CN103387978A - 三疣梭子蟹c-型凝集素基因多态性标记及snp分子标记基因分型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记，该基因多态性标记包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4个SNP位点及一个三碱基的缺失，其中第四外显子205bp处的SNP与三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相关联，命名为T/C E4-205。相应的，本发明公开了用于得到三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关的C-型凝集素分子标记的方法以及进行关联分析的方法。本发明通过现代分子生物学技术获得疾病相关的分子标记并建立快速鉴定SNP的方法，该方法具有高通量、低成本、灵敏、特异性高、真正实现闭管操作的优势，可用于利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体作为亲本，为培育三疣梭子蟹抗病品系奠定重要的基础。

Description

三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记及SNP分子标记基因分型的方法

技术领域

本发明涉及三疣梭子蟹C-型凝集素基因组及其抗溶藻弧菌相关的SNP分子标记的制备，以及快速进行SNP基因分型的方法，属于水产生物技术中的分子标记育种技术领域。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是大陆沿海各省海水养殖的主导产品，尤其是浙江。我国养殖的梭子蟹有三分之二是在浙江，在“十二五规划”中，三疣梭子蟹被列为宁波水产养殖三大主导产品之一。然而，近年来，由于养殖规模的不断扩大、养殖环境的污染等损害了三疣梭子蟹免疫防御系统，导致自身的抗病力下降，对病害的易感性增加，疾病频繁发生。溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的感染给三疣梭子蟹养殖业带来了重大经济损失，严重制约了梭子蟹养殖业的持续健康发展。

目前，养殖户多用抗生素进行病害的防治，但从使用抗生素等药物的安全性、抗药性以及对水环境的不良影响等方面考虑，研究三疣梭子蟹的免疫机制，筛选与抗病相关的分子标记用来人工辅助育种，培育优良的抗病品系，显得越来越重要。三疣梭子蟹属于甲壳类动物，无特异性免疫应答，非特异性免疫包括细胞免疫和体液免疫，C-型凝集素是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。其表面携带有特异性糖基决定簇的受体，能依据颗粒物质表面的糖基组成来区分异己，它的作用类似于脊椎动物的抗体，选择性凝集外来病原菌和复杂的碳水化合物，调理和介导血细胞吞噬外来物质，协同其他免疫因子抵御外来病原入侵。

目前国内外对三疣梭子蟹的免疫相关基因的研究尚处于初级阶段，仅是得到了基因cDNA的全长及其分子结构特征以及病原刺激后该基因的表达特征等，初步阐明了该基因在机体抗感染中的积极应答。但其多态性与三疣梭子蟹抗病性状的关系研究还未见报道。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)标记是指基因组序列单个核苷酸差异而引起的遗传多态性，包括单个碱基的转换、颠换以及单个碱基的插入、缺失等。它作为一类遗传标记以其位点丰富、具有代表性、遗传稳定性高及易实现分析的自动化等特性得以广泛应用。

高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。该方法与其他遗传分型技术相比，不受突变碱基位点与类型的局限，操作简便，具有灵敏性、特异性高、成本低廉、快速、高通量检测的优点，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。HRM技术主要是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品，在PCR反应时引入饱和的荧光染料EvaGreen或LC Green plus，荧光染料在PCR扩增的过程中被嵌入到DNA双链中。当嵌有染料的DNA分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA分子的熔解曲线，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm值)。如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而能够成功的筛选出突变基因或进行基因分型。

因为HRM技术具有较多的优点，被广泛应用于医学分子分型诊断及甲基化研究中，近年来，也被逐步用于水产生物技术及分子育种领域中，但目前尚未有将HRM技术用于三疣梭子蟹SNP分子标记基因分型的报道。

发明内容

针对现有技术中有关三疣梭子蟹分子标记研究的不足，申请人深入开展了三疣梭子蟹C-型凝集素基因的多态性及抗病相关SNP的筛选，并将HRM技术应用于抗病相关的SNP分子标记基因分型的研究，本发明的研究成果可用于利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体作为亲本，为培育三疣梭子蟹抗病品系奠定重要的基础。

