CN105200160B - 一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的snp标记及其筛选和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用。该SNP标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列自5’端起第155位碱基A或G；该标记与凡纳滨对虾的耐低溶氧性状紧密相关，能有效应用于凡纳滨对虾的分子标记辅助育种。本发明还公开了用于检测或筛选该SNP标记的引物对。采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨对虾育种材料进行早期选择，有效提高育种的效率和准确性，从而能够准确、高效地选育出抗逆性强的凡纳滨对虾品种。本发明方法实用性强、适用性广。

Description

一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和 应用

技术领域

本发明涉及一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用，属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。

背景技术

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）也称南美白对虾，隶属节肢动物门，甲壳纲，十足目，为广温广盐性热带虾类。因其具有生长速度快、抗逆性强、适应高密度养殖、繁殖期长等特点，已成为我国最主要的对虾养殖品种。目前，我国凡纳滨对虾养殖主要以传统养殖模式为主。然而，随着养殖密度的不断加大，传统养殖到了养殖后期极易出现缺氧情况，从而影响对虾的生长、摄食和蜕皮，造成对虾免疫力、抗病力、消化力下降，出现生长缓慢、死亡率高等现象。因此，利用遗传育种技术培育耐低溶氧的凡纳滨对虾新品种是解决以上问题的有效办法。

遗传标记是指用来区分不同的个体或群体并且能稳定遗传的物质或性状。SNP是指基因组特定位置上一个碱基的变异，且任一种等位基因在种群中的发生频率高于1%，变异的形式包括转换、颠换、插入/缺失等。SNP作为第三代分子标记因其具有数量巨大、分布广泛、共显性、高度稳定、易于自动化规模分析、能显示其他技术无法检测的隐藏多态性、可能与基因功能相关的众多优点，在分子标记辅助育种中得到广泛应用。如今，SNP分子标记技术已广泛应用于凡纳滨对虾的遗传育种中，且多集中于凡纳滨对虾一些重要的功能基因的研究。例如，已有学者利用SNP分子标记技术对凡纳滨对虾AMY基因进行的单核苷酸多态性研究，发现在凡纳滨对虾AMY基因存在4个SNP位点，分别为AMY 基因第4外显子 109bp 处T→C的突变、第4内含子46bp 处T→C的突变、第5外显子123bp处C→T的突变和第6外显子81bp处C→T的突变，且这4个SNP位点均与凡纳滨对虾生长性状显著相关。也有学者研究了凡纳滨对虾的耐寒相关基因TCP-1-eta的多态性，对其与耐寒性状的关系进行关联分析，发现在TCP-1-eta基因中存在1个SNP位点（C731T），且该SNP位点与凡纳滨对虾的耐寒性状显著相关。此外，亦有关于对凡纳滨对虾的免疫相关基因进行SNP位点分析的报道。但未见有与凡纳滨对虾耐低溶氧性状相关的SNP分子标记的相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种与凡纳滨对虾耐低溶氧性状相关的分子标记，该分子标记可应用于凡纳滨对虾抗逆性状的分子标记辅助选择育种，能为进行耐低溶氧性状关联研究提供有用信息，有利于凡纳滨对虾耐低溶解氧性状的遗传改良。

本发明通过以下技术方案实现：一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记，该SNP 标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列自5’端起第155 位碱基A或G。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，所述引物对具体是引物CAT-FP和引物CAT-RP，是以凡纳滨对虾过氧化氢酶（CAT）基因mRNA（GenBank Accession NO.JX162772.1）序列为模板，利用Premier Primier 3.0软件设计所得。

所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：

（1）SEQ ID NO.2：CCCGATAACCTGACCACG；

（2）SEQ ID NO.3：TTCCCAATCTCACTGAACAAAG。

所述引物对用于对所述SNP标记所在的片段进行PCR 扩增，再通过测序，对该SNP标记进行检测，进而确定待测凡纳滨对虾该SNP标记位点的基因型。所述引物对还可以作为检测该SNP标记的试剂盒的组成之一。

本发明的第三个目的在于提供一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记的筛选方法，具体步骤如下：

（1）以经低溶氧胁迫96h实验后死亡和存活的凡纳滨对虾个体的基因组DNA为模板，利用本发明所述的引物对，即引物CAT-FP和引物CAT-RP进行PCR扩增，获得扩增片段；

（2）将步骤（1）获得的扩增片段进行测序，得到CAT基因部分序列以及测序峰图，并筛选出碱基突变位点，即SNP位点；

（3）利用chromas软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在某一碱基处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾低溶氧性耐受性与基因型间的相关性进行分析。

