CN108998556B - 一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的SNP分子标记及其应用。本发明公开的SNP位点为BVRC_BrS2G/A位点，其位于大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第818位核苷酸，该位点为G/A多态。利用本发明所提供的BVRC_BrS2G/A位点及其所对应的引物鉴定大白菜杂交结实率的准确率达85.7％以上。由此表明，本发明所提供的BVRC_BrS2G/A位点及其所对应的引物将有助于杂交结实率高的大白菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为大白菜杂交亲和性性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。

Description

一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的SNP分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及植物分子育种技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的SNP分子标记及其应用。
背景技术
自交不亲和性广泛存在于高等植物中，包括70多个科和250多个属。自交不亲和是植物防止近亲繁殖和保持遗传多样性的一种重要的遗传机制，并且已成功应用到甘蓝、菜花、大白菜、小白菜、萝卜等十字花科作物的杂交育种中。芸薹属植物属于典型的孢子体自交不亲和，遗传上由一个具有复等位基因的高度多态性的S位点控制。到目前为止，芸薹属中约有100多个S单元型已经被鉴定，这些S单元型包含与花粉、柱头识别反应相关的3类基因：S位点糖蛋白基因(SLG)、S位点受体激酶基因(SRK)、S位点富半胱氨酸蛋白基因(SCR)和S位点蛋白11基因(SP11)。SLG基因和SRK基因在雌蕊柱头中表达，SP11基因在雄蕊花药中表达。花药中的SP11蛋白与柱头中的SRK蛋白、SLG蛋白发生相互作用，引发不亲和反应的发生。
大白菜作为异花授粉作物，具有明显的杂种优势，其杂种优势的利用主要通过自交不亲和系或雄性不育系配制杂交种来实现。但在实际育种过程中，两个优良自交系(雄性不育系与自交系)在配制杂交种过程中往往会出现杂交结实率低的现象，其主要原因是育种材料同质化愈加严重、血缘基础狭窄等问题造成两个大白菜自交系带有相同的S基因，最终导致不亲和反应的发生。因此，因杂交不亲和而导致大白菜杂交结实率低已严重阻碍了大白菜种子的生产，生产上急需提高大白菜杂交结实率的新方法。
传统的自交(杂交)不亲和的鉴定方法是在田间进行花期人工自交或杂交，然后通过调查授粉花数和结籽数来测定自交或杂交亲和性，这种方法不仅费时费力、效率低下、受时间限制，而且结果还易受环境影响。随着分了生物学、生物信息学的发展，对大白菜S基因研究工作也在不断深入，主要集中在S单元型中SLG、SRK、SP11基因序列的多样性分析，S单元型的基因序列也在陆续公布。SNP作为新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点，利用上述序列的多态性开发用于检测大白菜杂交结实率的SNP标记已成为可能。基于KASP的SNPline基因分型检测是英国LGC有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的SNP分子标记及其应用。
本发明首先保护检测大白菜基因组中BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测大白菜基因组中BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的物质在如下(1)-(6)任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
上述应用中，所述检测大白菜基因组中BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子；
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子；
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子；
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
本发明还保护BVRC_BrS2G/A位点在如下(1)-(6)任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜与父本之间杂交结实率的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测大白菜与父本之间杂交结实率的方法包括如下步骤：检测待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型，若所述待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GA或AA且父本BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG，则所述待测大白菜与父本的杂交结实率高；若所述待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG且父本BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG，则所述待测大白菜与父本的杂交结实率低。
上述方法中，所述检测待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：
(1)测序；
(2)用所述由引物1、引物2和引物3所组成的引物组对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；
上述方法中，所述待测大白菜为大白菜BC1F1群体的各单株或F1杂交种群体的各单株。所述父本为04GX-3或XIN3-AC。
所述大白菜BC1F1群体为由CMS 04GX-3(母本)与04GX-3(父本)杂交后代的各单株组成的群体。所述F1杂交种群体为由CMS 04GX-3(母本)与XIN3-AC(父本)杂交后代的各单株组成的群体。
本发明还保护一种大白菜育种的方法。
所述大白菜育种的方法为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：选择BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型为GA或AA的大白菜作为母本，选择BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型为GG的大白菜作为父本进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：采用以上任一所述方法筛选出杂交结实率高的大白菜作为亲本进行育种。
本发明还保护所述由引物1、引物2和引物3所组成的引物组。
所述引物组在如下(1)-(6)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
本发明最后保护含有所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的用途为如下(1)-(6)中任一种：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
