CN110438252B

CN110438252B - 与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110438252B
Application number: CN201910713147.8A
Authority: CN
Inventors: 刘志远; 钱伟; 徐兆生; 折红兵; 李国亮; 张合龙; 王晓武; 武剑
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110438252A

Abstract

本发明提供一种与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用。所述分子标记含有位于菠菜基因组第4号染色体58764574处的多态性为T/A的核苷酸序列。本发明基于KASP技术开发出与菠菜性别基因紧密连锁的分子标记，将该标记在菠菜多个群体中验证，证明其与菠菜性别基因紧密连锁，可以准确鉴定菠菜雌雄株。利用本发明提供的特异性KASP引物可以对菠菜性别进行检测，分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记对于改良菠菜雌性系和自交系，缩短育种时间，提高育种效率具有重要实践意义。

Description

与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体地说，涉及一种与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea L.)，又名波斯草、赤根菜，属于黎科菠菜属，是以绿叶为主要产品器官的一二年生草本植物。菠菜含有丰富的植物纤维、蛋白质、维生素(胡萝卜素，维生素B1、B2、B3、E、K、C等)、矿物质(钙、磷、铁、钾等)、叶酸等营养成分。此外，菠菜抗寒性强，适应性广，生产周期短，复种指数高，产量产值高等特点，因而深受我国生产者和消费者欢迎。据2016年FAO统计(http://www.fao.org/faostat/zh/？#data/QC)，我国菠菜产量约2447万吨，占世界菠菜总产量的92％，是世界上菠菜最大的种植国家及消费国家。

菠菜是典型的雌雄异株植物，少量植株表现为雌雄同株。国内外研究者普遍认为，菠菜是雌雄异株植物性别研究的理想模式植物。菠菜雌雄群体中雌雄比约为1:1，菠菜的性别遗传主要受Y染色体上性别决定因子Y控制(Janick et al.,1925；Onodera et al.,2008；2011)。Janick等(1954)经过研究认为性基因型为XX的植株表现为雌株，XY型的植株为能结少量或不结种子的雄株，YY型的植株为不能结籽的雄株。Janick等(1955，1961)提出菠菜雌雄同株植株的性别受另一个与X及Y等位的基因X^m控制，另有一些修饰基因影响雌花和雄花的比例，即雌雄同株性状受X^m基因控制的，X^m和X/Y为等位基因。Yamamoto等(2014)开发了19个AFLP标记，将X^m基因定位在一个7.1cM的区间内，遗传分析表明，X/Y基因与X^m基因定位在不同位点上，两者之间的遗传距离为12cM，表明了菠菜的X^m基因与X/Y基因不是等位基因，而是紧密连锁的基因。

菠菜在苗期很难区别雌、雄株，只有生长至抽薹、开花期，才能区分雌、雄株。因此，为了加速育种进程，提高育种效率，国内外开展了针对菠菜性型的分子标记研究，获得了与菠菜性别紧密连锁的分子标记。Akamatsu(1998)开发与菠菜X/Y位点连锁的分子标记T11A、V20A，可用于鉴别菠菜雌雄植株。Khattak等(2006)认为菠菜性型受X/Y位点控制，X/Y位点被定位在连锁群3，与SSR标记SO4相距1.9cM。Onodera等(2011)利用BSA法筛选到10个AFLP标记与菠菜X/Y位点紧密连锁，4个标记与Y位点共分离。刘丹丹等(2015)采用SRAP-BSA法筛选出3个与性别基因Y连锁的标记。Wadlington(2018)通过比较雄株和雌株的特异性序列，开发了一个可以鉴定YY植株的SCAR标记SpoX。虽然，国内外开发了许多与性别相关的分子标记，但是这些标记多为显性标记，准确度较低，稳定性不好，不适合用于大规模的分子标记辅助选择育种，严重影响菠菜自交系和雌性系的纯化速度及品种选育进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记(SNP标记SponR)，其含有位于菠菜基因组第4号染色体58764574处的多态性为T/A的核苷酸序列。标记SponR的SNP位点信息见表1。

表1 SponR标记的SNP位点信息

标记	染色体	SNP物理位置	等位基因
				SponR	Chr4	58764574	[T/A]

表1中的SNP位置是根据Xu等(2017)发表的菠菜全基因组序列而确定的(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/index.cgi)。

第二方面，本发明提供标记SponR的KASP引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

第三方面，本发明提供含有所述KASP引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供标记SponR，或所述KASP引物，或所述检测试剂或试剂盒在鉴定菠菜性别，特别是在苗期鉴定菠菜的雌雄性别中的应用。

所述应用包括如下步骤：

(1)提取待测菠菜的基因组DNA；

(2)稀释步骤(1)中的DNA到18-22ng/μL(优选20ng/μL)，作为模板，并向其中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

(3)PCR产物进行荧光检测分析；

其中，所述KASP Primer mix包含所述KASP引物；所述正向引物1的5’端还添加有FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(通用标签A)，正向引物2的5’端还添加有HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(通用标签B)。

