CN117737296B - 用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的snp标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农作物分子生物学技术领域,尤其涉及一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记及应用。本发明所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记选自以下(a)和/或(b):(a)位于8号染色体上第132582645位,其脱氧核苷酸为T或C;(b)位于4号染色体上第60975963位,其脱氧核苷酸为G或A。本发明提供的SNP标记可高通量鉴定青早510玉米种子纯度,具有检测结果稳定、准确、快速、高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及农作物分子生物学技术领域,尤其涉及一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记及应用。
背景技术
种子是农业的基本生产资料,优良品种的增产潜力容易受到种子纯度的影响。作为世界第三大粮食作物,玉米种子商品化程度很高。市场上玉米种子品种混杂,品种繁多,易混淆。因此,建立快速高效、低成本、高通量的种子纯度鉴定方法极为重要;同时,也有助于提高种子质量监测、保障玉米育种和种植业的健康发展。
传统的品种鉴定主要以表型鉴定为主,存在周期长、工作量大、准确度不高、易受环境影响等问题。随着分子生物学技术的发展,以SNP为代表的分子标记具有不受环境影响、快速高效、共显性、通量高等优点。目前针对青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP研究较少,有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记及应用,具有检测结果稳定、准确、快速、高效的优点,可高通量鉴定青早510玉米种子纯度。
具体的,本发明的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记,所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记选自以下(a)和/或(b):(a)位于8号染色体上第132582645位,其脱氧核苷酸为T或C,编号ZmSNP01;(b)位于4号染色体上第60975963位,其脱氧核苷酸为G或A,编号ZmSNP02。
本发明基于青早510及其父本的重测序数据和青早510、其父母本及禾佳源提供的20个(骨干)自交系的基因芯片的结果提取了446个SNP位点,之后通过测序深度、测序质量、检出率、多态性及数据统计分析,最终筛选出高质量、高稳定性、高多态、高杂合率的可区分上述材料的2个SNP标记。本发明提供的上述2个SNP标记可各自独立地对青早510玉米杂交种纯度进行鉴定,也可以联合鉴定。本发明提供的2个SNP标记联合用于青早510玉米杂交种纯度鉴定,其获得的鉴定结果更为准确。
第二方面,本发明提供了所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记或特异性检测所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记的引物组合物在青早510玉米杂交种纯度鉴定中的应用。
第三方面,本发明提供了用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物,所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物包括ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C;所述ZmSNP01-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述ZmSNP01-H的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示;所述ZmSNP01-C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供的SNP标记ZmSNP01可通过ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C的引物组合物扩增得到。
第四方面,本发明提供了另一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物,所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物包括ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C;所述ZmSNP02-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述ZmSNP02-H的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述ZmSNP02-C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提供的SNP标记ZmSNP02可通过ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C的引物组合物扩增得到。
第五方面,本发明提供了用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的试剂、试剂盒或芯片,所述试剂、试剂盒或芯片包括前面所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C;或者包括前面所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C;或者包括ZmSNP01-F、ZmSNP01-H、ZmSNP01-C、ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C共6条引物。
本发明提供的各引物组合物可基于竞争性等位基因PCR(kompetitive allelespecific PCR,KASP)技术对所述SNP标记进行鉴定,基于荧光检测进行基因分型,可在分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定中发挥重要作用。
第六方面,本发明提供了所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物或者所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的试剂、试剂盒或芯片在青早510玉米杂交种纯度鉴定中的应用。
第七方面,本发明提供了青早510玉米杂交种纯度鉴定方法,包括:以待测种子样品的DNA为模板,采用所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物或者所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的试剂、试剂盒或芯片进行PCR扩增;根据扩增结果判断所述待测种子样品发育的单株是否为青早510。
