CN112048014B

CN112048014B - 一种斑节对虾Pm GLUT2基因及其应用

Info

Publication number: CN112048014B
Application number: CN202010715938.7A
Authority: CN
Inventors: 李运东; 周发林; 江世贵; 何鹏
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN112048014A

Abstract

本发明公开了一种斑节对虾Pm GLUT2基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。还公开了上述基因或所述基因的编码蛋白在调节斑节对虾耐低盐胁迫方面的应用。以及一种斑节对虾Pm GLUT2基因耐低盐相关的SNP位点的筛选方法和上述方法筛选的斑节对虾耐低盐相关的SNP位点在斑节对虾育种方面的应用。

Description

一种斑节对虾Pm GLUT2基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种斑节对虾PmGLUT2基因及其应用。

背景技术

葡萄糖转运蛋白-2(GLUT2，glucose transporter 2)属于葡萄糖转运蛋白家族(GLUTs)，最早从人的肝脏和肾脏中被发现的，其在肝脏、肾脏、小肠中特异性表达，后来发现在胰岛β细胞中也大量特异性表达。对葡萄糖的低亲和性及高饱和度是GLUT2最显著的特征，其主要分布在肝脏、肾脏、小肠与胰岛B细胞的上皮细胞基膜侧，参与完成葡萄糖的吸收与转运。目前，关于GLUT2的研究多和钠-葡萄糖共转运蛋白一起与哺乳动物疾病相关，在水产动物中的研究较少。Terova等研究了欧洲狼鲈体内GLUT2的功能，结果表明，在缺氧条件下GLUT2可能发挥着将肝细胞中肝糖原降解形成的葡萄糖转运出去的功能；Hall等研究了大西洋鳕鱼中GLUT2在肝脏中的表达，他发现其表达量与血糖水平有关；有学者研究发现在虹鳟的肝脏、肠道及肾脏中也有发现GLUT2的存在；Martinez-Quintana等研究了GLUT2在凡纳滨对虾肝胰腺中的表达情况，结果表明，在缺氧条件下，GLUT2在肝胰腺中表达上调。

在斑节对虾中，还未见GLUT2的相关报道。盐度是影响水生动物生理代谢的重要环境因子。水体环境中盐度的变化会影响水生动物的生长、存活、繁殖、蜕壳、生理代谢、渗透调节等。水环境中的盐度在自然条件下会表现出明显的昼夜波动和季节性，此外，暴雨、台风等恶劣天气及养殖生产中的换水也会改变水体环境中的盐度，这种急性盐度胁迫容易引起对虾的应激反应，但目前对斑节对虾低盐胁迫的应答和低盐胁迫下代谢功能的研究尚不够深入，特别是低盐胁迫过程中起到物质转运作用的关键转运蛋白的研究仍较为缺乏。

因此，本申请利用RACE技术获得斑节对GLUT2的cDNA序列全长，分析了其在斑节对虾幼体发育、不同组织、蜕皮各期及在低盐胁迫过程中的表达模式，希望能为解析斑节对虾低盐胁迫应答的调控机理提供基础数据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种斑节对虾PmGLUT2基因及其编码蛋白。

本发明的目的还在于提供上述基因或编码蛋白在调节斑节对虾耐低盐胁迫方面的应用。

本发明的最后一个目的在于提供一种斑节对虾PmGLUT2基因耐低盐相关的SNP位点的筛选方法。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斑节对虾PmGLUT2基因，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的斑节对虾Pm GLUT2基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

所述PmGLUT2基因的全长2018bp，5’非编码区(UTR)94bp，3’UTR 352bp，包括29个碱基的poly(A)尾，开放阅读框(ORF)1572bp，可编码523个氨基酸，ExPASyProtParam预测其分子量为56.568kD，理论等电点为4.96。

所述斑节对虾PmGLUT2基因的克隆方法，包括以下步骤：首先提取斑节对虾不同离体组织的总RNA，合成cDNA第一条链，用做RACE模板，并将斑节对虾不同离体组织的总RNA反转录，用作荧光定量PCR样品；然后根据斑节对虾cDNA文库中的EST序列，设计PmGLUT2基因ORF的引物和RACE引物，即得到斑节对虾PmGLUT2基因的全长。

所述PmGLUT2基因ORF的引物包括qPCR引物Pm GLUT2和内参引物PmEF-1α，其中所述qPCR引物Pm GLUT2包括Pm GLUT2-qF和Pm GLUT2-qR，其碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示，所述内参引物PmEF-1α包括PmEF-1α-qF和PmEF-1α-qR，其碱基序列如SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7所示；所述RACE引物包括Pm GLUT2-5’GSP1-1、Pm GLUT2-5’GSP2-1、PmGLUT2-5’GSP1-2、Pm GLUT2-5’GSP2-2、Pm GLUT2-3’GSP1-1、Pm GLUT2-3’GSP2-1、PmGLUT2-3’GSP1-2和Pm GLUT2-3’GSP2-2，其碱基序列分别如SEQ ID NO：8～15所示。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的基因或上述基因的编码蛋白在调节斑节对虾耐低盐胁迫方面的应用。

优选的，低盐的浓度范围通常在5以下，更佳的，低盐度为3。

本发明的上述最后一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斑节对虾PmGLUT2基因耐低盐相关的SNP位点的筛选方法，包括以下步骤：

(1)样品选择：选择非洲野生群体，泰国野生群体和中国三亚野生群体作为SNP位点筛选样品，选择耐低盐极端群体以及低盐敏感群体作为SNP分型样品，并选取标粗池中混养的各家系幼虾为实验材料，使用不同颜色的荧光在虾尾进行标记以区分各家系；