带有通用标签A的正向引物序列如下：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTAATGCCACAATTATTCTCTCAGT-3’；其中，GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为通用标签A；

带有通用标签B的正向引物序列如下：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTAATGCCACAATTATTCTCTCAGA-3’；其中，GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为通用标签B；

反向引物序列如下：

5’-GAAAATAAATACAACACAGATACGTACTATAATC-3’。

所述KASP Master mix包含如下组份：通用的TRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

可选地，所述KASP Master mix是英国LGC公司产品。产品目录号为KBS-1016-002。

步骤(2)PCR反应体系如下：模板DNA5μL，KASP Primer mix 5μL，KASP Master mix0.14μL。

PCR反应程序如下：94℃15分钟；94℃20秒，61-55℃60秒，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃20秒，55℃60秒，26个循环。

步骤(3)分析PCR扩增产物的SNP位点，如果扩增产物中检测到与正向引物1对应的荧光，则该位点碱基为TT纯合基因型，对应菠菜为雌性植株；如果扩增产物中检测到两种不同荧光，则该位点碱基为AT杂合基因型，对应菠菜为雄性植株。

第五方面，本发明提供标记SponR，或所述KASP引物，或所述检测试剂或试剂盒在菠菜分子标记辅助育种中的应用。

第六方面，本发明提供标记SponR，或所述KASP引物，或所述检测试剂或试剂盒在菠菜基因分型中的应用。

第七方面，本发明提供标记SponR在构建菠菜DNA指纹图谱中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明基于KASP技术开发出与菠菜性别基因紧密连锁的分子标记，将该标记在菠菜多个群体中验证，证明其与菠菜性别基因紧密连锁，可以准确鉴定菠菜雌雄株。利用本发明提供的特异性KASP引物可以对菠菜性别进行检测，分析通量高，准确性高，适用于大量样本的检测。本发明提供的共显性分子标记对于改良菠菜雌性系和自交系，缩短育种时间，提高育种效率具有重要实践意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中菠菜雌、雄株之间测序数据的比对分析结果；其中，每条线代表一条双端短序列(reads)。

图2为本发明实施例2中利用标记SponR检测100份菠菜高代自交系材料的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与菠菜性别基因紧密连锁的分子标记的开发

1、雌、雄株分别进行高乘数的重测序

分别取20株雌株菠菜和20株雄株菠菜的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA。提取的DNA样品由百迈客生物技术有限公司采用Illumina Xten平台进行双末端重测序，测序序列读长为150bp，测序深度为10×。

2、雌、雄株特异序列分析

利用bwa(v0.7.17-r1188)软件分别将20株雌株和20株雄株菠菜的测序数据比对到菠菜的参考基因组上(http://www.spinachbase.org/cgi-bin/spinach/index.cgi)。基于序列比对的结果，筛选出雄株特有的序列(Chr4:58765000-58790000)(图1)。由于Y染色体比X染色体的基因组多了一段序列，我们利用高乘数测序的方法，通过reads覆盖度的比较，找到了该段序列，这一段序列是Y基因特有的序列，基于这段序列，在其周围找到了与这段序列共连锁的标记。

3、KASP标记的开发

基于雄株特异序列在染色体的位置，在此周围寻找雌株和雄株差异的SNP位点(Chr4:58764574)，将此位点设计成KASP标记。依据SNP突变信息特点，设计成套的竞争性等位基因特异性PCR引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基T/A，反向引物的序列选择要保证扩增片段在60-120bp。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为FAM荧光标签序列5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，正向引物2的5′端连接为HEX荧光标签序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

引物序列如下：

上述引物序列均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。本发明提供的KASP基因分型通量大且操作简单，只需将特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终结果采用荧光检测仪进行分析即可。

实施例2 SponR用于分子标记辅助选择育种

检测方法如下：

1、提取植物基因组DNA

待菠菜抽薹期，挑选25个菠菜高代自交株系，对其中每个株系中2个雌株和2个雄株的嫩叶进行取样，采用CTAB法提取这些菠菜的全基因组DNA。

2、稀释DNA浓度

利用NanoDrop ND-2000检测DNA的浓度，然后将其稀释到20ng/μl。

3、KASP Primer mix的制备

各取正向引物12μl(100μM),反向引物30μl(100μM)，用无菌超纯水补充至100μl。

4、PCR扩增反应体系如下：

组分	96孔板(μl)	384孔板(μl)
			模板DNA	5	2.5
KASP Master mix	5	2.5
			KASP Primer mix	0.14	0.07
总体积	10.14	5.07

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

5、PCR反应条件如下：

待荧光检测分型后，若分型结果不理想，可再进行如下PCR反应：

第二次PCR反应结束后可再次进行荧光检测分析。

6、PCR扩增产物的荧光扫描

利用Applied Biosystems公司生产的QuantStudio 6Flex机器对PCR扩增产物进行扫描，基于两荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，从而实现对扩增产物的分型。聚合在X轴的显示蓝色的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，即为TT；聚合在中间的显示绿色样本的基因型为两种等位基因，即为AT(图2)。

