CN111118131B - 一种三疣梭子蟹性别鉴定标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三疣梭子蟹性别鉴定标记，是分布在核酸序列为SEQ ID NO:1的片段上的6个性别连锁的SNP位点，分别是153C>T、185G>A、214T>C、236T>(A,C)、251T>C、261A>T。本发明再一个方面提供检测三疣梭子蟹的雌雄性别的方法，是通过检测三疣梭子蟹性别鉴定标记来辨别三疣梭子蟹的雌雄性别。本发明所提供的分子标记中的6个SNP位点在1雄性个体中均呈现二等位基因杂合型，而在雌性个体中均呈现等位基因纯合型，可以采用两种方法进行检测，检测方法灵活，结果稳定，其中高分辨率溶解曲线的检测方法通量较高，检测速度快，应用简单，为三疣梭子蟹全雌苗种的繁育提供重要工具。

Description

一种三疣梭子蟹性别鉴定标记
技术领域
本发明属于分子标记育种技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹性别鉴定标记。
背景技术
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)，俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，广泛分布于我国东南沿海以及日本、朝鲜、马来西亚群岛等水域，是我国重要的捕捞和养殖经济甲壳类，据《2019中国渔业统计年鉴》数据，2018年我国三疣梭子蟹养殖产量达116,251吨。三疣梭子蟹味道鲜美，营养丰富，尤其以卵巢发育成熟但未产卵的雌性红膏蟹为佳，其经济价值远高于雄蟹。因此，全雌三疣梭子蟹苗种培育技术的开发具有良好的市场前景。其关键技术之一是获得能够在早期快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记，便于区分性反转个体，进行育种亲本的挑选。
发明内容
本发明提供一种三疣梭子蟹性别鉴定标记，可快速进行高通量的性别鉴定，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的三疣梭子蟹性别鉴定标记，是分布在序列为SEQ ID NO:1的片段上的6个性别连锁的SNP位点，分别是153C>T、185G>A、214T>C、236T>(A,C)、251T>C、261A>T。
本发明还提供一种用于三疣梭子蟹性别鉴定的分子试剂，所述的试剂用于检测上述的三疣梭子蟹性别鉴定标记；
所述的分子试剂，其一种是用于PCR扩增测序方法的试剂；另一种是用于高分辨率溶解曲线检测方法的试剂；
本发明还提供用于检测上述标记的引物对，其上游引物的序列为
5'-CCGACAACACAGATCCACTAAC-3'(SEQ ID NO:2)，
下游引物的序列为：
5'-CGAGTGTGGAGAGAATGATTTTT-3'(SEQ ID NO:3)；
本发明再一个方面提供检测三疣梭子蟹的雌雄性别的方法，是通过检测三疣梭子蟹性别鉴定标记来辨别三疣梭子蟹的雌雄性别；
其中一种具体的方法，是通过PCR扩增、测序方法来进行检测，测序结果与上述分子标记的DNA序列进行比对，若测序峰图与分子标记的DNA序列一致，且在SNP位置为单峰则为雌性，若测序峰图在SNP位置为单双峰则为雄性；
再一种具体的方法，是通过高分辨率溶解曲线的方法进行检测，其中雄性溶解曲线峰值位于80.52℃，雌性溶解曲线峰值位于81.91℃，高于雄性个体，雌性与雄性可以得到较好的区分。
本发明所提供的分子标记中的6个SNP位点在1雄性个体中均呈现二等位基因杂合型，而在雌性个体中均呈现等位基因纯合型，可以采用两种方法进行检测，检测方法灵活，结果稳定，其中高分辨率溶解曲线的检测方法通量较高，检测速度快，应用简单，为三疣梭子蟹全雌苗种的繁育提供重要工具。
附图说明
图1：性别标记测序峰图，其中(A)雌性,(B)雄性。
图2：性别标记高分辨率溶解曲线图，其中(a)雌性,(b)雄性。
具体实施方式
对于本发明所涉及的名词解释如下：
SNP(single nucleotide polymorphism):单核苷酸多态性，或单碱基多型性；
HRM(high-resolution melting):高分辨率熔解曲线，是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且具有成本低、通量高、速度快、结果准确高的特点，是单核苷酸多态性分析的常用方法之一。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：标记的筛选和引物设计
申请人对三疣梭子蟹雌雄各15个个体，提取DNA，进行2b-RAD简化基因组测序，结合样品的性别记录，采用相关分析方法，获得性别相关SNP标记及所在的核酸片段。然后使用该标签序列blast实验室建立的三疣梭子蟹简化基因组文库，获得含有性别标签的长片段scaffold序列(scaffold136081)，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
AAATCACATTTAGAATACCATAACCTTTTACCTACTTCACAGCATGGCTTCCGACAACACAGATCCACTAACACAGCTATAGCAACTTTAACAGAAGCAGTAGCAAACTCTCTCACACAAAATAAGATCTGCACAATTGTTACAAGAGACATTTCAAAAGCATTTGATAAAGTCTGGCATAACGAATTAAAATACAAACTAACAAAACAACATCTCCACCCTATATACATCAAAATATTAAGCTCATTCCCAGACAACAGTTCAGGAAAAATCATTCTCTCCACACTCGAAGGGCAACCATTCCCACTATTAAGCGGCCTACCACAAGGAAGCAACTTATCCCCAACACTTTTCAACATA
采用Primer Premier 5软件对scaffold136081进行引物设计PS_11，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在100-300bp之间；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体。引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。
表1：引物序列信息
Figure BDA0002403091830000041
采集三疣梭子蟹野生群体60个个体(30雌+30雄)，采用组织基因组DNA提取试剂盒(百泰克，北京)提取肌肉样品DNA。
一、使用PS_11引物进行PCR扩增测序。同时对样品性腺组织进行石蜡切片及HE染色，确保性别鉴定的准确性。
PCR反应体系为10μL，包括：100ng DNA模板，2×Power Taq PCR Master Mix(百泰克，北京)5μL，正反引物各1μmol。
PCR扩增程序为：94℃变性3min；35个循环包括：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min。最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物送上海生工进行双向测序，测序结果发现6个snp位点在雌雄中存在差异，雌性均为纯合，雄性为杂合，具体基因型见表2，测序图见图1。
表2：三疣梭子蟹雌雄个体的基因型
Figure BDA0002403091830000051
二、采用HRM曲线进行分型检测
使用PS_11引物，采用高分辨率溶解曲线方法，进行三疣梭子蟹性别鉴定。使用
Figure BDA0002403091830000052
480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL1×
Figure BDA0002403091830000053
480HRM MasterMix with
Figure BDA0002403091830000054
dye(Roche Diagnostics)，正反引物各10pmol，30ng DNA模板，1.6μL Mgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在
Figure BDA0002403091830000055
480实时定量分析仪(Roche Diagnostics)上进行。反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火温度30s，72℃30s，45个循环。反应结束后用roche
Figure BDA0002403091830000056
480软件自带的TmCalling和Gene Scanning Software 1.5软件进行Tm值分析和基因分型。结果表明雄性溶解曲线峰值位于80.52℃，雌性溶解曲线峰值位于81.91℃，雌性与雄性可以得到区分(图2)，可以采用PS_11引物以溶解曲线方法对三疣梭子蟹遗传性别进行有效鉴定。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种三疣梭子蟹性别鉴定标记
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatcacatt tagaatacca taacctttta cctacttcac agcatggctt ccgacaacac 60
agatccacta acacagctat agcaacttta acagaagcag tagcaaactc tctcacacaa 120
aataagatct gcacaattgt tacaagagac atttcaaaag catttgataa agtctggcat 180
aacgaattaa aatacaaact aacaaaacaa catctccacc ctatatacat caaaatatta 240
agctcattcc cagacaacag ttcaggaaaa atcattctct ccacactcga agggcaacca 300
ttcccactat taagcggcct accacaagga agcaacttat ccccaacact tttcaacata 360
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgacaacac agatccacta ac 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagtgtgga gagaatgatt ttt 23