(2)斑节对虾PmGLUT2基因组序列的扩增：通过RACE技术克隆得到的斑节对虾PmGLUT2基因的cDNA，然后使用cDNA序列设计特异性引物，使用特异性引物进行PCR扩增，得到斑节对虾PmGLUT2基因组序列；

(3)重测序与SNP位点的初筛：提取非洲野生群体、泰国野生群体、三亚野生群体与耐氨氮极端群体的DNA，采用步骤(2)中的特异性引物使用直接测序法初步筛选PmGLUT2上的SNP位点；

(4)斑节对虾GLUT2基因的SNP位点的分型：将挑选好的SNP位点使用直接测序法进行SNP位点的分型，分型使用的样品为耐低盐极端群体以及低盐敏感群体；

(5)GLUT2基因组序列的扩增，重测序及SNP位点的分型：以混合的斑节对虾DNA为模板，通过扩增得到Pm GLUT2基因组序列，以非洲、泰国、三亚三个野生群体的DNA为模板，通过直接测序法在得到的斑节对虾Pm GLUT2基因区域2837bp上共筛选得到28个SNP位点；

(6)斑节对虾PmGLUT2基因与抗氨氮性状关联分析：在扩增得到的斑节对虾PmGLUT2基因上筛选得到的28个SNP中，进行分型，并且在两个耐低盐极端群体中与耐低盐性状进行关联分析，获取耐低盐位点。

其中步骤(1)中所述的特异性引物包括GLUT2-1F、GLUT2-1R、GLUT2-2F、GLUT2-2R、GLUT2-3F和GLUT2-3R，其碱基序列分别如SEQ ID NO：16～21所示。

具体的碱基序列如下：

GLUT2-1F：GAACTCGTTTTTCTCATCATCCA

GLUT2-1R：ACAGGCCAGCAAGCATCTG

GLUT2-2F：GCAACCCTTTTGGCAACAG

GLUT2-2R：GGCATCCTGAAGAGGCACA

GLUT2-3F：ATCAACAATCTCAGACAGCATC

GLUT2-3R：GCCAGTCAACAACATTTAGAAC。

本发明还提供了上述筛选的斑节对虾PmGLUT2基因耐低盐相关的SNP位点在斑节对虾育种方面的应用，所述的SNP位点与斑节对虾耐低盐相关，与所述斑节对虾PmGLUT2基因紧密连锁，位于SEQ ID NO：1所示斑节对虾PmGLUT2参考基因序列的第1488上(PmGLUT21488)，该位点突变为A/T，所述应用指采用所述SNP位点筛选在位于斑节对虾PmGLUT2参考基因组第1448的位点上具有A/T突变的的斑节对虾。

本发明具有以下优点：

(1)本发明针对斑节对虾的葡萄糖转运蛋白-2(PmGLUT2)基因特征，设计出特异性引物，可以从基因组组准确克隆获得基因序列，并通过荧光定量PCR手段检测了PmGLUT2基因在各个组织中的表达特征，并进一步分析了基因在蜕皮各期、幼体发育各期的表达变化趋势，表明葡萄糖转运蛋白-2基因在斑节对虾的蜕皮和幼体发育中均发挥了重要作用。

(2)针对在低盐度下作用，本发明检测了肝胰腺、肠和鳃三个组织在盐度为3的低盐度下的表达特征，葡萄糖转运蛋白-2基因在低盐度胁迫过程中具有显著的表达差异，暗示了该基因在低盐度下具有盐度响应和免疫调节等方面的功能；

(3)本发明还设计了快速筛选PmGLUT2基因SNP的实验方法和引物，可以很好检测出基因在不用地理群体中的突变位置，为耐低盐新品种的选育提供了重要的分子标记。

附图说明

图1是实施例1中凡纳滨对虾GLUT2与斑节对虾GLUT2三维结构空间示意图；

图2是实施例1中PmGLUT2氨基酸序列与LvGLUT2氨基酸多重序列比对；

图3是实施例1中利用MEGA6.06软件基于NJ法构建的PmGLUT2系统进化树；

图4是实施例1中斑节对虾幼体不同发育阶段PmGLUT2基因的相对表达量；

图5是实施例1中PmGLUT2在各组织的相对表达量；

图6是实施例1中斑节对虾蜕皮各期PmGLUT2基因在鳃中的相对表达量；

图7是实施例1中斑节对虾在急性低盐胁迫过程中肝胰腺、鳃和肠PmGLUT2的相对表达量；

图8是实施例1中PmGLUT2扩增片段1％凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

一、实验过程

1.1、实验动物

斑节对虾取自南海水产研究所深圳试验基地，选取体长为8±2cm、体质量为10±2g的对虾暂养于自然海水的水泥池(4.71m×4.13m×1.73m，养殖水体体积为5.84m³)，并充分曝气，养殖温度为27±2℃。

1.2、总RNA的提取及cDNA文库的构建

从暂养的对虾中随机选取健康完整的雌雄对虾各3尾，分别取其肝胰腺、鳃、心脏、肠、胃、淋巴、表皮、肌肉、眼柄神经、卵巢、精巢等组织样品，来自3尾虾的同类样品混合成一管，置于RNAlater中4℃保存过夜后置于-80℃保存备用。

