40.3kb区域内的lta1基因。

在十字花科作物中，关于低温诱导叶色突变体的研究鲜有报道。利用与目标性状连锁的分子标记进行标记辅助选择是在遗传育种中十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境影响等优点，可以在幼苗期进行选择，加快育种进程。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，SNP在基因组上的分布极其丰富；SNP突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。

基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。该方案的核心是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的SNP分子标记及其应用。

本发明首先提供检测大白菜基因组中A05-13595848T/G位点的多态性或基因型的物质在(1)-(5)任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

(2)筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

(3)制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

(4)制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

(5)大白菜育种。

所述检测大白菜基因组中A05-13595848T/G点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列1所示的单链DNA分子；

a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下b1)或b2)：

b1)序列2所示的单链DNA分子；

b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物3为如下c1)或c2)：

c1)序列3所示的单链DNA分子；

c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

本发明还保护A05-13595848T/G位点在如下(1)-(5)任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

(2)筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

(3)制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

(4)制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

(5)大白菜育种。

本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否耐低温的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型，若所述待测大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型为GG或TG，则所述待测大白菜耐低温；若所述待鉴别大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型为TT，则所述待待测大白菜不耐低温。

所述检测待鉴别大白菜基因组A05-13595848T/G位点基因型的方法为如下(1)或(2)：

(1)测序；

(2)用所述由引物1、引物2和引物3所组成的引物组对待测大白菜进行等位基因特异性PCR。

所述引物组在等位基因特异性PCR的反应体系中的浓度均为10μM。

本发明还保护以上任一所述方法在大白菜育种中的应用。

大白菜的育种方法，为方法甲或方法乙。

所述方法甲包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型，选择基因组A05-13595848T/G位点的基因型为GG或TG的待测大白菜作为亲本进行育种；

所述方法乙包括如下步骤：采用以上任一所述方法筛选出耐低温的大白菜作为亲本进行育种。

本发明还保护所述由引物1、引物2和引物3所组成的引物组。

本发明还保护所述引物组的应用，为如下(1)-(5)中的任一种：

(1)鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

(2)筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

(3)制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

(4)制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

(5)大白菜育种。

本发明还保护含有所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的用途为如下(1)-(5)中的任一种：

(1)鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

(2)筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

(3)制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

(4)制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

(5)大白菜育种。

以上任一所述耐低温大白菜具体可为满足如下描述的大白菜：将所述大白菜种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，真叶颜色为绿色。

以上任一所述不耐低温大白菜具体可为满足如下描述的大白菜：将所述大白菜种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，真叶颜色为黄色。

以上任一所述待测大白菜可为大白菜“ST64”、大白菜“ST336”或表1中任一所述的大白菜。

以上任一所述A05-13595848T/G位点为白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第300位核苷酸，A05-13595848T/G位点为T/G多态。

实验证明，利用本发明所提供的分子标记(SNP位点)A05-13595848T/G位点及其所对应的引物在低温诱导后的选择准确率为95.9％。由此表明，本发明所提供的分子标记(SNP位点)A05-13595848T/G位点及其所对应的引物将有助于耐低温大白菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为大白菜耐低温性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

本发明通过白菜F₂群体的QTL定位，在A05染色体上获得了1个与白菜低温黄化紧密连锁的主效QTL，进一步在此区间发开出1个与白菜低温黄化紧密连锁的SNP标记，通过对F₂群体1881个单株验证发现标记的准确率能达到95.9％，该标记完全可用于白菜耐低温分子标记辅助育种。本发明获得的分子标记在实际应用中成本低、通量高、特异性高，为加速白菜耐低温育种提供了高效的辅助育种方法和技术。

附图说明

图1为A05-13595848T/G位点在待测白菜材料中的基因分型鉴定的部分(96份)结果图。

图2为大白菜“ST64”和大白菜“ST336”低温抗性检测表型观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的实施例中检测待测植株是否耐低温(即低温处理后是否黄化)的方法为：将待测植株的种子播种于日光温室(大棚)中，控制白天温度4℃-15℃、夜间温度-2℃-4℃，当幼苗长至2片真叶期时调查真叶颜色，如果真叶颜色为黄色，待测植株不耐低温(低温黄化)，如果真叶颜色为绿色，待测植株耐低温(低温不黄化)。

大白菜“ST64”：参考文献：余阳俊，张凤兰，张德双，赵岫云，于拴仓，徐家炳，汪维红.小株型大白菜新品种京春娃2号的选育.中国蔬菜2011(16)：95-97；公众可以从北京市农林科学院获得；大白菜“ST64”在参考文献中的名称为06177；大白菜“ST64”经检测为耐低温(低温不黄化)材料(结果见图2A，低温处理后真叶颜色为绿色)。

大白菜“ST336”：参考文献：陈娟.白菜黄萎病抗性分子鉴定技术的研究[D].南京农业大学，2014.；公众可以从北京市农林科学院获得；大白菜“ST336”在参考文献中的名称为V2-2。大白菜“ST336”经检测为不耐低温(低温黄化)材料(结果见图2B，低温处理后真叶颜色为黄色)。

实施例1、SNP分子标记的开发

对耐低温大白菜材料(ST64)和不耐低温大白菜材料(ST336)进行重测序，经过数据分析，发现A05染色体第13595848位的核苷酸有一个SNP位点(序列表序列4中第300位核苷酸)，为T/G多态，将该SNP位点命名为A05-13595848T/G位点。

针对A05-13595848T/G位点，基于竞争性等位基因特异性PCR原理，设计引物如下：

上游引物A05-13595848T/G-FF(序列表的序列1)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAGGGGTTGTTGGGACGg-3’；

上游引物A05-13595848T/G-FV(序列表的序列2)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGAGGGGTTGTTGGGACGt-3’：

下游引物A05-13595848T/G-R(序列表的序列3)：5’-CACTCATCGCCGTCCACGCGTA-3’。

上述上游引物最后一位核苷酸t/g对应A05染色体上第13595848T/G位的SNP位点，即序列表序列4中第300位核苷酸。

实施例2、A05-13595848T/G位点在鉴定大白菜低温诱导后叶片黄化和不黄化材料中的应用

1、DNA提取

常规CTAB法分别提取表1中1881种待测白菜材料的基因组DNA。

1881份材料为亲本ST64与ST336的杂交后代F₂的各单株，具体方法如下：将低温不黄化亲本ST64和低温黄化亲本材料ST336杂交获得F₁；F₁继续自交获得F₂群体。

琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。

2、基于竞争性等位基因特异性PCR

按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASP反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001，Roche)中进行，反应体系为3μl或1μl。

具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μl)1.5μl，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1μl Master mix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比6∶6：15混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)-61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)-55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。

部分结果如图1所示，结果显示分型效果良好，A05-13595848T/G位点的引物组(A05-13595848T/G-FF、A05-13595848T/G-FV和A05-13595848T/G-R)能够特异区分该位点为纯合GG、纯合TT或杂合T/G的材料。

表1中1881种待测白菜材料的基因型检测结果见表1。

3、低温诱导后黄化情况检测

检测表1中1881种待测白菜材料是否耐低温(即低温处理后是否黄化)。结果见表1

综合表1中的结果，可得到如下结论：若待测白菜A05-13595848T/G位点的核苷酸为TT纯合，则待测白菜不耐低温(低温诱导后叶片黄化)；若待测白菜A05-13595848T/G位点的核苷酸为GG纯合或T/G杂合，则待测白菜耐低温(低温诱导后叶片不黄化)。

在1398份表型为低温诱导后叶片不黄化的材料中，分子标记鉴定A05-13595848T/G位点为GG纯合的材料有506份，杂合T/G位点的有857份，鉴定准确率为97.5％。在483份表型为低温诱导后叶片黄化的材料中，A05-13595848T/G位点为TT纯合的材料有440份，鉴定准确率为91.1％。本发明方法的平均鉴定准确度为95.9％。

表1为1881份F₂群体材料在A05-13595848T/G位点的基因分型及表型统计表

上述结果表明，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜低温诱导后叶片是否黄化。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴定控制白菜叶片低温黄化性状形成的SNP分子标记及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tggaggggtt gttgggacgg 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgggaggggt tgttgggacg t 41

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

cactcatcgc cgtccacgcg ta 22

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (300)..(300)

<223> r is t or g

<400> 4

tcatgacaac taagcacaaa ggaatgccta gtggttcggg tttgcctgaa gtagaactgc 60

tccttgattg cgtagatagc aagcccaatt tgacaatcct gctttgttgc atacagtttc 120

cccacgaatg gttcctcgcc gctatcctcc caattcaagt caggaacatc ctcagtttcg 180

taggaaagat cgtcaaagag tggtgggacg tcgaattcct catcactaat ctctgagagt 240

ggcctggtct cgcgcagcgg gggagtcgaa ggtgggactt gggaggggtt gttgggacgr 300

cctggtggtg tacgcgtgga cggcgatgag tgtacatgtg gagtagtgga tttgtgtaca 360

ccaacgggag tgaaagtaga ttgtccatgt ggattttgcg ggggttgttc tccggcagaa 420

ggtgtagcgg tctgtccata tggatacctt cggtgctgtg agggaactga ttgaggcgtg 480

cgggtgtcca taggattagg gtatacatgg gggaaactgt gatggtgtga ggtaggatct 540

tcaggatcag gcttctggtt ggttggctgc tctgcaggtg atgtttcagt gtggatactg 600

Claims

1.检测大白菜基因组中A05-13595848T/G位点的多态性或基因型的物质在（1）-（5）任一中的应用：

（1）鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

（2）筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

（3）制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

（4）制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

（5）大白菜育种；

所述A05-13595848T/G位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第300位核苷酸，A05-13595848T/G位点为T/G多态；

所述检测大白菜基因组中A05-13595848T/G点的多态性或基因型的物质为由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

2.A05-13595848T/G位点在如下（1）-（5）任一中的应用：

（1）鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

（2）筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

（3）制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

（4）制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

（5）大白菜育种；

所述A05-13595848T/G位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第300位核苷酸，A05-13595848T/G位点为T/G多态。

3.一种鉴别或辅助鉴别待测大白菜是否耐低温的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型，若所述待测大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型为GG或TG，则所述待测大白菜耐低温；若所述待鉴别大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型为TT，则所述待测大白菜不耐低温；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴别大白菜基因组A05-13595848T/G位点的基因型的方法为如下（1）或（2）：

（1）测序；

（2）用引物组对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；

所述引物组由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

5.权利要求3或4所述的方法在大白菜育种中的应用。

6.大白菜的育种方法，为方法甲或方法乙；

所述方法乙包括如下步骤：采用权利要求3或4所述的方法筛选出耐低温的大白菜作为亲本进行育种。

7.引物组，由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。

8.权利要求7所述的引物组的应用，为如下（1）-（5）中的任一种：

（1）鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

（2）筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

（3）制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

（4）制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

（5）大白菜育种。

9.含有权利要求7所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的用途为如下（1）-（5）中的任一种：

（1）鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性；

（2）筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种；

（3）制备鉴定或辅助鉴定大白菜低温抗性的产品；

（4）制备筛选或辅助筛选耐低温大白菜品种的产品；

（5）大白菜育种。