CN116926229A - 一种与油菜种子高维生素E主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜种子维生素E含量主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记及应用。本发明首次获得了控制油菜维生素E含量高的稳定QTL位点qVE.C02，并检查到与该位点紧密连锁的位于已公开发表的甘蓝型油菜Darmor‑bzh v10基因组第C02染色体上第15003505位碱基的SNP标记，可解释14.7％的表型变异。根据该变异位点设计的KASP分子标记VEC02J，利用该标记可鉴定油菜维生素E含量主效QTL位点qVE.C02的优异等位变异，快速准确筛选出维生素E含量较高的优良单株，提高油菜高维生素E含量育种材料筛选的效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜种子高维生素E主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
维生素E作为一种脂溶性维生素在一些作物富含油脂的种子里大量富集，油菜作为主要的油用作物，其油脂营养成分健康，根据前期研究表明油菜自然遗传群体中籽粒维生素E含量变异丰富，其主要生育酚构成为α-、γ-，以及少量δ-，生育酚构成和α-TE占比合理，油菜籽粒加工制备成食用菜籽油后，每100克菜籽油中维生素E含量较菜籽更高，具备开发富含维生素E的健康食品的良好潜力，油菜产业多功能发展也是新时代新形势社会发展需求下的大势所趋，因此，充分挖掘油菜籽粒维生素E含量高及α-生育酚占比较大的优势，改良和选育出一批维生素E含量高，且α-生育酚占比合理的油菜新品种，是为人民提供日常维生素E充分摄入保障的一个高效经济途径。
传统的育种手段育种年限过长、目标性状易丢失、优良性状难聚合、选择效率低，难以满足当前作物育种需求。随着分子生物学和测序技术的快速发展，通过分子标记辅助育种加速选择进程已成品种选育中广泛应用的技术手段。利用分子标记辅助选择检测油菜中与高维生素E性状紧密关联的分子标记，可以克服维生素E含量表型鉴定中的困难，指导性状的精准导入或聚合，将极大提高育种效率。目前，油菜中与维生素E含量主效位点紧密连锁的分子标记被开发的报道较少，相关育种工作仍以传统的大规模的表型鉴定筛选为主。
本发明通过对油菜籽粒维生素E含量的全基因组关联分析，旨在找到对油菜高维生素E含量具有改良效应的主效QTL位点，并基于此开发实用的分子标记，用于油菜高维生素E含量的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种与油菜种子高维生素E含量主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记，该分子标记为SNP标记，位于已公开发表的甘蓝型油菜Darmor-bzhv10基因组第C02染色体上第15003505位碱基。
本发明的另一个目的在于提供了一种与油菜种子高维生素E含量主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记的应用，通过对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C02染色体上第15003505位碱基进行基因型的检测，即可实现对油菜种子高维生素E含量的筛选育种。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与油菜种子高维生素E含量紧密连锁的主效QTL位点qVE.C02的获得：
(1)收集327份(Ahmad et al.,2022)来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组(Rousseau-Gueutin et al.,2020)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)将327份材料分别于2019年和2020年种植于中国农业科学院油料所武汉阳逻试验基地，每份材料种植两行，每个试验点各设置3个重复，按照当地标准农业管理方法进行田间管理和施肥等。成熟期，对327份油菜株系相同序号选取长势一致或接近的7-8株材料，经自然晾干、脱粒(主花序)，将其种子混合磨碎，称取种子粉碎样0.03g-0.05g，用正己烷萃取过夜，通过超高效液相色谱仪对种子维生素E含量进行测定。
(5)结合2年共2个试验点的油菜种子维生素E含量数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在C02染色体上检测到与油菜种子维生素E含量显著关联的SNP标记seq-new-rs31838，可在多个环境下重复检测，最高可解释14.7％的表型变异，显著水平为2.95E-10，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组C02染色体的第15003505位碱基处，该SNP位点紧密连锁的种子高维生素E性状主效QTL位点被命名为qVE.C02。
用于检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C02染色体上第15003505位碱基的试剂在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用，属于本发明的保护范围。
检测包含有甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C02染色体上第15003505位碱基的油菜序列的试剂在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述应用中，优选的，所述的油菜序列为SEQ ID NO.2所示。
针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组C02染色体上第15003505位碱基设计的引物在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用，也属于本发明的保护范围。
以上所述的应用中，申请人根据上述SNP位点，开发了KASP标记VEC02J，根据该标记设计的引物为：
qVE.C02低维生素E含量等位基因型特异引物VEC02J-F1：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTA
qVE.C02高维生素E含量等位基因型特异引物VEC02J-F2：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTG
反向引物VEC02J-R：TCCACTTGGACAAAACTGTGAAC
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次获得了与油菜种子维生素E含量显著关联的主效QTL位点qVE.C02，最高可解释14.7％的表型变异，且在多个环境中均可重复检测，可有效应用于油菜种子的高维生素E含量遗传改良。
(2)首次研究发现了与油菜种子维生素E含量显著关联的分子标记VEC02J，为油菜高维生素E含量的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
(3)利用分子标记VEC02J可通过对油菜品种或品系中qVE.C02的优异等位变异进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快油菜种子高维生素E含量的育种进程。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。在本发明中，如未特殊说明，所述甘蓝型油菜基因组均以Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)为参照。
实施例1：
油菜种子高维生素E含量主效QTL位点qVE.C02的获得：
(1)收集327份(Ahmad et al.,2022)来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用武汉双绿源创芯科技研究院有限公司开发的油菜50K Illumina SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组(Chalhoub et al.,2014)中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得21,243个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。