基于上述研究，本发明的第一个目的是获得三疣梭子蟹C-型凝集素基因组DNA及其多态性，并筛选出抗病相关的分子标记，为培育三疣梭子蟹抗病品系提供基因标记。

本发明的第二个目的是建立快速检测抗病相关SNP的高分辨率溶解曲线(HRM)的方法，为利用标记辅助选择(MAS)进行选择抗病基因型个体作为亲本培育三疣梭子蟹抗病品系奠定基础。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明公开了三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记(SNP)，该基因多态性标记包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4个SNP位点及一个三碱基的缺失，其中第四外显子205bp处的SNP与三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相关联，命名为T/C E4-205。

上述SNP的筛选包括下述步骤：(1)克隆三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列；(2)制备三疣梭子蟹的抗病群体和敏感群体；(3)筛选抗病相关C-型凝集素基因标记。

其中，所述步骤(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的总基因组DNA，设计引物，利用长片段PCR扩增基因组DNA获得序列，克隆至T载体后测序，获得全长的C-型凝集素基因组，该序列为序列表序列1。

在上述方法中，引物是根据已知的三疣梭子蟹C-型凝集素基因mRNA序列(序列号EU477491.1)，使用公用的Primer5.0软件设计的，所得扩增引物的核苷酸序列为F1：5’TCCTGTTCTGACAACCACCAA3’，R1：5’CTGTGCCCGAGTCAAGAAGTA3’。

在上述方法中，利用TIANamp Genomic DNA纯化试剂盒提取三疣梭子蟹血液样品中的总基因组DNA，所得C-型凝集素基因组全长为1473bp，经过分析发现该C-型凝集素基因组包括4个外显子和3个内含子。

其中，所述步骤(2)采用溶藻弧菌对三疣梭子蟹进行浸泡感染，根据死亡时间判断梭子蟹对病原菌感染的抵抗能力，将梭子蟹分为抗病群体和敏感群体。

在通过上述人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体后采集样品提取基因组模板备用。

其中，所述步骤(3)对步骤(2)所得个体的克隆进行测序，得到4个SNP位点：分别位于第二内含子、第三内含子、第三内含子、第四外显子；对包含SNP位点序列设计引物扩增测序，并对各基因型及等位基因做相关性分析，将第四外显子205bp处CC作为疾病敏感相关的C-型凝集素基因标记，将第四外显子205bp处TT作为抗病相关的C-型凝集素基因标记。

其中，扩增SNP位点的引物分别为F2，R2；F3，R3；F4，R4，序列为

F2：5’TCAAATCATTTCCTTGTGAGGG3’；

R2：5’ACAAAAGGATGTCACCGTAGAA3’；

F3：5’GCAATTCTACGGTGACATCCTT3’；

R3：5’TTATCGCCATAGTTAGCCCAAA3’；

F4：5’ACTCCTTTTTGGGCTAACTATGGC3’；

R4：5’TCCAAAGTAAGCTGGTTAGCACAT3’。

对多个个体的克隆进行测序结果共发现了4个SNP位点及一个三碱基的缺失，对各基因型及等位基因在不同群体中出现的频率及相关性进行分析发现第四外显子的T/C突变导致三种基因型TT，TC和CC，其T等位基因在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体，第四外显子205bp处CC个体(缩写为E4-205CC个体)在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，第四外显子205bp处TT个体(缩写为E4-205TT个体)在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体；因此，将E4-205CC作为疾病敏感相关的C-型凝集素基因标记，将E4-205TT作为抗病相关的C-型凝集素基因标记。

在上述基础上，本发明使用Primer5.0软件设计扩增包含SNP T/C E4-205位点的引物，扩增片段为124bp，对其进行PCR扩增及HRM分析，建立SNP基因分型方法。

上述方法为用于三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关联的SNP基因分型的方法，基于高分辨率熔解曲线分析技术的PCR-HRM快速进行，具体包括下述步骤：(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的基因组DNA，全部样品统一为一个浓度；(2)供试样品模板DNA进行PCR扩增，引物F5和R5序列为F5：5’AAATGCCTACTGGAGGAGAGAAACA3’，R5：5’TTTCCTCGTTACTTCTCACAAATCG3’；(3)采用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并进行HRM分析，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线；(4)分析HRM结果，比较已知基因型样品和待测基因型样品的标准视图和差异视图，对待测样品进行SNP分型。

其中，所述步骤(3)PCR扩增程序为98℃预变性2min，40个扩增循环(98℃5sec，58℃20s)，HRM分析方法为温度从65℃逐渐升高至85℃，每次升温0.1℃，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线。