按照HiPure Fibrous RNA Plus Kit试剂盒说明书的方法提取所有样品的总RNA。10×Loading Buffer与RNA按1:5比例混合，核酸电泳仪设置“150V，15min”，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳实验，检测总RNA的纯度。同时用核酸定量分析系统NanoDrop 2000检测RNA的完整性。若电泳结果显示RNA样品28s和18s两条带清晰且无明显拖带，NanoDrop 2000检测260nm/280nm的比值在1.8-2.0之间，说明提取的总RNA质量较好，可用于cDNA文库的构建及后续3’和5’RACE模板的制作。按照PrimeScript^TMⅡReverse Transcriptase Kit试剂盒提供的方法构建上述各组织总RNA的cDNA文库。实验完成后将从不同组织获得的cDNA适当稀释后保存于-80℃备用。

1.3、PmGLUT2的cDNA克隆

从本实验室斑节对虾转录组文库中获得EST序列，使用Primer5.0软件设计验证PmGLUT2基因ORF的引物和RACE引物(表1)，初步命名为glucose transporter 2(简称PmGLUT2基因)。

表1本实施例中采用的引物和引物序列

总反应体系为25μL：2.5μL Ex Taq Buffer，1μL Ex Taq,2.0ul dNTP、1μL cDNA,1μL的上游引物和1μL的下游引物，双蒸水补足至25μL。

PCR程序如下：

1.4、生物信息学分析

利用DNAMAN 8软件对测序序列进行拼接，获得PmGLUT2基因全长。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找开放阅读框。利用EMBOSS(http://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/)预测氨基酸序列。利用NCBI中BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具对预测的氨基酸序列与蛋白质数据库进行相似性比对分析。利用Clustal X软件进行多重序列比对。利用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)统计各种氨基酸含量、预测等电点和理论分子质量。利用SMART 4.0(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？GENOMIC＝1)进行蛋白结构域分析。利用NetNGlyc 1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测糖基化位点。利用NetPhos 3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点。三级结构预测利用SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)，构建系统进化树利用Clustal X软件和MEGA 6.0软件。

1.5、幼体发育期的取样

在南海水产研究所深圳基地斑节对虾夏季繁育过程中采集其幼体发育各期的样品(取3组平行样品)，包括受精卵(Z)、无节幼体(N)、溞状幼体Ⅰ期(Z1)、溞状幼体Ⅱ期(Z2)、溞状幼体Ⅲ期(Z3)、糠虾幼体Ⅰ期(M1)、糠虾幼体Ⅱ期(M2)、糠虾幼体Ⅲ期(M3)、仔虾期(P)。斑节对虾幼体发育分期参照《斑节对虾种虾繁育技术》[98]。样品置于RNAlater Solution中4℃保存过夜后置于–80℃保存。

1.6、低盐胁迫实验取样

从暂养池中随机选取健康、无损伤的对虾360尾为实验材料。实验设2组，分别为盐度30(对照组)；盐度3(实验组)。每组设3个平行，每个平行1个500L塑料桶，并在其中加入300L不同盐度的海水，各放60尾虾，养殖温度为28±2℃，pH为7.0±0.5。实验期间每3h捞取每个塑料桶的死虾，并做好记录。实验中的盐度浓度由养殖用的海水与淡水混合，并利用盐度测试仪(AZ8371，台湾衡欣)调节到目标盐度。样品采集分为两个部分：

1.6.1、荧光定量qPCR样品

在对照组桶中选取3尾活力较好处于蜕皮间期的个体，分别取其鳃组织和肝胰腺组织，将同类组织混合均匀保存于RNAlate Solution中；分别于第3、6、12、24、48、72、96小时在盐度3的塑料桶中选取3尾活力较好处于蜕皮间期的个体，取与对照组相同的组织混合均匀保存于RNAlater Solution中，4℃过夜后保存于-80℃。

1.6.2、HE切片样品

在对照组桶中选取3尾活力较好处于蜕皮间期的个体，取其无损伤、结构完整的鳃组织3份，分别置于Davision氏固定液中固定，24小时后倒出固定液，换成75％乙醇保存备用。在低盐胁迫的第24、48、96小时，以同样的方法各取鳃组织3份。

1.7、实时荧光定量PCR模板的制备

利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书的方法进行RNA逆转录，得到实时荧光定量的模板，适当稀释后保存于-80℃备用。

1.8、组织差异表达分析

于PmGLUT1基因表达分析的荧光定量引物PmGLUT1-qPCR-F/R利用BeaconDesigner 7.0软件设计，内参基因使用EF-1α-F/R(elongation factor 1α，GenBank号为DQ021452)。以斑节对虾幼体发育各期、各组织及蜕皮各期的cDNA为模板，利用Roche

480II(Roche)进行实时荧光定量RT-PCR扩增。反应体系为12.5μL，包括5.25μLTB GreenTM Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)，0.5μL上下游引物，1μL模板cDNA(约40ng)，ddH2O补足至12.5μL，每个样品设3个重复和内参对照，并设置阴性和阳性对照，反应程序为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃5s；60℃1min升至95℃；50℃8min。实时荧光定量PCR数据使用相对CT法(2–ΔΔCt)进行分析，利用统计学分析软件SPSS 24.0对实验结果进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析，并计算差异显著性(Turkey)，P<0.05表示差异显著。

二、实验结果

2.1 PmGLUT2序列分析

通过克隆获得PmGLUT2 cDNA全长，PmGLUT2全长2018bp(如SEQ ID NO：1所示)，5’非编码区(UTR)94bp，3’UTR 352bp，包括29个碱基的poly(A)尾，开放阅读框(ORF)1572bp(SEQ ID NO：2所示)，可编码523个氨基酸(SEQ ID NO：3所示)。ExPASyProtParam预测其分子量为56.568kD，理论等电点为4.96。NetPhos 3.1 Server预测其含有55个磷酸化位点(其中37个丝氨酸位点，15个苏氨酸位点，3个酪氨酸位点)，NetNGlyc 1.0Server预测其含有4个N-糖基化位点，SignalP-5.0预测该序列不含信号肽。SMART 4.0预测PmGLUT2存在12个跨膜结构域，含有一个葡萄糖(及其他小分子碳水化合物)转运功能结构域，位于54～506aa。

