CN111269975A - 一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记 - Google Patents

一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴定三疣梭子蟹遗传性别的方法，其中使用了用于鉴别三疣梭子蟹性别的SNP位点，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1片段；或由SEQ ID NO:1取代、缺失、添加一个或几个核苷酸，由SEQ ID NO:1衍生片段的第878位，其碱基为T>C。本发明所提供的SNP位点分子标记在雄性个体中呈现二等位基因杂合型，而在雌性个体中均呈现等位基因纯合型，可以采用PCR扩增测序方法或KASP方法进行检测。检测方法灵活，结果稳定，其中KASP检测方法通量较高，检测速度快，应用简单，为三疣梭子蟹全雌苗种的繁育提供重要工具。

Description

一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记
技术领域
本发明属于水产生物遗传育种技术领域，具体涉及一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记。
背景技术
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)广泛分布于中国、朝鲜、日本等海域，是一种重要的大型海产经济蟹类，且雌性红膏蟹因为卵黄物质的积累，风味成分和营养物质含量更为丰富，市场价格远高于雄蟹。因此，开展三疣梭子蟹全雌单性养殖，具有良好的市场前景。采用性别反转技术筛选性反转的个体，然后与正常亲本交配繁殖是进行单性群体构建的方法之一，该方法要求能同时鉴别亲本的遗传性别和表型性别，性别连锁分子标记的开发有利于快速鉴定性反转个体，提高目标亲本选择效率。
分子标记技术是一个用来鉴定遗传性别的有效工具。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)作为第三代分子标记在基因分型中得到了广泛的应用。竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele-specific PCR,KASP)，是基于等位基因特异性寡核苷酸延伸和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)信号的单个SNP基因分型方法之一，已成为一项全球性的基准技术，具有高通量、低成本、高灵敏度和特异性等特点。
发明内容
本发明提供一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记，通过检测该三疣分子标记可快速进行高通量的性别鉴定，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种三疣梭子蟹性别鉴定标记的SNP位点，是分布在序列为SEQID NO:1的片段上的第878位的性别连锁SNP位点，其碱基为T>C；
本发明还提供用于三疣梭子蟹性别鉴定的分子试剂，所述的试剂用于检测上述的SNP位点；
所述的分子试剂，其一种是用于PCR扩增测序方法的试剂；另一种是用于KASP检测方法的试剂；
其中用于PCR扩增测序方法的试剂，包含有用于检测上述SNP位点的PCR扩增测序的引物对，其序列信息如下：
PS8 Forward：5'-ATACCAGACAAGAGGGCTTC-3'(SEQ ID NO:2)、
PS8 Reverse 5'-TCCCATATAGATATTAGTGTCATTC-3'(SEQ ID NO:3)；
其中用于KASP检测方法的试剂，其中包含有如下的引物：
PtS2FAM(SEQ ID NO:4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGCTAGTGCACTGATCCTCCA
PtS2HEX(SEQ ID NO:5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCTAGTGCACTGATCCTCCG
PtS2C(SEQ ID NO:6)：
CTGTCAACTTCACCTCAAGTTGATGTTA；
本发明再一个方面提供检测三疣梭子蟹的雌雄性别的方法，是通过检测上述的SNP位点来辨别三疣梭子蟹的雌雄性别；
其中一种具体的方法，是通过PCR扩增、测序方法来进行检测，测序结果与上述分子标记的DNA序列进行比对，若测序峰图与分子标记的DNA序列一致，且在SNP位置为单峰则为雌性，若测序峰图在SNP位置为双峰则为雄性；
再一种具体的方法，是通过KASP的方法进行检测，根据荧光信号判断待测三疣梭子蟹性别连锁位点的基因型种类对样品性别进行鉴定。
本发明所提供的SNP位点分子标记在雄性个体中呈现二等位基因杂合型，而在雌性个体中均呈现等位基因纯合型，可以采用PCR扩增测序方法或KASP方法进行检测。检测方法灵活，结果稳定，其中KASP检测方法通量较高，检测速度快，应用简单，为三疣梭子蟹全雌苗种的繁育提供重要工具。
附图说明
图1：PS8引物测性别标记测序峰图，箭头所指为SNP位点；
图2：位点PtS2性别标记KASP检测图，其中NTC黑点为阴性对照(H2O)，粉点表示未扩增成功。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：标记的筛选和引物设计
申请人对三疣梭子蟹雌雄各15个个体，提取DNA，进行2b-RAD简化基因组测序，结合样品的性别记录，采用相关分析方法，获得性别相关SNP标记及所在的核酸片段。然后使用该标签序列blast发明人所在实验室建立的三疣梭子蟹简化基因组文库，最终筛选获得了含有性别标签的长片段scaffold序列scaffold325741，含有一个与性别相关的SNP标记(PtS2)，SNP标记是分布在序列为SEQ ID NO:1的片段上的第878位的性别连锁SNP位点，其碱基为T>C；
Figure BDA0002411170300000031
Figure BDA0002411170300000041
采用Primer Premier 5软件对scaffold325741进行测序引物设计，用于检测SNP位点，对scaffold325741进行测序引物设计PS8，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在100-300bp之间；退火温度应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体。引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。
表1：测序引物序列信息(退火温度Ta:60℃)
Figure BDA0002411170300000042
根据获得的SNP位点序列信息，进行KASP检测引物设计。采用Polymarker(http://www.polymarker.info/)分别设计了两条等位基因特异性反向引物(5’端分别连接能够与FAM荧光基团和HEX荧光基团结合的特异性序列)和一条通用的正向引物。位点PtS2(位于scaffold325741序列)引物组合为PtS2FAM，PtS2HEX,PtS2C。引物序列见表2。
表2：KASP引物序列信息表
Figure BDA0002411170300000051
注：FAM特异性序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；HEX特异性序列:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
实施例2：采用测序方法进行分型检测