结果分析：菠菜为典型的雌、雄异株植物，雌株的基因型为XX，雄株的基因型为XY。

SponR的标记分型也只有两种基因型与XX和XY基因型一致；结合雌雄株的取样结果，SponR的分型结果与田间调查完全一致，结果表明SponR标记可准确区分菠菜的雌株和雄株，且速度快，准确率高，因而可以用于分子标记的辅助选择育种。

由于标记SponR位于Y基因附近，该标记相比其它分子标记的准确率更高。通过对一个高代自交系中4000个菠菜材料的雌、雄株鉴定，结果表明利用此前发表的D4.3标记筛选(刘丹丹，2015)，有7株菠菜鉴定错误，而使用标记SponR只有2株鉴定错误。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]Akamatsu T,Suzuki T.1999.Method for identifying the sex of spinachby DNA markers:U.S.Patent 5,910,412.

[2]Janick J,Iizuka M.1961.Sex determination in a spinach linecontaining a heteromorphic sex chromosome.Genetics,46:873-874.

[3]Janick J,Stevenson E C.1955.Genetics of the monoecious characterin spinach.Genetics，40(4):429.

[4]Janick J,Stevenson E.1954.A genetic study of the heterogameticnature of the staminate plant in spinach[J].Proc Am Soc Hortic Sci,63:444-446.

[5]Khattak J Z K,Trop A M,Andersen A B.2006.A genetic linkage map ofSpinacia oleracea and localization of a sex determination locus.Euphytica,148:311-318.

[6]Onodera Y,Yonaha I,Masumo H,Tanaka A,Niikura S,Yamazaki S,MikamiT.2011.Mapping of the genes for dioecism and monoecismin Spinacia oleraceaL.:evidence that both genes are closely linked.Plant Cell Rep,30:965-971.

[7]Onodera Y,Yonaha I,Niikura S,Yamazaki S,Mikami T.2008.Monoecy andgynomonoecy in Spinacia oleracea L.：Morphological and geneticanalyses.Scientia Horticulturae,118(3):266-269.

[8]Xu C，Jiao C，Sun H，et al.2017.Draft genome of spinach andtranscriptome diversity of 120Spinacia accessions[J].Nat Commun,8:15275-15285.

[9]Wadlington W H,Ming R.2018.Development of an X-specific marker andidentification of YY individuals in spinach[J].Theoretical and appliedgenetics,131(9):1987-1994.

[10]Yamamaoto K,Oda Y,Haseda A,Fujito S,Mikami T,Onodera.2014.Molecular evidence that the genes for dioecism and monoecism inSpinacia oleracea L.are located at different loci in a chromosomalregion.Heredity,1-8

[11]刘丹丹,钱伟,张合龙,等.2015.菠菜性别基因X/Y连锁标记的筛选及应用.园艺学报.42(8):1583-1590.

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用

<130>KHP191113776.6

<160>3

<170>SIPOSequenceListing1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agttaatgcc acaattattc tctcagt 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttaatgcc acaattattc tctcaga 27

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaataaat acaacacaga tacgtactat aatc 34

Claims

1.与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记，其为位于菠菜基因组第4号染色体上含有58764574处的多态性为T/A位点的核苷酸序列；该位点碱基为TT的纯合基因型对应菠菜为雌性植株；该位点碱基为AT基因型对应菠菜为雄性植株；

分子标记的物理位置是基于spinachbase Sp75菠菜基因组版本号V1。

2.用于鉴定权利要求1所述分子标记的KASP引物，其特征在于，包括正向引物1、正向引物2和反向引物，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

3.含有权利要求2所述KASP引物的检测试剂或试剂盒。

4.检测权利要求1所述分子标记的试剂的以下任一应用：

1）用于鉴定菠菜雌雄性别；

2）用于与菠菜雌雄性别相关的分子标记辅助育种；

3）用于菠菜基因分型；

4）用于构建菠菜DNA指纹图谱。

5.权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或权利要求3所述试剂盒在鉴定菠菜雌雄性别中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测菠菜的基因组DNA；

(2)稀释步骤(1)中的DNA到18-22 ng/µL，作为模板，并向其中加入特异的KASP Primermix和通用的KASP Master mix，进行PCR扩增；

(3) PCR产物进行荧光检测分析；

其中，所述KASP Primer mix包含权利要求2所述的KASP引物；

所述KASP Master mix包含如下组份：通用的TRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂；

步骤(3)分析PCR产物的SNP位点，该位点碱基为TT的纯合基因型对应菠菜为雌性植株；该位点碱基为AT基因型对应菠菜为雄性植株。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)PCR反应体系如下：模板DNA 5µL，KASP Primer mix 5µL，KASP Master mix 0.14µL；

PCR反应程序如下：94℃ 15分钟；94℃ 20秒，61-55℃ 60秒，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃ 20秒，55℃ 60秒，26个循环。

8.权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或权利要求3所述试剂盒在与菠菜雌雄性别相关的分子标记辅助育种中的应用。

9.权利要求2所述KASP引物或权利要求3所述检测试剂或权利要求3所述试剂盒在菠菜基因分型中的应用。