优选地,根据扩增结果进行判断的方法选自以下(1)、(2)或(3):
(1)采用所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C进行PCR扩增:若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为TC,判断其发育的单株为青早510;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为TT,判断其为母本自交苗种子;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为CC,判断其为混杂的父本种子或异型株;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为其他基因型,判断其为异型株种子;
(2)采用所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C进行PCR扩增:若待测种子样品在ZmSNP02的基因型为CT,判断其发育的单株为青早510;若待测种子样品在ZmSNP02的基因型为CC,判断其为母本自交苗种子;若待测种子样品在ZmSNP02的基因型为TT,判断其为混杂的父本种子或异型株;若待测种子样品在ZmSNP02的基因型为其他基因型,判断其为异型株种子;
(3)采用所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C和所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C进行PCR扩增:若待测种子样品在ZmSNP01和ZmSNP02的基因型分别为TC和CT,判断其发育的单株为青早510;若待测种子样品在ZmSNP01和ZmSNP02的基因型分别为TT和CC,判断其为母本自交苗种子;若待测种子样品在ZmSNP01和ZmSNP02的基因型分别为CC和TT,判断其为混杂的父本种子或异型株;若待测种子样品在ZmSNP01和ZmSNP02的基因型为其他基因型,判断其为异型株种子。
上述第(3)种判断的方法应用了两个SNP标记进行判断,其判断结果相较更为准确。
进一步优选地,本发明在引物ZmSNP01-F和/或ZmSNP02-F的5’端添加一种荧光标签;在引物ZmSNP01-H和/或ZmSNP02-H的5’端添加另一种荧光标签;再根据扩增产物释放的两种荧光的强度,判断待测种子样品的基因型。
本发明对所述PCR扩增的具体操作及扩增体系、扩增程序等不作特别限定,本领域常规操作即可。
在本发明提供的较为具体的优选实施方式中,所述PCR扩增包括如下步骤:1)提取待测玉米基因组DNA;2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix,进行PCR扩增;3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
其中,所述KASP Primer mix中分别含有两个SNP标记的三条特异性引物(ZmSNP01-F、ZmSNP01-H、ZmSNP01-C、ZmSNP02-F、ZmSNP02-H和ZmSNP02-C共6条引物,核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-6所示)。
步骤2)中,引物F的5’端优选添加FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO.7);
步骤2)中,引物H的5’端优选添加HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO.8)。
步骤2)中,所用PCR反应体系为:384孔板中每孔加入KASP Primer mix 0.07μl、2×KASP Master mix 2.5μl和DNA模板2.5μl。
步骤2)中,所用PCR反应条件如下:94℃预变性15分钟;第一步扩增反应,94℃变性20秒,61℃~55℃退火并延伸60秒,10个循环;第二步扩增反应,94℃变性20秒,55℃退火并延伸60秒,26个循环。
第八方面,本发明提供了所述SNP标记或者所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的引物组合物或者所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的试剂、试剂盒或芯片在构建玉米品种DNA指纹数据库、玉米种质资源遗传多样性分析、玉米分子标记辅助育种、玉米品种鉴定或制备玉米基因组芯片中的应用。
有益效果:
本发明提供了一种用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记及应用,所述用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的SNP标记选自以下(a)和/或(b):(a)位于8号染色体上第132582645位,其脱氧核苷酸为T或C;(b)位于4号染色体上第60975963位,其脱氧核苷酸为G或A。本发明提供的SNP标记可高通量鉴定青早510玉米种子纯度,具有检测结果稳定、准确、快速、高效的优点,可缩短育种企业种子纯度鉴定的周期、降低田间表型鉴定工作,提高鉴定的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为用于青早510种子纯度鉴定的ZmSNP01标记的KASP检测分型结果图,图中,左上角一簇的基因型为TT,中间一簇的基因型为TC,右下角一簇的基因型为CC。
图2为用于青早510种子纯度鉴定的ZmSNP02标记的KASP检测分型结果图,图中,左上角一簇的基因型为CC,中间一簇的基因型为CT,右下角一簇的基因型为TT。
具体实施方式
本发明提供了用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的2个SNP分子标记,其分别为:(a)位于8号染色体上第132582645位,其脱氧核苷酸为T或C,编号ZmSNP01;(b)位于4号染色体上第60975963位,其脱氧核苷酸为G或A,编号ZmSNP02。
进一步地,本发明提供了用于检测上述2个SNP分子标记的特异性引物组合物,以及特异性引物组合物在青早510玉米杂交种纯度鉴定中的应用。
本发明中,所述特异性引物组合含有2个特异性引物组,每组含有3条特异性引物,分别为引物F、H、C;2个特异性引物组含有引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3、SEQ IDNO.4-6所示;2个特异性引物组分别用于扩增对应的2个SNP分子标记。
进一步地,本发明提供了基于SNP标记进行青早510玉米杂交种纯度鉴定的方法,采用前述特异性引物组合物,以待测青早510玉米种子样品的DNA为模板,基于KASP技术进行PCR扩增,根据父母本和待测玉米种子样品的基因型,判定所述待测玉米种子样品发育的单株是否为青早510。判断标准为:如果待测单株为在ZmSNP01和ZmSNP02的基因型分别为TC和CT,则该单株为青早510;若两个SNP的基因型为纯合的母本基因型,即TT、CC,则检测到的单株为母本自交苗;若两个SNP的基因型为纯和的父本基因型,即CC、TT,则检测到的单株为混杂的父本种子或异型株;若为除此之外的基因型,则为异型株。