Claims (8)

1.一种用于三疣梭子蟹性别鉴定的分子试剂制品，其特征在于，所述的分子试剂制品是用于检测三疣梭子蟹性别鉴定标记；所述的性别鉴定标记是分布在序列为SEQ ID NO:1的片段上的6个性别连锁的SNP位点，分别是153C>T、185G>A、214T>C、236T>(A,C)、251T>C、261A>T。
2.如权利要求1所述的分子试剂制品，其特征在于，所述的分子试剂制品包含有用于PCR扩增测序的试剂。
3.如权利要求1所述的分子试剂制品，其特征在于，所述的分子试剂制品包含有用于高分辨率溶解曲线检测的试剂。
4.如权利要求1-3任一项所述的分子试剂制品，其特征在于，所述的分子试剂制品中包含有用于检测三疣梭子蟹性别鉴定标记的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
5.一种检测三疣梭子蟹雌雄性别的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测三疣梭子蟹性别鉴定标记来辨别三疣梭子蟹的雌雄性别，所述的性别鉴定标记是分布在序列为SEQ ID NO:1的片段上的6个性别连锁的SNP位点，分别是153C>T、185G>A、214T>C、236T>(A,C)、251T>C、261A>T。
6.如权利要5所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过权利要求4所述的分子试剂制品来完成的。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过PCR扩增、测序方法来进行检测，测序结果与所述的三疣梭子蟹性别鉴定标记的DNA序列进行比对，若测序峰图与性别鉴定标记的DNA序列一致，且在SNP位置为单峰则为雌性，若测序峰图在SNP位置为单双峰则为雄性。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过高分辨率溶解曲线的方法进行检测，其中雄性溶解曲线峰值位于80.52℃，雌性溶解曲线峰值位于81.91℃，高于雄性个体，雌性与雄性可以得到较好的区分。
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三疣梭子蟹雌雄个体遗传差异的SRAP分析;胡则辉等;《上海海洋大学学报》;20101115;第19卷(第06期);734-738 *

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