上述应用或方法中，杂交结实率低是指单株种子量小于10克；杂交结实率高是指单株种子量大于等于10克。杂交结实率低的大白菜品种是指单株种子量小于10克的大白菜品种；杂交结实率高的大白菜品种是指单株种子量大于等于10克的大白菜品种。
以上任一所述BVRC_BrS2G/A位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第818位核苷酸，BVRC_BrS2G/A位点为G/A多态。
实验证明，本发明提供的BVRC_BrS2G/A位点及其所对应的引物鉴定大白菜杂交结实率的准确率达85.7％以上。由此表明，本发明所提供的BVRC_BrS2G/A位点及其所对应的引物将有助于杂交结实率高的大白菜种质资源的筛选，可用于分子标记辅助选择育种，为大白菜杂交亲和性性状的遗传改良提供材料储备和技术支持。
附图说明
图1为BVRC_BrS2G/A位点在BC1F1群体中的基因分型鉴定图。其中，红色圆点代表纯合GG基因型；绿色圆点代表杂合GA基因型。
图2为BVRC_BrS2G/A位点在F1杂交种群体中的基因分型鉴定图。其中，红色圆点代表纯合GG基因型；绿色圆点代表杂合GA基因型。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大白菜“04GX-3”：参考文献：Tongbing Su,Shuancang Yu,Zhenping Gong,Fenglan Zhang,Yangjun Yu,Deshuang Zhang,Xiuyun Zhao,Weihong Wang.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage.Journal of Plant Pathology:1-9，在文献中的名称为0XINH。公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“XIN3-AC”：参考文献：Tongbing Su,Shuancang Yu,Zhenping Gong,Fenglan Zhang，Yangjun Yu，Deshuang Zhang，Xiuyun Zhao，Weihong Wang.Evaluatingmultiple resistance to major diseases in a core set of inbred lines ofBrassica rapa at seedling stage.Journal of Plant Pathology:1-9，在文献中的名称为XINCAC。公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“CMS 04GX-3”是由大白菜“CMS96”(张德双,张凤兰,徐家炳,等.大白菜CMS96不育系和保持系电镜观察[J].华北农学报,2012,27(2):133-139.)与大白菜“04GX-3”经过连续7代回交而获得，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、SNP分子标记的开发
分别在杂交结实率高的大白菜材料CMS 04GX-3(SC)和杂交结实率低的大白菜材料CMS 04GX-3(SI)中扩增SRK基因序列，经过数据分析，在序列表的序列4中第818位的核苷酸有一个SNP位点，为G/A多态，将该SNP位点命名为BVRC_BrS2G/A位点。针对BVRC_BrS2G/A位点，设计引物如下：
上游引物BVRC_BrS2_A1：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAACCAGGTAACATTTTGCTTGATAAATAT-3'(序列表的序列1)；
上游引物BVRC_BrS2_A2：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACCAGGTAACATTTTGCTTGATAAATAC-3'(序列表的序列2)；
下游引物BVRC_BrS2_C：5'-CCCAAAATCCGAGATCTTTGGGATCAT-3'(序列表的序列3)。
上述上游引物最后一位碱基T/C对应序列表的序列4中第818位反向互补核苷酸。
实施例2、BVRC_BrS2G/A位点在BC1F1群体中辅助鉴定大白菜杂交结实率中的应用
1、DNA提取
常规CTAB法分别提取表1中85份待测白菜材料的基因组DNA。85份待测白菜材料中，8份为保持系04GX-3，77份为BC1F1群体。
77份BC1F1群体材料为CMS 04GX-3与04GX-3的杂交后代的各单株，具体获得方法如下：
2017年以大白菜细胞质雄性不育系CMS 04GX-3为母本，以保持系04GX-3为父本，按父母本比例1:2的比例定植于小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得F1。如果单株种子量小于10克，定义为杂交结实率低；如果单株种子量大于等于10克，定义为杂交结实率高。最终在40株F1中获得1株种子量为19.54克的单株，其余单株种子量均小于5克。
2018年以2017年获得的杂交亲和的大白菜细胞质雄性不育系F1(种子量为19.54克的F1单株)为母本，以保持系04GX-3为父本，按父母本比例1:2的比例定植于小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得BC1F1群体。
琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μL备用，得到待测DNA。
2、基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASP反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001，Roche)中进行，反应体系为3μL或1μL。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μL)1.5μL，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1μL Master mix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比6:6:15混合)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
结果如图1所示，结果显示分型效果良好，BVRC_BrS2G/A位点的引物组(BVRC_BrS2_A1、BVRC_BrS2_A2和BVRC_BrS2_C)能够特异区分BVRC_BrS2G/A位点为纯合GG基因型或杂合GA基因型的材料。
3、杂交结实情况检测
将上述BC1F1群体种子成熟后分别按单株收种子，如果单株种子量小于10克，就表明杂交结实率低；如果单株种子量大于等于10克，就表明杂交结实率高。
结果表明：8株保持系(父本)全部表现为自交结实率低，在77株BC1F1群体中，42株表现为杂交结实率高，35株表现为杂交结实率低。
若待测大白菜BVRC_BrS2位点的基因型为杂合GA基因型或纯合AA基因型(BVRC_BrS2位点的核苷酸为G和A或BVRC_BrS2位点的核苷酸均为A)且父本(保持系)BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型(BVRC_BrS2位点的核苷酸均为G)，则待测大白菜与父本(保持系)杂交结实率高；若待测白菜BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型且父本(保持系)BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型，则待测大白菜与父本(保持系)杂交结实率低。