进一步地,本发明可根据前述判断结果,结合双亲的基因型数据(表2),确定母本自交苗种子数目和杂株种子数目,综合判定种子的纯度。纯度计算公式为:
P(%)=[(NT-NP-ND)/NT] × 100%。
式中,P为种子纯度;NT为供检种子数目;NP为母本自交苗种子数目;ND为杂株种子数目(杂株种子数目为混杂父本种子和异型株种子数目之和)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明,实施例中所使用的实验方法均为常规方法;所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了用于青早510玉米杂交种纯度鉴定的2个SNP标记。
本实施例基于青早510及其父本的重测序数据和青早510、其父母本及禾佳源提供的20个(骨干)自交系的基因芯片的结果提取了446个SNP位点,之后通过测序深度、测序质量、检出率、多态性及数据统计分析,最终筛选出可区分上述材料的2个SNP标记。具体筛选方法如下:
(1)获取位点:基于青早510及其父本的重测序数据和青早510、其父母本及禾佳源提供的20个(骨干)自交系的玉米基因芯片的结果,提取测序和基因芯片共有的位点446个;
(2)位点筛选:从446个位点中筛选亲本及青早510检出率为100%且亲本间有多态的位点125个;之后再通过计算位点在青早510亲本及20个骨干亲本中的MAF,在不同染色体中挑选MAF>0.45,1个MAF<0.2的位点进行KASP验证,最终筛选出高质量、高稳定性、2个SNP标记,其中1个位点多态性高(MAF为0.455),适用性广,另一个位点多态性稍低(MAF为0.182),有其他品种种子混杂时更易鉴定出,两个位点结合使用,准确性更高。
本实施例获得的适于青早510种子纯度鉴定的2个SNP位点信息如表1所示。青早510及其双亲在2个SNP位点上的基因型数据如表2所示。
表1 2个SNP标记的信息
表2 青早510及其双亲在2对SNP引物上的基因型数据
实施例2
本实施例提供了一种基于实施例1获得的2个玉米SNP标记对青早510玉米杂交种纯度进行鉴定的方法。具体实验步骤如下:
(1)DNA模板的准备:采用磁珠法DNA提取试剂盒提取94个样本的基因组DNA。
(2)KASP引物的设计以及合成:利用生物信息学相关方法找到每个SNP位点物理位置两侧适当长度的参考基因组序列。基于以上参考序列应用Primer5设计KASP引物并进行合成,合成引物时需要在引物F和H的5’端分别添加标签序列FAM和HEX。
(3)两个SNP位点的引物序列具体如表3所示。
表3 KASP引物序列
(4)反应体系的构建:将添加了标签序列的引物、DNA模板以及KASP反应液构建反应体系,每个反应的DNA模板量为5-50ng。具体反应体系如表4所示。
表4
反应条件为:94℃预变性15分钟;第一步扩增反应,94℃变性20秒,61℃~55℃退火并延伸60秒,10个循环;第二步扩增反应,94℃变性20秒,55℃退火并延伸60秒,26个循环。
(5)结果分析:反应结束后对产物进行荧光扫描,扫描结果以散点图的形式出现。根据散点图判断该样品的基因型:图形的横坐标表示产物释放的FAM荧光,纵坐标表示产物释放的HEX荧光。如果能检测出显著的FAM荧光和HEX荧光,则表明样品在该标记位点是杂合体;如果仅检测到显著的HEX荧光但没有检测到显著的FAM荧光,则表明样品是该标记中带HEX荧光标签引物所代表基因型的纯合体;如果仅检测到显著的FAM荧光但没有检测到HEX荧光,则表明样品是该标记中带FAM荧光标签引物所代表基因型的纯合体;如果HEX荧光和FAM荧光都没有检测到,重新检测。
实施例3
本实施例使用实施例2提供的方法对来源于禾佳源公司提供的1kg青早510杂交种中至少随机筛选出150粒进行发苗,分别提取92株杂交种的DNA以及2个亲本的DNA,进行纯度鉴定。结果如图1和图2所示。
图1和图2分别为用于青早510种子纯度鉴定的ZmSNP01标记和ZmSNP02的KASP检测分型结果图,两亲本的散点图均分别位于左上角和右上角;杂交种均聚类在中间,基因型为CT和TC;但其中存在1株在ZmSNP01标记和ZmSNP02标记中均为父本纯合的杂交种单株,则该单株为混杂的父本种子或异型株。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.引物组合物在青早510玉米杂交种纯度鉴定中的应用,其特征在于,所述引物组合物包括ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C;所述ZmSNP01-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述ZmSNP01-H的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述ZmSNP01-C的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
2.试剂、试剂盒或芯片在青早510玉米杂交种纯度鉴定中的应用,其特征在于,所述试剂、试剂盒或芯片包括引物组合物ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C;所述ZmSNP01-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述ZmSNP01-H的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述ZmSNP01-C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,以待测种子样品的DNA为模板,采用所述引物组合物或者所述试剂、试剂盒或芯片进行PCR扩增;根据扩增结果判断所述待测种子样品发育的单株是否为青早510。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,根据扩增结果进行判断的方法为:采用引物组合物ZmSNP01-F、ZmSNP01-H和ZmSNP01-C进行PCR扩增:若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为TC,判断其发育的单株为青早510;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为TT,判断其为母本自交苗种子;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为CC,判断其为混杂的父本种子或异型株;若待测种子样品在ZmSNP01的基因型为其他基因型,判断其为异型株种子。
5.根据权利要求3或4所述应用,其特征在于,在引物ZmSNP01-F的5’端添加一种荧光标签;在引物ZmSNP01-H的5’端添加另一种荧光标签;根据扩增产物释放的两种荧光的强度,判断待测种子样品的基因型。
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"玉米杂交种纯度鉴定SNP核心引物筛选及检测体系方案的研究";施龙建;《全国优秀硕士论文集》;20210515(第05期);1-56 * |
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