具体如下所示：

2.2同源性分析

将PmGLUT2的氨基酸序列在NCBI上BLAST比对，发现其与凡纳滨对虾的GLUT2氨基酸序列具有较高的同源性。利用SWISS-MODEL构建了该蛋白的三维结构，其三维结构与凡纳滨对虾GLUT2的三维结构较相近(见图1)。利用Clustal X软件将NCBI上检索到的凡纳滨对虾GLUT2氨基酸序列与PmGLUT2氨基酸序列进行多重序列比对，结果发现，斑节对虾与凡纳滨对虾(AIT97017.1)的GLUT2较为保守，同源性达到60.54％(见图2)。利用MEGA6.06软件，基于NJ(Neighbor-Joining)法采用Bootstrap method重复计算1000次构建了PmGLUT2和其他物种的系统进化树(见图3)。其中斑节对虾的GLUT2和与凡纳滨对虾促海藻糖转运体Tret1独立聚为一支，然后与凡纳滨对虾GLUT2聚类，最后与脊椎动物聚为一支。

2.3 PmGLUT2在幼体发育过程中的表达分析

选择EF-1α作为内参，利用qRT-PCR技术对PmGLUT2在斑节对虾幼体发育各期中的表达进行检测。PmGLUT2在斑节对虾幼体发育各期的表达情况见图4。从受精卵到仔虾期，PmGLUT2的表达量呈先下降再上升的趋势，但无显著性差异。

2.4 PmGLUT2组织表达分析

选择EF-1α作为内参，利用qRT-PCR技术对PmGLUT2在斑节对虾各组织中的表达进行检测。PmGLUT2在斑节对虾的各组织中均有表达(见图5)，在淋巴组织中表达量最高，其次在鳃组织中表达量较高，约是肌肉中表达量的12倍，而在肌肉及卵巢中的表达量较低。

2.5 PmGLUT2在蜕皮各期的表达分析

选择EF-1α作为内参，利用qRT-PCR技术对PmGLUT2在斑节对虾蜕皮各期中的表达进行检测，表达情况见图6。PmGLUT2在肝胰腺中的表达量在蜕皮前期最高，蜕皮间期表达量最低；在鳃中的表达量在蜕皮间期最高，与蜕皮前期、蜕皮期、蜕皮后期差异显著(P<0.05)；在肠中的表达量在蜕皮间期最高，蜕皮前期最低，然后表达量逐渐升高。

2.6 PmGLUT2在盐度胁迫下的表达分析

选择EF-1α作为内参，利用qRT-PCR技术研究了PmGLUT2在斑节对虾盐度胁迫各时期肝胰腺、鳃和肠组织中相对表达量的变化。在低盐度的急性胁迫组实验中，PmGLUT2在肝胰腺、鳃和肠组织中的表达情况见图7，PmGLUT2在肝胰腺中的表达量在第3小时明显下降，与对照组差异显著(P<0.05)，至第72小时仍维持较低的表达量，随后在第96小时表达量上升，与对照组无明显差异；PmGLUT2在鳃中的表达量在第3小时明显下降，与对照组差异显著(P<0.05)，随后表达量一直维持在较低水平波动，且无显著性差异；在盐度3的低盐度胁迫下PmGLUT2在肠中的表达量在前24小时无明显变化，在第48小时和第72小时表达量显著升高(P<0.05)，随后在第96小时表达量下降，与对照组无明显差异。

2.7、结论

本申请成功克隆了斑节对虾GLUT2基因，通过对氨基酸序列分析表明其有12个跨膜结构域，N端与C端都位于质膜侧，且具有葡萄糖转运蛋白家族特征结构域：糖类(及其他小分子碳水化合物)转运功能结构域。经多重比对发现，PmGLUT2与其他物种的GLUT2具有较高的相似性，与凡纳滨对虾GLUT2的同源性最高(60.54％)，说明GLUT2在不同物种间较为保守。

PmGLUT2在斑节对虾幼体发育过程中，表达量呈下降趋势，至仔虾期才有所回升，但各时期PmGLUT2表达量普遍偏低，可能是因为无节幼体期营养全部来自于卵黄，幼体不具备完善的消化吸收系统，无法摄食，葡萄糖的吸收与转运较少。至仔虾期，消化器官逐渐发育完整，开始摄食底栖生物，开始从食物中获取葡萄糖等小分子碳水化合物，所以表达量开始升高。

通过对PmGLUT2在各组织中的表达分析发现，它在不同组织中均有表达。PmGLUT2在淋巴、鳃、胃和肠中表达量较高，说明葡萄糖转运在这几个组织中的转运或者吸收比较活跃。淋巴是对虾的免疫组织，鳃是与外界环境进行气体交换、离子转运及排泄的组织，胃和肠是消化与吸收的组织，淋巴与鳃都离不开葡萄糖的转运来提供能量，胃和肠是葡萄糖吸收的主要场所。

为了验证PmGLUT2与斑节对虾的蜕皮有关，选取了肝胰腺、鳃和肠进行蜕皮表达分析，结果显示，PmGLUT2在肝胰腺中的表达量在蜕皮前期最高，鳃和肠中蜕皮间期表达量最高，蜕皮间期是对虾快速生长、摄食的阶段，活动量大，呼吸排泄，消化吸收旺盛，因此鳃和肠在此阶段表达量高。肠在蜕皮期时，表达量有上升的趋势，可能与围食膜修复供能有关。