优选的，步骤（1）所述扩增片段的长度为554bp。

优选的，步骤（2）中，SNP检测采用直接测序法，对测序后得到的CAT基因部分序列进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点。

在上述技术方案中，所述步骤（1）中提取待测凡纳滨对虾的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。对基因组DNA进行PCR扩增的条件也不受特别限制，PCR扩增条件可以由本领域技术人员进行优化选择。

在上述技术方案中，所述步骤（2）所述测序具体可以是通过Taqman技术、直接测序、单链构象多态性聚合酶链式反应（PCR-SSCP）及限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）等技术进行测序，实现SNP标记的检测。

由于直接测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。该方法只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增得到的产物，通过测序即可直接检测到SNP位点。因此，本发明优选采用直接测序的方法进行SNP标记的检测。

经上述技术方案所述步骤获得的SNP位点在辅助耐低溶氧凡纳滨对虾选育过程的应用，具体方法是在凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP位点分型，结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，优先选择SNP位点为AG型的个体作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择SNP位点为GG的凡纳滨对虾作为亲本或者进行规模养殖。

本发明相对于现有技术的有益技术效果在于：

（1）经统计发现，本发明所述SNP标记的位点处基因型为AG的凡纳滨对虾的低溶氧耐受性显著高于基因型为纯合GG的凡纳滨对虾，进而，通过检测凡纳滨对虾的上述SNP位点，能够有效地确定其低溶氧的耐受性能；本发明的SNP标记与凡纳滨对虾的耐低溶氧性状紧密相关，能够有效用于凡纳滨对虾的分子标记辅助育种；

（2）采用本发明技术方案可根据实际育种需求对凡纳滨育种材料进行早期选择，有效提高育种的效率和准确性，提高凡纳滨对虾繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出抗逆性强的凡纳滨对虾品种；

（3）方法实用性强、基因组DNA提取、测序方法没有特定要求，适用性广。

附图说明

图1：实施例中有过氧化氢酶基因第155位点单倍型为AG峰值图。

图2：实施例中有过氧化氢酶基因第155位点单倍型为GG峰值图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例：本实施例通过对凡纳滨对虾过氧化氢酶（CAT）基因的部分序列进行测序和Clustal比对，筛查到了1个SNP位点，筛选的第155位SNP位点为AG型的凡纳滨对虾，其低溶氧的耐受性显著高于GG基因型个体。该SNP位点可通过直接测序法，在凡纳滨对虾群体中检测其位点多态性，并分析位点基因型频率与凡纳滨对虾低溶氧耐受性的相关性。在凡纳滨对虾的抗逆性状选择育种过程中，可针对该处SNP位点，优先选择AG型的个体作为育种亲本，以提高选种的效率。

凡纳滨对虾过氧化氢酶基因中SNP位点155A>G与低溶氧耐受性的相关性分析，按照下列步骤进行：

（A）凡纳滨对虾基因组DNA提取；本实施选择采用常规酚氯仿方法；

（B）凡纳滨对虾过氧化氢酶基因SNP位点筛查；

（C）位点155A>G分型；

（D）155A>G基因型与低溶氧耐受性性状的相关性分析；

（E）位点155A>G辅助凡纳滨对虾低溶氧耐受性品种的选育。

具体操作如下：

（A）凡纳滨对虾DNA提取。

取凡纳滨对虾肌肉约0.2g，加入400μL 1×TE裂解液剪碎，依次加入200μL 10%的SDS、8μL 蛋白酶K（20mg/mL），37℃裂解30min，再至于55℃消化至澄清透明，约1-2h；往澄清的裂解液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液，颠倒充分混匀，12000rpm/min离心20min；小心移取上清液至新的离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒充分混匀，离心15min，抽提2到3次；小心移取上清液至新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒充分混匀，放入-20℃冰箱内静置30min；12000rpm/min离心15min，弃上清，加入70%乙醇洗涤2-3次，每次离心2min，室温晾干，加入150μL1×TE Buffer保存。用1%琼脂糖凝胶检测样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。