(3)将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTURE v.2.3.4进行群体结构分析，将327份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算327份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(4)将327份材料分别于2019年和2020年种植于中国农业科学院油料所武汉阳逻试验基地，每份材料种植两行，每个试验点各设置3个重复，按照当地标准农业管理方法进行田间管理和施肥等。成熟期，对327份油菜株系相同序号选取长势一致或接近的7-8株材料，经自然晾干、脱粒(主花序)，将其混合磨碎，称取粉碎样0.03g-0.05g，用正己烷萃取过夜，通过超高效液相色谱仪对籽粒维生素E含量进行测定。
(5)结合2年共2个试验点的油菜籽粒维生素E含量数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析，在C02染色体上检测到与油菜维生素E含量显著关联的SNP标记seq-new-rs31838，可在多个环境下重复检测，最高可解释14.7％的表型变异，显著水平为2.95E-10，该SNP变异位点(由G到A的变异)位于甘蓝型油菜Darmor-bzh v10(Rousseau-Gueutin et al.,2020)基因组C02染色体的第15003505位碱基处，该SNP位点紧密连锁的高维生素E性状主效QTL位点被命名为qVE.C02。
实施例2：
一种与油菜种子高维生素E含量主效QTL位点qVE.C02紧密连锁的分子标记引物的获得：
提取甘蓝型油菜C02染色体第15003505位碱基上下游各100bp的序列，按照KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)分子标记引物设计原则，开发KASP分子标记VEC02J，该标记包括两条竞争性正向引物VEC02J-F1和VEC02J-F2，分别对应上述SNP变异位点的序列碱基A和G，以及一条反向通用引物VEC02J-R，引物序列如下：
SeC04J-F1：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTA
SeC04J-F2：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTG
SeC04J-R：TCCACTTGGACAAAACTGTGAACGTTCACAGTTTTGTCCAAGTGGA
上述引物，需根据KASP标记开发的原则，在使用前需加上KASP标记的通用接头。
其中VEC02J-F1前所加接头序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，VEC02J-F2前所加接头序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。
在甘蓝型油菜No2127中扩增的序列为A基因型(即AA基因型)，序列如下所示：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTATAAAAAAGGCTTAATATTTTACTTTAGTTTATCTTCTTTTTTTGTTCACAGTTTTGTCCAAGTGGA(SEQ ID NO.1所示)。
在甘蓝型油菜H028(油菜杂交种中油811的父本)中扩增的序列为B基因型(即GG基因型)，序列如下所示：
CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTGTAAAAAAGGCTTAATATTTTACTTTAGTTTATCTTCTTTTTTTGTTCACAGTTTTGTCCAAGTGGA(SEQ ID NO.2所示)。
(2)对标记采用竞争性等位基因特异性PCR技术在油菜关联群体中进行基因型分型，扩增使用试剂盒为五引物扩增受阻突变体系(PAMS)，按照PAMS pro SNP GentypingPCR mix试剂盒说明，设计10uL反应体系：2×PARMS master mix 5μL，Allele X primer(10μM)0.15μL，Allele Y primer(10μM)0.15μL，Common R primer(10μM)0.4μL，油菜基因组DNA 10-100ng。扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65-57℃(Touch-down)1min，循环10次；94℃20s，57℃1min，循环30次；采集1次荧光信号并输出基因型结果。再利用Tassel软件进行关联分析，明确VEC02J与油菜维生素E含量主效QTL位点qVE.C02显著关联。
实施例3：
基于油菜C02染色体第15003505位碱基设计的引物在油菜种子维生素E含量筛选育种中的应用，其步骤如下：
(1)挑选出327份材料中经过多代自交已纯合的种子维生素E含量较高和维生素E含量较低的材料各20份，以及No2127和H028材料，分别于2021年9月种植于中国农业科学院油料作物研究所武昌试验基地，2022年9月种植于中国农业科学院油料作物研究所阳逻试验基地，两行区，每个材料设置3个重复，在成熟期对上述材料籽粒进行取样，利用超高效液相色谱仪测定样本总维生素E含量。
(2)检查分子标记VEC02J的两种基因型在上述维生素E含量较高和维生素E含量较低的材料中分布情况结果表明，分子标记VEC02J的基因型在20份维生素E含量较高的材料中20份为B，而在20份维生素E含量较低的材料中14份为A，6份为B(表1)。
(3)T测验结果表明分子标记VEC02J检测出的A和B两类基因型在籽粒维生素E含量上存在极显著差异(P＝7.24E-08)。
以上的结果足以说明我们制备的分子标记VEC02J与油菜种子的维生素E含量是高度关联的，因而可用于油菜种子高维生素E含量的分子标记辅助选择。
表1：分子标记VEC02J在油菜籽粒维生素E含量极端材料中的基因型
Claims (5)
1. 用于检测甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C02染色体上第15003505位碱基的试剂在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用。
2. 检测包含有甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C02染色体上第15003505位碱基的油菜序列的试剂在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用。
3. 权利要求2所述的应用中的油菜序列为SEQ ID NO.2所示。
4. 针对甘蓝型油菜Darmor-bzh v10基因组第C02染色体上第15003505位碱基设计的引物在油菜种子高维生素E含量筛选育种中的应用。
5.权利要求4所述的应用中的引物为：VEC02J-F1：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTA、VEC02J-F2：CATCCATATTTTACTTTAGTTTTTCTTTTG和VEC02J-R：TCCACTTGGACAAAACTGTGAAC。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2023
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| CN117512196A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-02-06 | 江苏省农业科学院 | 一种与大豆维生素e含量显著相关的分子标记、kasp引物组合及应用 |
| CN117512196B (zh) * | 2023-12-13 | 2024-05-17 | 江苏省农业科学院 | 一种与大豆维生素e含量显著相关的分子标记、kasp引物组合及应用 |
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