从急性低盐胁迫实验结果可以看出，PmGLUT2在肝胰腺和鳃中的表达量均受到抑制，在肠中的表达量后期有升高的趋势，GLUT2的主要功能是葡萄糖的吸收与转运，可能是在急性低盐胁迫下，斑节对虾受到应激导致停止摄食，从而使PmGLUT2的表达量受到抑制。有研究认为对虾在盐度变化下，短时间内对虾的免疫力显著下降，然后会缓慢恢复，对虾对盐度的变化有一定的免疫调节适应能力，且有明显的时间(3d)规律性。GLUT2在肝胰腺和肠中的表达量分别在第72小时和第48小时有上升的趋势，可能与其适应低盐的免疫调节有关。即低盐胁迫下，PmGLUT2对盐度胁迫有响应，会参与到对虾的盐度、免疫等过程的调节。

三、PmGLUT2 SNP位点的筛选与分析

3.1实验材料

3.1.1实验动物

本实验中SNP筛选所使用的不同地理群体的野生斑节对虾样品采集于三个不同地方：

样品名称	来源	取样数
			三亚群体Sanya stock	中国海南三亚海域	8
泰国群体Thailand stock	泰国普吉岛海域	8
			非洲群体African stock	非洲南部莫桑比克海域	8

本实验中SNP分型所使用的斑节对虾样品来自南海水产研究所深圳基地斑节对虾遗传育种中心的混合家系，通过96h急性盐度胁迫实验来挑选耐低盐最强的群体与耐低盐最弱的群体，各取60尾用于后续SNP分型实验。96h急性盐度胁迫实验于南海所深圳基地进行，实验所用混养对虾为(4±1)cm的幼虾，共1500尾。

首先进行预实验以确定本次实验所用的盐度胁迫浓度，实验中的盐度浓度由养殖用的海水与淡水混合，并利用盐度计(AZ8371)调节到目标盐度(3ppt)。正式实验在室内车间水泥池(4.71m×4.13m×1.73m)进行，养殖温度为(29±2)℃，pH为7.0±0.5。实验开始后，每隔1h统计一次死虾数量，并捞取死虾。取最先死亡的100尾虾为耐低盐最弱群体，最后100尾没有死亡的虾为耐低盐最强群体，分别用酒精保存之后用于DNA提取。

3.2实验方法

3.2.1基因组DNA的提取

在获得三个不同地理群体的样品及取完用于SNP分型的样品后，通过HiPureTissue DNA Mini Kit试剂盒的方法抽提出基因组DNA。然后将10×Loading Buffer与DNA按1:5比例混合，核酸电泳仪设置“150V，15min”，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳实验，检测基因组DNA的完整性。若条带清晰且无明显拖带，说明提取的基因组DNA质量较好，保存于-20℃用于后续实验。

3.2.2 PmGLUT2基因组序列的扩增

由得到PmGLUT2的cDNA序列全长2018bp，开放阅读框1572bp。根据已有序列在NCBI中查询相近物种GLUT2的基因组序列或结构。利用Primer Premier 5.0在该基因cDNA序列上设计引物，以斑节对虾基因组DNA为模板尝试扩增内含子序列以得到PmGLUT2的基因组序列。尽量避免跨外显子设计引物，该因素致使引物扩增失败率极高。成功扩增PmGLUT2基因组部分序列所用引物如表2所示，部分扩增序列如图8所示。

表2实验中所需引物信息

引物名称	序列(5'-3')	Tm(℃)	用途
				PmGLUT2-1F	GAACTCGTTTTTCTCATCATCCA(SEQ ID NO：16)	58.7	内含子扩增
PmGLUT2-1R	ACAGGCCAGCAAGCATCTG(SEQ ID NO：17)	59.2	内含子扩增
				PmGLUT2-2F	GCAACCCTTTTGGCAACAG(SEQ ID NO：18)	58.9	内含子扩增
PmGLUT2-2R	GGCATCCTGAAGAGGCACA(SEQ ID NO：19)	58.8	内含子扩增
				PmGLUT2-3F	ATCAACAATCTCAGACAGCATC(SEQ ID NO：20)	54.0	SNP分型
PmGLUT2-3R	GCCAGTCAACAACATTTAGAAC(SEQ ID NO：21)	54.0	SNP分型

3.2.3 PmGLUT2 SNP位点的筛选

通过直接测序法筛选SNP位点：从上述提取的三亚、泰国、非洲3个地理群体的DNA中各随机选取8个样品作为模板，用表3-3中的引物来进行扩增，然后用1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增效率，将有效的PCR产物直接送至广州睿博兴科分公司进行测序。测序结果用Sequencher 4.1.4软件来进行比对筛得SNP位点。

3.2.4 PmGLUT2 SNP位点的分型和关联分析

挑选较好的SNP位点使用直接测序法来进行分型，分型样品即耐低盐极端群体样品各60个。根据两个耐低盐极端群体的SNP分型结果，利用PLINK软件进行SNP位点与耐低盐性状的相关性分析。

3.3实验结果

3.3.1 PmGLUT2基因组序列的扩增及SNP位点的筛选

目前通过两个引物扩增测序得到PmGLUT2序列2837bp，其中包含4个完整的内含子，内含子详细信息见表3。从得到的这两段序列共筛选到28个SNP位点，其中转换17个，颠换10个，缺失位点1个。其中每个位点上的一种等位基因在群体中的频率均不小于1％。