（B）凡纳滨对虾过氧化氢酶基因SNP位点筛选。

利用NCBI中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因mRNA（GenBank AccessionNO.JX162772.1）序列，通过Premier Primier 3.0软件设计得到特异性引物对CAT-FP和CAT-RP。以经低溶氧胁迫96小时实验后死亡群体和存活群体凡纳滨对虾（44个）基因组DNA为模板，利用上述引物在PCR条件下进行扩增。PCR反应体系为25μL：DNA模板40ng，10×PCRBurrer（Mg²⁺ plus） 2.5μL，dNTP Mix 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，rTaq酶（5U/μL） 0.2μL。PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性45S，58℃退火45s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。将PCR产物直接送于上海生工进行测序。

（C）位点18A>G分型。

采用直接测序法对凡纳滨对虾进行SNP检测，在某一碱基处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子，将测序后的序列与Gene Bank中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因进行比对，得出突变纯合型。图1为本实施例中有过氧化氢酶基因第155位点单倍型为AG峰值图。图2为本实施例中有过氧化氢酶基因第155位点单倍型为GG峰值图。

（D）18A>G基因型与耐低溶氧性状的相关性分析。

统计经低溶氧胁迫实验96小时后死亡凡纳滨对虾个体（23个）和存活群体凡纳滨对虾个体（21个），共44个凡纳滨对虾个体分析位点155A>G基因型的情况。用SPSS19.0软件卡方检验方法分析位点155A>G与凡纳滨对虾低溶氧耐受性的相关性（如表1所示），最终确定位点155A>G为AG型的凡纳滨对虾其低溶氧的耐受性显著高于GG基因型个体。

表1 155A>G位点不同基因型频率

。

在耐低溶氧凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行位点155A>G分型，结合其他与抗逆性状相关位点的分型信息，优先选择位点155A>G为AG型的个体，作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择155位点为GG作为亲本或者进行规模养殖。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120>一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 554

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gggccccttt agttttgaac ggaagcttat tccctgactg taggtccaag gggccccatc 60

ctcctgcagg acattcagct ccttgatgag atggctcact tcgaccgtga gcgcatccca 120

gagagggttg tgcatgctaa gggagcaggt actagttgtt taattcttat aacttttttg 180

ttggtattgt catattacta ttatgatcat tatcactgtc aactttatct ttatcgttat 240

tgttattatt attgttatct ttatcattat cttaattttt attgctgccc tgaccaagtg 300

attagaatt ggtattataa gtagtgttta ttagtcctgt tatcaatatt agtatcgata 360

taattatgat gatatataga gagatgatac aaaggctaga gaactcaggc tgtgtgagtg 420

ggatcaggtg gtatgaaaca tgcagattgt tactaatgaa attcaatata tttacaggtg 480

cctttggtta ctttgaggta acacatgata tatccaagta ttgtaaggct gctttgttca 540

gtggaattgg gaaa 554

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cccgataacc tgaccacg 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ttcccaatct cactgaacaa ag 22

Claims (1)

1.一种辅助选育低溶氧耐受性凡纳滨对虾的方法，其特征在于：

（A）凡纳滨对虾DNA提取：取凡纳滨对虾肌肉0.2g，加入400μL 1×TE裂解液剪碎，依次加入200μL 10%的SDS、8μL 蛋白酶K 20mg/mL，37℃裂解30min，再置于55℃消化1-2h至澄清透明；往澄清的裂解液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇溶液，酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1，颠倒充分混匀，12000rpm离心20min；小心移取上清液至新的离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇体积比为24:1，颠倒充分混匀，离心15min，抽提2到3次；小心移取上清液至新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒充分混匀，放入-20℃冰箱内静置30min；12000rpm离心15min，弃上清，加入70%乙醇洗涤2-3次，每次离心2min，室温晾干，加入150μL1×TE Buffer保存；用1%琼脂糖凝胶检测样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度；

（B）利用NCBI中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因mRNA GenBank Accession NO.JX162772.1序列，通过Premier Primier 3.0软件设计得到特异性引物对CAT-FP和CAT-RP；以经低溶氧胁迫96小时实验后死亡群体和存活群体凡纳滨对虾44个基因组DNA为模板，利用上述引物在PCR条件下进行扩增；PCR反应体系为25μL：DNA模板40ng，10×Mg²⁺ plus PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mix 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，5U/μL rTaq酶0.2μL；PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性45S，58℃退火45s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；将PCR产物直接送进行测序；引物CAT-FP和CAT-RP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

（C）采用直接测序法对凡纳滨对虾进行SNP检测，在某一碱基处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子，将测序后的序列与GenBank中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因进行比对，得出突变纯合型；

（D）在耐低溶氧凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行位点155A>G分型，优先选择位点155A>G为AG型的个体，作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择155位点为GG作为亲本或者进行规模养殖。