结果如表1所示，8株保持系(父本)分子标记鉴定BVRC_BrS2位点的基因型均为纯合GG基因型。在42株表型为杂交结实率高的BC1F1材料中，分子标记鉴定BVRC_BrS2位点为杂合GA基因型的材料有32株，未检测到纯合AA基因型，鉴定准确率为76.2％(32/42)。在35株表型为杂交结实率低的BC1F1材料中，分子标记鉴定BVRC_BrS2位点为纯合GG基因型的材料有34株，鉴定准确率为97.1％。本发明方法的平均鉴定准确度为85.7％。
表1为BVRC_BrS2G/A位点在BC1F1群体的基因分型及表型统计表
Figure BDA0001781619330000071
Figure BDA0001781619330000081
注：标*为保持系(父本)，高为杂交结实率高，低为杂交结实率低。
实施例3、BVRC_BrS2G/A位点在F1杂交种中辅助鉴定大白菜杂交结实率中的应用
1、DNA提取
常规CTAB法分别提取表2中47份待测白菜材料的基因组DNA。47份待测白菜材料中，4份杂交结实率高的F1单株、4份杂交结实率低的F1单株、4份XIN3-AC、35份F1杂交种单株。
上述材料具体获得方法如下：2017年以大白菜细胞质雄性不育系CMS 04GX-3为母本，以保持系04GX-3为父本，按父母本比例1:2的比例定植于小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，同时每天上午9点用3％的盐水喷雾一次，直至花期结束种子成熟后分别按单株收种子获得F1。如果单株种子量小于10克，定义为杂交结实率低；如果单株种子量大于等于10克，定义为杂交结实率高。最终在40株F1中获得1株种子量为19.54的单株，其余单株种子量均小于5克。
2018年以2017年获得的后代作为母本，以XIN3-AC为父本，按父母本比例1:2的比例定植于同一小棚中，开花后放入蜜蜂授粉，种子成熟后分别按单株收种子获得F1杂交种群体。
琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4-10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μL备用，得到待测DNA。
2、基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASP反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001，Roche)中进行，反应体系为3μL或1μL。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μL)1.5μL，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1μL Master mix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比6:6:15混合)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
结果如图2所示，结果显示分型效果良好，BVRC_BrS2G/A位点的引物组(BVRC_BrS2_A1、BVRC_BrS2_A2和BVRC_BrS2_C)能够特异区分BVRC_BrS2G/A位点为纯合GG基因型或杂合GA基因型的材料。
3、杂交结实情况检测
将上述F1杂交种种子成熟后分别按单株收种子，统计杂交结实情况。
结果表明：4株父本全部表现为自交结实率低，在35株F1群体中，13株表现为杂交结实率高，22株表现为杂交结实率低。
若待测大白菜BVRC_BrS2位点的基因型为杂合GA基因型或纯合AA基因型(BVRC_BrS2位点的核苷酸为G和A或BVRC_BrS2位点的核苷酸均为A)且父本(保持系)BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型(BVRC_BrS2位点的核苷酸均为G)，则待测大白菜与父本(保持系)杂交结实率高；若待测白菜BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型且父本(保持系)BVRC_BrS2位点的基因型为纯合GG基因型，则待测大白菜与父本(保持系)杂交结实率低。
结果如表2所示，4株父本分子标记鉴定BVRC_BrS2位点全部为纯合GG基因型。在13株表型为杂交结实率高的F1杂交种中，分子标记鉴定BVRC_BrS2位点全部为杂合GA基因型，未检测到纯合AA基因型；在22株表型为杂交结实率低的F1杂交种中，分子标记鉴定BVRC_BrS2位点全部为纯合GG基因型。本发明方法在35株杂交种中的鉴定准确率为100％。
表2为BVRC_BrS2G/A位点在F1杂交种中的基因分型及表型统计表
Figure BDA0001781619330000101
Figure BDA0001781619330000111
注：高为杂交结实率高，低为杂交结实率低。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>一种鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率的SNP分子标记及其应用
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gaaggtgacc aagttcatgc tgaaaccagg taacattttg cttgataaat at 52
<210>2
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
gaaggtcgga gtcaacggat taaaccaggt aacattttgc ttgataaata c 51
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
cccaaaatcc gagatctttg ggatcat 27
<210>4
<211>940
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
gctttcatat taccgggcat cgatgactga gcaggtgtac ttgttcaccg tccaggattc 60
atcgtcgtcg aattgcctac ttgaggaagg attatttgca taataacttg ctatgagaca 120
ataaactggc ggtttaggct gaggaatctc tgttgcttca cttccaagca tccaaaccac 180
cgacgacatc gttggtctgt gctccgcacg ttcttgaata cacaatagac caatttgtat 240
gcattttagg acttcttttg gtttaaatgt tgatggcaga gatgacaatg aatctacgat 300
gactggatct acgatttcta gcgctcttcc ctccgcccaa tgagtccatg cctgtttata 360
aaaataaaag catttaaatt gttttagcgt tgttcaaaat ataagtgttt tagcaatctc 420