表3 PmGLUT2内含子详细信息

内含子名称	位置(从起始密码子开始))	大小
			内含子1	458	208bp
内含子2	795	118bp
			内含子3	1471	211bp
内含子4	1826	267bp

3.3.2 PmGLUT2 SNP位点的分型

在所得到的28个SNP位点中，挑选适合设计引物分型，质量较好的位点来进行群体样品的分型检测。最终挑选了PmGLUT2 1488、PmGLUT2 1489、PmGLUT2 1616、PmGLUT2 1618、PmGLUT2 1678、PmGLUT2 1734六个位点来分型检测，其详细位点信息如表4。

表4 PmGLUT1 SNP位点

位点SNP ID	位置(从密码子开始)	等位基因	类型	氨基酸	突变类型
						PmGLUT2 1488	1488	ATA/ATT	颠换	I	S
PmGLUT2 1489	1489	GTT/TTT	颠换	V/F	NS
						PmGLUT2 1616	1616	ACA/ATA	转换	T/I	NS
PmGLUT2 1618	1618	AGT/GGT	转换	S/G	NS
						PmGLUT21678	1678	ACA/GCA	转换	T/A	NS
PmGLUT2 1734	1734	GTG/GTT	颠换	V	S

3.3.3 PmGLUT2 SNP位点与耐低盐性状的关联分析

在两个斑节对虾耐低盐极端群体中进行PmGLUT2 1488、PmGLUT2 1489、PmGLUT21616、PmGLUT2 1618、PmGLUT2 1678与PmGLUT2 1734六个位点的分型，使用PLINK软件对六个SNP位点与斑节对虾的耐低盐性状进行关联分析，结果如表5。结果显示，这六个位点的基因频率在耐低盐和不耐低盐两个极端群体中的差异都不显著(P>0.05)。

表5 PmGLUT2 SNP位点与耐低盐性状关联分析

3.4结论

本申请采用直接测序法在部分PmGLUT2基因组序列上筛选到了28个SNP位点，其中每个位点的等位基因频率均大于单核苷酸多态性的最低标准1％。有研究认为转换与颠换之间的比值约为2:1，原因可能是CG中的胞嘧啶易被甲基化而自发脱去氨基形成胸腺嘧啶，本申请筛得的28个SNP位点中转换类型约占2/3，与此研究相似。从中挑选了6个质量较好的位点，其中三个位点是颠换，三个位点是转换，且其中两个是同义突变，四个是非同义突变。已有研究表明，在基因组(尤其编码区)中由于生物体进化具有消除有害突变的机制，非同义突变往往远远小于同义突变。非同义突变往往会改变编码的蛋白质，从而影响蛋白功能及表型，目前已发现很多与生长、免疫抗逆等相关的位点。一直以来，同义突变都被认为只影响基因的基因型，但近年来有研究表明，同义突变虽不改变编码的氨基酸，但可以影响翻译效率、mRNA的稳定性及蛋白拼接等来影响蛋白表达，从而对表型产生影响。

通过直接测序法进行了PmGLUT2 1488、PmGLUT2 1489、PmGLUT2 1616、PmGLUT21618、PmGLUT2 1678、PmGLUT2 1734六个位点的分型。直接测序法是通过PCR扩增产物的测序结果来发掘SNP位点的，它具有高通量、检测准确、操作简单等优点，适合小量SNP的检测分型。Ciobanu等利用直接测序技术将凡纳滨对虾、斑节对虾以及日本囊对虾的基因组序列进行对比分析，最终在凡纳滨对虾基因组中筛选出了1221个候选SNP，并挑选了211个SNP位点进行分型验证。通过急性盐度胁迫实验来筛选耐低盐极端群体，并通过PLINK将这六个位点与进行关联分析，结果显示，PmGLUT2 1488位点这个位点在两个极端群体中差异显著(P＜0.05)。PmGLUT2 1488位点为A时对低盐度的耐受性增强，位点为T时，耐低盐能力较弱。因此PmGLUT2 1488位点可以作为耐低盐良种选育中的分子标记，将有利于提高人工选择育种的效率。

鉴于本实验中选取的极端个体数量有限，受群体样本数量限制，因此目前开发的这批SNP位点未来可以进一步在大规模的群体中检测分型，该结果为分子标记的开发提供了一批有价值的遗传标记，对于对虾的耐低盐分子标记辅助选育具有重要意义。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种斑节对虾Pm GLUT2基因及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2018

<212> DNA

<213> 葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter 2)