上述所用的荧光定量PCR仪为QiagenRotor-Gene6000(德国Qiagen公司)。

与传统技术相比，本发明采用功能基因组技术，以三疣梭子蟹为材料首次发掘了我国养殖蟹类抗病相关C-型凝集素基因标记，初步建立了HRM快速进行SNP基因分型的方法，该技术具有高通量、低成本、周期短等特点，为蟹类抗病品种的培育开辟了新的分子育种技术途径，对养殖蟹类抗病品种的选育具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为本发明三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列，其中灰色部分为外显子序列；

图2a、2b、2c为本发明鉴别的SNP T/C E4-205三种基因型测序峰图；

图3a、3b为SNP T/C E4-205位点的HRM判型图，分别为标准化溶解曲线视图，以TC基因型为对比的差异曲线图，包括TT，CC，TC；

图4a、4b为本发明实施例对不同样品DNA模板进行PCR扩增后检测的溶解曲线图(置信值阈值设置为90％)，分别为标准化溶解曲线视图，以TC基因型为对比的差异曲线图；

图5为基因分型report结果图，其中置信度为100％的三个样品为已知标准参考基因型。

具体实施方式

采用下述方法获得三疣梭子蟹C-型凝集素基因组DNA及抗病相关的分子标记：

(1)C-lectin DNA全长基因的克隆：根据已知的三疣梭子蟹C-型凝集素基因mRNA序列(序列号EU477491.1)，使用Primer5.0软件设计引物，F1：5’TCCTGTTCTGACAACCACCAA3’，R1：5’CTGTGCCCGAGTCAAGAAGTA3’，利用T IANampGenomic DNA纯化试剂盒提取三疣梭子蟹血液样品中的总基因组DNA，以此为模板，利用长片段PCR扩增基因组DNA获得序列，克隆至T载体后测序，获得1473bp的C-型凝集素基因组全长，其中包括四个外显子和3个内含子，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述，其中的外显子部分如图1框线部分所示；

(2)抗病群体和敏感群体的制备：采用人工感染的方法获得抗病群体和敏感群体，即用溶藻弧菌进行浸泡感染，根据死亡时间判断梭子蟹对病原菌感染的抵抗能力，将梭子蟹分为抗病群体和敏感群体，采集样品提取基因组模板备用；

(3)抗病相关C-型凝集素基因标记的筛选：对5个个体的15个克隆进行测序，发现了4个SNP位点及一个三碱基的缺失，分别为第二内含子309bp处T/A颠换；第三内含子89bp处A/C颠换；第三内含子101bp处A/G转换；第三内含子104bp处CAA的ins/del；第四外显子205bp处的T/C非同义SNP(内含子缩写为I，外显子缩写为E)。对包含SNP位点序列设计引物进行PCR扩增及直接测序获得33个敏感个体和33个抗病个体的序列峰图，并对各基因型及等位基因在不同群体中出现的频率及相关性做了分析，如下表所示：

分析表明除了第四外显子SNP外，其他几个SNP导致的两种基因型在样品中是连锁出现的，卡方检验其SNP在两种群体中差异显著，但等位基因差异不显著。而第四外显子导致的三种基因型TT，TC和CC(三种不同基因型峰图见图2)，其T等位基因在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体，E4-205CC个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，E4-205TT个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体；因此，将E4-205CC作为疾病敏感相关的C-型凝集素基因标记，而将E4-205TT作为抗病相关的C-型凝集素基因标记。

随机选取30个三疣梭子蟹样品，抽取血淋巴进行基因组制备，采用本发明的PCR-HRM方法进行基因分型，选取各已知的标准基因型为参考，样品的置信值阈值设置为90％以上，HRM分析后的PCR扩增产物直接测序进行验证，具体判型方法如附图3所示。

1、PCR-HRM引物：设计扩增包含SNP T/C E4-205位点的引物，扩增片段为124bp，引物核苷酸序列如下所示：

F5：5’AAATGCCTACTGGAGGAGAGAAACA3’

R5：5’TTTCCTCGTTACTTCTCACAAATCG3’；

2、血液样品基因组DNA的提取：利用TIANamp Genomic DNA纯化试剂盒提取血液样品中的基因组DNA

(1)取5-20μL三疣梭子蟹抗凝血，加缓冲液GA补足200μL后进行下面的裂解步骤。

(2)加入20μLProtinase K溶液，混匀。

(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(11)取上述DNA母液稀释20倍后于紫外分光光度计上测定浓度，根据浓度