采集三疣梭子蟹野生群体60个个体(30雌+30雄)，采用组织基因组DNA提取试剂盒(百泰克，北京)提取肌肉样品DNA。
使用PS8引物进行PCR扩增测序。同时对样品性腺组织进行石蜡切片及HE染色，确保性别鉴定的准确性。
PCR反应体系为10μL，包括：100ng DNA模板，2×Power Taq PCR Master Mix(百泰克，北京)5μL，正反引物各1μmol。
PCR扩增程序为：94℃变性3min；35个循环包括：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min。最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物送上海生工进行双向测序，测序结果发现每条序列各存在1个snp位点在雌雄中存在差异，雌性均为纯合，雄性为杂合，具体基因型见表2，测序图见图1。
表2：三疣梭子蟹雌雄个体的基因型测序结果
Figure BDA0002411170300000052
实施例3、采用KASP方法进行分型检测
另外采集三疣梭子蟹野生群体92个个体(46雌+46雄)，根据
Figure BDA0002411170300000061
组织DNA试剂盒说明书的步骤，提取三疣梭子蟹肌肉组织基因组DNA。
PtS2位点使用KASP引物组合进行PCR扩增测序。同时对样品性腺组织进行石蜡切片及HE染色，确保性别鉴定的准确性。
KASP反应在Hydrocycler-16(LGC Genomics,UK)上进行，反应体系为1μl，包括0.5μl 2×KASP 1536 Master Mix,0.014μl Primer mix(Primer mix预混液包括
Figure BDA0002411170300000063
ddH2O,
Figure BDA0002411170300000062
common primer(100μM)，两条等位基因特异性引物(100μM)各12μl)，10ng DNA。Touchdown PCR程序如下：94℃10min；94℃20s，61℃10s，每个循环-0.6℃，共10个循环；94℃20s，55℃60s，26个循环。使用Pherastar scanner(LGC Genomics，UK)对反应进行荧光检测，并使用Kraken软件(LGC Genomics，UK)对数据进行分析。如果在初始扩增后没有观察到基因分型，可以额外增加5-10个循环后再次读取。
使用KASP方法对92只野生三疣梭子蟹进行基因分型结果如图2所示。PtS2的分型结果为纯合子T/T(蓝色点)与杂合子T/C(绿色点)两型。PtS2的分型结果均与个体的表型性别一致，且符合雌性纯合子，雄性杂合子的规律。位点PtS2在90个个体中扩增成功(2个雌性个体扩增失败)，成功扩增个体分型正确率100％。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种与三疣梭子蟹遗传性别相关的分子标记
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggttcctt tcaaacactg agccctagaa cacttcatat gaccctcagg aagtattttg 60
taatgtgtgc agtaaggttc ctttcaaaca ctgagcccta gaacacttca tatgtccctc 120
aggaagtatt ttgtaagtaa atataataga gtataacata agtttcagtg gatagtgcta 180
aaggtgaaag tacacggatt tcttgatttg catatatttg aaatatgcga ttttgaaata 240
acactatgta agaaagaatc ctttttccat attatgcaca ttatatagaa tatgatgtca 300
agaaaatcaa gttgcccatc tggaaacacc aggtgacacc tggtgttccc catgtgtact 360
gccaacatgc tgtccctttg cacagtgctt caaagtaatt atcagcaaca aaatcagtgt 420
gcaagtaaca atttatccat gcaccactag tttgtttgat atcctttaac ttaatgtcag 480
ctgtgttatt tgactcacat acttaacaca gaccagcaat atcacatcta tacaatgcat 540
tgataataga aaggtacaca tagtaaatca gatagtttac cttaccttgg tacaaaagcc 600
agccagtaca ctcgtcacta ccaccgactt atctaagcaa ccatccacag ctgaggacta 660
actgatccca caacaaaaca catcactggt gatccaaaga attagacaca tcatacaaat 720
acatcacctc tccacctcaa caatttacca ccataccaga caagagggct tccaaaagcc 780
aacactcagc cagccactgc tcatctgctg actgccagac tcaaagctac caacaaaact 840
gcatttttgc tgtcaacttc acctcaagtt gatgttatgg aggatcagtg cactagcctg 900
ccactctggc aagtgtataa ggttgccagg actcttctga tattccaaaa tactatttat 960
gtatacaatt tgaatgacac taatatctat atgggataca aaaaaaaata caaaaatgag 1020
attcttctga tgtttttaat atttgttgat taaagacact catccatggc agctatataa 1080
accttatgca gcaaaatatt tgaatggcag ctgttttggt agccgatgtc aagtgcccca 1140
cactcaccaa cattctatct aaagagcgtc atggacaaaa tgggatgtta cccacaacac 1200
tggtaaggca gtctactttc attaacccct tcctggcagc agggcagatg agtgaactac 1260
caaataaaaa acatctacat acacctaacc ctccgttatc gcgcccttct gttatcgcgt 1320
ttacgcatta tcgcacactt atgaaaatgt gcaaaattca gttttagcgc atctggaaag 1380
ttgttatcgc 1390
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataccagaca agagggcttc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcccatatag atattagtgt cattc 25
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc taggctagtg cactgatcct cca 43
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tggctagtgc actgatcctc cg 42
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtcaactt cacctcaagt tgatgtta 28