<400> 1

agcttagtgt aaaacactat aagagaagaa agaagaactt gaagcatgat agtgtgaacg 60

tgtttatata aggcattggg cagagagata aatcatggcc gtgagtgagg atgatgggga 120

atggagcccc tgggagaagg aggaggagga cccagaggag agtcagcctc tcatcccatc 180

agaacaagtc cctggtcagg ctgatagtgt aaaccgcagc atggagagcc atcggtcatc 240

atctcccatc ctgggaagga cctcaccttc caaaaaggtg caatacttca cagccttctc 300

agccaccatg ggagcactgg caatggggac agtactaggg tactcctctc ctgcagggcc 360

cttgttgatg tccaatgcaa ctgcagggcc agtgcatctt actaaggccc agaactcgtt 420

tttctcatca tccatgaatc ttggtgcact ggctggtggt cccattgggg gtgtctgcct 480

caataagctt gggagaagag ggacgatgct gacttctgtg gtgccgtttg ttggtggctg 540

gctttttatt gcttttgctc agaattttgc catgttgatg actggccgta ttattactgg 600

cttctgtgca ggaatcactt cattggttgt cccaacgtac attggagaat ttgcctcacc 660

tgatataaga ggcactcttg gaagtggatt ccagttaatg gttacaattg gtgtcgtgta 720

ttcttatgcc attggagctg ttgtgaagac atggcagatg cttgctggcc tgtgcattat 780

tccagttttg atctactttg taatggtctt ctttgccaaa gaatctccaa attttctact 840

ctcaaaagga aaactggata aagctacgga atcattacag tactttagag ggaaggacta 900

caatatccag acagaactga acatgttgca gcagtcagtg gaggatgcaa agcgcaacaa 960

ggcttcattt agggatcttc taaaaccata catcttgaag ccacttttga tctccctcac 1020

tctgatgttc ttccaacagt attcaggagt gaacccagtt cttttcaatc tcaccaccat 1080

ctttgaagac tcaggatcaa caatctcaga cagcatcagt tccataacca ttggtgttgt 1140

gcaagttctg gcaacccttt tggcaacagt gctcatggac aaagcaggga gaaaactcct 1200

gctgattgtt tctgcttcca tgatggctct ttctctcact gcacttgggg aattcttcta 1260

tgagaaaatg gaggatgagg tatgggcagt ggaaacctta ggctggctgc ctttggcatc 1320

actaattatc tttattgctg ccttctcaat tggttatggc cccattccgt ggctgatgat 1380

gggagagctt ttctccccta atgtgaagga agctgcagct ggtctagcaa ctatggtcaa 1440

ttggaccctg tcgttcagca taactctgat atttgtgcct cttcaggatg ccattagtga 1500

ctttggtgtc tactggctgt ttgcaggagt gtgtgtactc aatctcatat tctctgtgac 1560

agtagtccct gagacaaagg gcaagacact ggaagaaata tcagcctatt ttggtgggcc 1620

agtagtttcc agtgactcac accctagtcg tgaaagtgat gcatgagcgt gaagaagtta 1680

tcattatttt taaattttga atttataatt gtcccatgaa atactgtaga aaattattaa 1740

gatagagaag tgcatgctag attcttaggg aataaattaa tatagagcat ttaattcatt 1800

cctaaacttg atgatttggt gtatgtcata tatgtgggtt ttcatttgca ccatttatgt 1860

gtgatctgca tcactattta gattgttttt ttcttgattg tttgatttac aaggttgtga 1920

ctgatagaaa tatcaattaa attcttattt gttgatgaca gatgatctga taaactttgg 1980

tcccacctta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2018

<210> 2

<211> 1572

<212> DNA

<213> 葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter 2)

<400> 2

atggccgtga gtgaggatga tggggaatgg agcccctggg agaaggagga ggaggaccca 60

gaggagagtc agcctctcat cccatcagaa caagtccctg gtcaggctga tagtgtaaac 120

cgcagcatgg agagccatcg gtcatcatct cccatcctgg gaaggacctc accttccaaa 180

aaggtgcaat acttcacagc cttctcagcc accatgggag cactggcaat ggggacagta 240

ctagggtact cctctcctgc agggcccttg ttgatgtcca atgcaactgc agggccagtg 300

catcttacta aggcccagaa ctcgtttttc tcatcatcca tgaatcttgg tgcactggct 360

ggtggtccca ttgggggtgt ctgcctcaat aagcttggga gaagagggac gatgctgact 420

tctgtggtgc cgtttgttgg tggctggctt tttattgctt ttgctcagaa ttttgccatg 480

ttgatgactg gccgtattat tactggcttc tgtgcaggaa tcacttcatt ggttgtccca 540

acgtacattg gagaatttgc ctcacctgat ataagaggca ctcttggaag tggattccag 600

ttaatggtta caattggtgt cgtgtattct tatgccattg gagctgttgt gaagacatgg 660

cagatgcttg ctggcctgtg cattattcca gttttgatct actttgtaat ggtcttcttt 720

gccaaagaat ctccaaattt tctactctca aaaggaaaac tggataaagc tacggaatca 780

ttacagtact ttagagggaa ggactacaat atccagacag aactgaacat gttgcagcag 840

tcagtggagg atgcaaagcg caacaaggct tcatttaggg atcttctaaa accatacatc 900

ttgaagccac ttttgatctc cctcactctg atgttcttcc aacagtattc aggagtgaac 960

ccagttcttt tcaatctcac caccatcttt gaagactcag gatcaacaat ctcagacagc 1020

atcagttcca taaccattgg tgttgtgcaa gttctggcaa cccttttggc aacagtgctc 1080

atggacaaag cagggagaaa actcctgctg attgtttctg cttccatgat ggctctttct 1140

ctcactgcac ttggggaatt cttctatgag aaaatggagg atgaggtatg ggcagtggaa 1200

accttaggct ggctgccttt ggcatcacta attatcttta ttgctgcctt ctcaattggt 1260

tatggcccca ttccgtggct gatgatggga gagcttttct cccctaatgt gaaggaagct 1320

gcagctggtc tagcaactat ggtcaattgg accctgtcgt tcagcataac tctgatattt 1380

gtgcctcttc aggatgccat tagtgacttt ggtgtctact ggctgtttgc aggagtgtgt 1440

gtactcaatc tcatattctc tgtgacagta gtccctgaga caaagggcaa gacactggaa 1500

gaaatatcag cctattttgg tgggccagta gtttccagtg actcacaccc tagtcgtgaa 1560

agtgatgcat ga 1572

<210> 3

<211> 523

<212> PRT

<213> 葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter 2)