稀释成20ng/μL工作液50-100μL至于4℃备用，其余母液置于-20℃储存。

3、PCR反应：反应体系为20μL

SsoFast EvaGreen supermix 10μL

HRM正向引物F1(10μmol/L) 0.8μL

HRM反向引物R1(10μmol/L) 0.8μL

基因组DNA(20ng/μL) 1μL

ddH2O 7.4μL

4、PCR扩增及HRM分析：

采用带有HRM分析功能的德国Qiagen公司Rotor-Gene6000荧光定量PCR仪，

PCR扩增程序为：98℃预变性2min，40个扩增循环(98℃5sec，58℃20s)，

HRM分析：温度从65℃逐渐升高至85℃，每次升温0.1℃，同时监测每一步的

荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线。删除扩增效果不好的样品，通过分析HRM结果，比较已知基因型样品和待测基因型样品的标准视图和差异视图，对待测样品进行SNP分型，在软件中的report中获得不同样品基因型的结果。标准视图及差异视图如附图4所示，report结果如附图5所示。

5、待测样品测序验证：HRM分析后PCR扩增产物送往测序公司测序验证，结果表明置信值阈值在90％以上的样品基因型，其测序符合率为100％。

Claims (10)

1.三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记，其特征在于该基因多态性标记包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4个SNP位点及一个三碱基的缺失，其中第四外显子205bp处的SNP与三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相关联，命名为T/C E4-205。

2.用于得到三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关的C-型凝集素分子标记的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)克隆三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列；(2)制备三疣梭子蟹的抗病群体和敏感群体；(3)筛选抗病相关C-型凝集素基因标记。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的总基因组DNA，设计引物，利用长片段PCR扩增基因组DNA获得序列，克隆至T载体后测序，获得全长的C-型凝集素基因组，该序列为序列表序列1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于扩增引物为F1、R1，序列为F1：5’TCCTGTTCTGACAACCACCAA3’；R1：5’CTGTGCCCGAGTCAAGAAGTA3’。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)采用溶藻弧菌对三疣梭子蟹进行浸泡感染，根据死亡时间判断梭子蟹对病原菌感染的抵抗能力，将梭子蟹分为抗病群体和敏感群体。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)对步骤(2)所得个体的克隆进行测序，得到四个SNP位点：分别位于第二内含子、第三内含子、第三内含子、第四外显子；对包含SNP位点序列设计引物扩增测序，并对各基因型及等位基因做相关性分析，将第四外显子205bp处CC作为疾病敏感相关的C-型凝集素基因标记，将第四外显子205bp处TT作为抗病相关的C-型凝集素基因标记。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于扩增SNP位点的引物分别为F2，R2；F3，R3；F4，R4，序列为F2：5’TCAAATCATTTCCTTGTGAGGG3’，R2：5’ACAAAAGGATGTCACCGTAGAA3’；F3：5’GCAATTCTACGGTGACATCCTT3’，R3：5’TTATCGCCATAGTTAGCCCAAA3’；F4：5’ACTCCTTTTTGGGCTAACTATGGC3’，R4：5’TCCAAAGTAAGCTGGTTAGCACAT3’。

8.用于三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关联的SNP基因分型的方法，其特征在于基于高分辨率熔解曲线分析技术的PCR-HRM快速进行，具体包括下述步骤：(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的基因组DNA，全部样品统一为一个浓度；(2)供试样品模板DNA进行PCR扩增，引物F5和R序列为F5：5’AAATGCCTACTGGAGGAGAGAAACA3’，R5：5’TTTCCTCGTTACTTCTCACAAATCG3’；(3)采用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并进行HRM分析，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线；(4)分析HRM结果，比较已知基因型样品和待测基因型样品的标准视图和差异视图，对待测样品进行SNP分型。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述步骤(3)PCR扩增程序为98℃预变性2min，40个扩增循环(98℃5sec，58℃20s)，HRM分析方法为温度从65℃逐渐升高至85℃，每次升温0.1℃，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线。

10.权利要求8的方法在选择三疣梭子蟹抗病基因型个体作为亲本培育三疣梭子蟹抗病品系中的应用。

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