Claims (10)

1.一种三疣梭子蟹性别鉴定标记的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1片段或衍生片段的第878位，其碱基为T>C。
2.如权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，所述的衍生片段，是由SEQ ID NO:1取代、缺失、添加一个或几个核苷酸所获得的片段。
3.一种用于三疣梭子蟹性别鉴定的分子试剂，其特征在于，所述的试剂用于检测权利要求1所述的SNP位点。
4.如权利要求3所述的分子试剂，其特征在于，所述的分子试剂，是用于PCR扩增测序方法的试剂。
5.如权利要求3所述的分子试剂，其特征在于，所述的分子试剂，是用于KASP检测方法的试剂。
6.如权利要求4所述的分子试剂，其特征在于，所述的PCR扩增测序方法的试剂包含有用于检测权利要求1所述的SNP位点的PCR扩增测序引物对，其中正向引物的序列为SEQ IDNO:2、反向引物的序列为SEQ ID NO:3。
7.权利要求4所述的分子试剂，其特征在于，所述的KASP检测方法的试剂，其中的引物的序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。
8.一种检测三疣梭子蟹的雌雄性别的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的SNP位点来辨别三疣梭子蟹的雌雄性别。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过PCR扩增、测序方法来进行检测。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过KASP的方法进行检测。
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RONGHUA LI等: "Mapping and validation of sex-linked SNP markers in the swimming crab Portunus trituberculatus", 《AQUACULTURE》 *

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