<400> 3

Met Ala Val Ser Glu Asp Asp Gly Glu Trp Ser Pro Trp Glu Lys Glu

1 5 10 15

Glu Glu Asp Pro Glu Glu Ser Gln Pro Leu Ile Pro Ser Glu Gln Val

20 25 30

Pro Gly Gln Ala Asp Ser Val Asn Arg Ser Met Glu Ser His Arg Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Ile Leu Gly Arg Thr Ser Pro Ser Lys Lys Val Gln Tyr

50 55 60

Phe Thr Ala Phe Ser Ala Thr Met Gly Ala Leu Ala Met Gly Thr Val

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Ser Ser Pro Ala Gly Pro Leu Leu Met Ser Asn Ala Thr

85 90 95

Ala Gly Pro Val His Leu Thr Lys Ala Gln Asn Ser Phe Phe Ser Ser

100 105 110

Ser Met Asn Leu Gly Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ile Gly Gly Val Cys

115 120 125

Leu Asn Lys Leu Gly Arg Arg Gly Thr Met Leu Thr Ser Val Val Pro

130 135 140

Phe Val Gly Gly Trp Leu Phe Ile Ala Phe Ala Gln Asn Phe Ala Met

145 150 155 160

Leu Met Thr Gly Arg Ile Ile Thr Gly Phe Cys Ala Gly Ile Thr Ser

165 170 175

Leu Val Val Pro Thr Tyr Ile Gly Glu Phe Ala Ser Pro Asp Ile Arg

180 185 190

Gly Thr Leu Gly Ser Gly Phe Gln Leu Met Val Thr Ile Gly Val Val

195 200 205

Tyr Ser Tyr Ala Ile Gly Ala Val Val Lys Thr Trp Gln Met Leu Ala

210 215 220

Gly Leu Cys Ile Ile Pro Val Leu Ile Tyr Phe Val Met Val Phe Phe

225 230 235 240

Ala Lys Glu Ser Pro Asn Phe Leu Leu Ser Lys Gly Lys Leu Asp Lys

245 250 255

Ala Thr Glu Ser Leu Gln Tyr Phe Arg Gly Lys Asp Tyr Asn Ile Gln

260 265 270

Thr Glu Leu Asn Met Leu Gln Gln Ser Val Glu Asp Ala Lys Arg Asn

275 280 285

Lys Ala Ser Phe Arg Asp Leu Leu Lys Pro Tyr Ile Leu Lys Pro Leu

290 295 300

Leu Ile Ser Leu Thr Leu Met Phe Phe Gln Gln Tyr Ser Gly Val Asn

305 310 315 320

Pro Val Leu Phe Asn Leu Thr Thr Ile Phe Glu Asp Ser Gly Ser Thr

325 330 335

Ile Ser Asp Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile Gly Val Val Gln Val Leu

340 345 350

Ala Thr Leu Leu Ala Thr Val Leu Met Asp Lys Ala Gly Arg Lys Leu

355 360 365

Leu Leu Ile Val Ser Ala Ser Met Met Ala Leu Ser Leu Thr Ala Leu

370 375 380

Gly Glu Phe Phe Tyr Glu Lys Met Glu Asp Glu Val Trp Ala Val Glu

385 390 395 400

Thr Leu Gly Trp Leu Pro Leu Ala Ser Leu Ile Ile Phe Ile Ala Ala

405 410 415

Phe Ser Ile Gly Tyr Gly Pro Ile Pro Trp Leu Met Met Gly Glu Leu

420 425 430

Phe Ser Pro Asn Val Lys Glu Ala Ala Ala Gly Leu Ala Thr Met Val

435 440 445

Asn Trp Thr Leu Ser Phe Ser Ile Thr Leu Ile Phe Val Pro Leu Gln

450 455 460

Asp Ala Ile Ser Asp Phe Gly Val Tyr Trp Leu Phe Ala Gly Val Cys

465 470 475 480

Val Leu Asn Leu Ile Phe Ser Val Thr Val Val Pro Glu Thr Lys Gly

485 490 495

Lys Thr Leu Glu Glu Ile Ser Ala Tyr Phe Gly Gly Pro Val Val Ser

500 505 510

Ser Asp Ser His Pro Ser Arg Glu Ser Asp Ala

515 520

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcctgctga ttgtttctgc ttc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcctaaggtt tccactgccc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagccaggta tggttgtcaa cttt 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtggtgcat ctccacagac t 21

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcctgagt cttcaaagat ggtggtg 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagatccct aaatgaagcc ttgttgcg 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatggctctc catgctgcgg tttac 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaccagggac tgttctgatg g 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgggggtgt ctgcctcaat aagc 24

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtggctggct tttattgctt ttgctc 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggaggatg aggtatgggc agtgg 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgactttggt gtctactggc tgtttgc 27

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaactcgttt ttctcatcat cca 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acaggccagc aagcatctg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcaacccttt tggcaacag 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcatcctga agaggcaca 19

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atcaacaatc tcagacagca tc 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gccagtcaac aacatttaga ac 22

Claims

1.斑节对虾Pm GLUT2基因耐低盐相关的SNP位点在斑节对虾育种方面的应用，所述的SNP位点与斑节对虾耐低盐相关，与所述斑节对虾Pm GLUT2基因紧密连锁，位于SEQ ID NO：1所示斑节对虾Pm GLUT2参考基因组的第1488上，该位点突变为A/T，所述应用指采用所述SNP位点筛选在位于斑节对虾Pm GLUT2参考基因组第1488的位点上具有A/T的斑节对虾，所述斑节对虾Pm GLUT2基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。