gagagtgccg ttcaaaaaaa aaagaagcaa tctcgagagt agatagaata ttattggttc 480
ttatcttaaa cttacatagc ttggaagatt gttttcaggg ttcacctggt agaatcctct 540
attccttttt ccactaacaa tttcaagaac tatgactcca aaactgaaaa catctgtttt 600
ttccgagatt accccatcca ttgcgtactc cggagacatg tagccgctga gtagcaaaaa 660
aaatgaactt agaggtcatg agttctatag agttatgggt aagaaaatat cttcaaagac 720
gtgcttacta agttccgacc gcattgtctg tcctagcttg agtttcgtcc cttgcaaaga 780
ttctggccat cccaaaatcc gagatctttg ggatcatgta tttatcaagc aaaatgttac 840
ctggtttcaa atccctgtgg attatcctaa accgtgagtc ttgatgaaga tataaaagcc 900
ctcgagcaac accatttgta atgtcgaatc tctccttcca 940

Claims (9)

1.检测大白菜基因组中BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的物质在如下(1)-(6)任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品；
所述BVRC_BrS2G/A位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第818位核苷酸，BVRC_BrS2G/A位点为G/A多态；
所述检测大白菜基因组中BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
2.BVRC_BrS2G/A位点在如下(1)-(6)任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品；
所述BVRC_BrS2G/A位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第818位核苷酸，BVRC_BrS2G/A位点为G/A多态。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测大白菜与父本之间杂交结实率的方法，包括如下步骤：检测待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型，若所述待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GA或AA且父本BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG，则所述待测大白菜与父本的杂交结实率高；若所述待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG且父本BVRC_BrS2G/A位点的基因型为GG，则所述待测大白菜与父本的杂交结实率低；
所述BVRC_BrS2G/A位点为大白菜基因组中的序列表中序列4自5’端第818位核苷酸，BVRC_BrS2G/A位点为G/A多态。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待测大白菜BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：
(1)测序；
(2)用引物组对待测大白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物组由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
5.权利要求3或4所述的方法在大白菜育种中的应用。
6.大白菜的育种方法，为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：选择BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型为GA或AA的大白菜作为母本，选择BVRC_BrS2G/A位点的多态性或基因型为GG的大白菜作为父本进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：采用权利要求4或5所述的方法筛选出杂交结实率高的大白菜作为亲本进行育种。
7.引物组，由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
8.权利要求7所述的引物组在如下(1)-(6)中任一中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
9.含有权利要求7所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的用途为如下(1)-(6)中任一种：
(1)鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率；
(2)筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种；
(3)大白菜育种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定大白菜杂交结实率高的产品；
(5)制备筛选或辅助筛选杂交结实率高的大白菜品种的产品；
(6)制备大白菜育种的产品。
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CN109680090A (zh) * 2018-12-21 2019-04-26 中国计量大学 一种鉴定茭白表型特征的分子标记及其应用、获取方法
CN113862391B (zh) * 2021-11-02 2022-06-07 北京市农林科学院 与白菜隐性核不育性状紧密连锁的snp分子标记及其应用

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WO2014076249A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Reverse synthesis of breeding lines
KR101724372B1 (ko) * 2016-01-29 2017-04-07 한국생명공학연구원 프로고이트린 저함량 양배추 선별용 snp 마커 및 이의 용도
CN105506163B (zh) * 2016-02-02 2019-01-22 北京市农林科学院 一种鉴定控制白菜紫色性状形成的snp分子标记及其应用
CN105525024B (zh) * 2016-02-16 2019-01-22 北京市农林科学院 一种鉴别大白菜根肿病4号生理小种抗性的特异snp分子标记及应用
CN105794509A (zh) * 2016-03-15 2016-07-27 河南科技学院 一种提高温敏核不育小麦bns结实率的snp化学调控方法

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