CN115948577A - 一种耐高温海参的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种耐高温海参的选育方法，通过筛选获得的与耐高温海参相关的分子标记来进行分子标记遗传辅助育种；从而为海参的选育提供有效的分子标记。所提供的分子标记，为与海参耐热性状相关的微卫星标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。本发明通过对耐热的海参品种的扩增产物进行分析，获得了与海参耐热性状相连锁的微卫星标记，使用该微卫星标记可以筛选与耐热性相关的海参个体，从而用于海参的遗传选育。

Description

一种耐高温海参的选育方法

技术领域

本发明属于海参遗传育种技术领域，具体涉及一种耐高温海参的选育方法。

背景技术

海参属于无脊椎动物、棘皮动物门、海参纲，全球有900多种，我国约140种。其中印度洋、西太平洋海区是世界上海参种类最多、资源量最大的区域。我国海参分布在温带区和热带区，温带区主要在黄渤海域，主要经济品种是刺参，也是我国最为知名的海参种类。2019年全国海参总产量17.5万吨,其中山东达到9.6万吨,占到全国的半壁江山,苗种产量也占到全国60％以上。因此，刺参养殖是我国北方重要海水养殖产业，随着刺参产品的市场需求持续升温，刺参的养殖规模随市场需求的增加而迅速扩张。

作为主要的海参养殖品种，刺参的适宜生长温度范围为10～20℃，当水温过高时刺参会进入夏眠状态。然而，随着夏天平均气温上升的同时，导致北方养殖刺参水体的水温偏高，持续时间长。而养殖水体的水温达到24℃以上就会对养殖的刺参造成严重影响，造成刺参进入夏眠，严重的会腐烂死亡。2013年夏季山东沿海养殖海参普遍遭受持续高温灾害，东营、牟平、莱州、乳山等地已造成大面积死亡灾害，直接经济损失数十亿元，给刺参养殖业户带来了沉重打击，严重影响了夏季刺参养殖业健康发展。此外，刺参的规模化南移养殖对具有耐高温性状的刺参苗种提出了需求。因此，培育生长速度快、高温耐受力强的刺参新品种已成为目前中国刺参良种选育工作的重点之一。

目前对于耐高温刺参的选育工作主要是通过常规的种群育种方式来筛选具有耐热性的刺参个体，但还缺少有效的与刺参耐热性相关的分子标记，也导致从野生刺参种群进行耐热个体筛选的工作无法开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温海参的选育方法，通过筛选获得的与耐高温海参相关的分子标记来进行分子标记遗传辅助育种；从而为海参的选育提供有效的分子标记。

本发明首先提供一种与海参耐热性状相关的微卫星标记，所述的微卫星标记SJ-ssr-05，其一种核苷酸序列如下：

Ggagctactgtaccaacatcgacttctcactccaggtgcatcgcctgcaaggtccaccccatctaggaat

cggattctctcaccagtcacaccgcccacccagcacacacacacacacacacacacaacacaaagggttac atcacctgccccaactcttgtatcatttaccttatttcttctagagtctgtagt(SEQ ID NO:1)；

另一个微卫星标记SJ-ssr-10，其核苷酸序列如下：

Ttgactgctagtcgtgtggacttctccttggtaaaaaaaaaacaaaacacacacacacagataccaac

cctaacccacacacatacaaaaagacacattaaatatgatatatataccaactgtttgtagtcgtttgatttcagtt

cagagctctttcctataatcctctatggttataaatataccctaaatgcatcaatacctattgtgcttttgacatatga

aaaacatggaatctgggacacccttgggat(SEQ ID NO:2)；

本发明还提供用于检测SJ-ssr-05标记的引物对，其中包含有：

上游引物：5′-GGAGCTACTGTACCAACATC-3′(SEQ ID NO:3)，

下游引物：5′-ACTACAGACTCTAGAAGAAATAAG-3′(SEQ ID NO:4)；

用于检测SJ-ssr-10标记的引物对，其中包含有：

上游引物：5′-TTGACTGCTAGTCGTGTGGAC-3′(SEQ ID NO:5)，

下游引物：5′-ATCCCAAGGGTGTCCCAGATTCC-3′(SEQ ID NO:6)；

本发明另一个方面还提供所述的微卫星标记的一种用途，是在筛选耐热性海参亲本个体中的应用。

本发明还提供一种筛选耐热性海参亲本的方法，是通过检测待筛选个体中所述的微卫星标记的基因型来进行筛选；

所述的方法，是使用所述的引物对来扩增待筛选个体的基因组DNA，对扩增产物的基因型进行分析。

所述的具有耐热性的海参亲本，其中SJ-ssr-05引物对扩增的产物中包含有197bp的扩增片段，而SJ-ssr-10引物对扩增的产物中包含有254bp的扩增片段

本发明通过对耐热的海参品种的扩增产物进行分析，获得了与海参耐热性状相连锁的微卫星标记，使用该微卫星标记可以筛选与耐热性相关的海参个体，从而用于海参的遗传选育。

附图说明

图1：SJ-ssr-05的197/197基因型电泳图；

图2：SJ-ssr-05的195/197基因型电泳图；

图3：SJ-ssr-10的254/254基因型电泳图；

图4：SJ-ssr-10的254/258基因型电泳图；

图5：SJ-ssr-10的258/258基因型电泳图。

具体实施方式

通过选择育种方法培育出的刺参“东科1号”，是采用群体选育技术，以2005年夏季山东当地野生刺参群体繁育的养殖群体为基础来源，从中收集并筛选出棘刺坚挺、体表无损伤且处于活动和摄食状态的大规格亲参，构建了育种基础群体，并从2006年4月开始对各世代苗种实施高温淘汰和速生性状筛选，经多代选育而成。该选育品系具有生长速度快、夏季高温耐受力强、高温期成活率高、夏眠期短等特点。

在获得了该耐高温的海参品系样品的基础上，结合中国水产科学研究院黄海水产研究所培育的“高抗一号”海参品系进行与海参耐热性相关的多态性微卫星引物的标记的筛选；确定与耐热性相关的微卫星标记的基因型，并用于野生海参品系的筛选。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：筛选微卫星标记

1、合成微卫星标记的引物对

对13个从海参中筛选的微卫星引物对进行筛选，其中微卫星引物对的序列信息如表1所示。

表1：用于筛选的海参微卫星的引物信息表

将表1中的引物在上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成，正向引物的5′端标记荧光素FAM(蓝色)。合成的引物在海参样品上进行多态性检测。

2、非损伤提取海参个体的基因组DNA

目前，在海参育种等实验中，选取活体海参的触手或管足来提取DNA，进行无损伤取样，少量组织的剪取，不会严重影响到海参的生命活动，更不会造成海参的自溶和死亡，这样能够保证检测的个体可以应用到后续的遗传育种操作中。

将20个“东科1号”、20个“高抗一号”和20个市场购买的非耐高温养殖海参分别放在盛有少量海水的容器中，海水刚没过刺参为宜，待几分钟刺参恢复生活状态后用尖嘴镊子分别拔取刺参的触手和管足5-10条，然后用生理盐水冲洗干净放入取样用离心管中准备进行基因组DNA的提取。

取200mg刺参组织用液氮磨至粉状，再加入700μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液：Tris-HCI(100mmol/L)、NaCl(1.4mol/L)、EDTA(20mmol/L)、CTAB(2％)，同时加入8μL 20mg/mL的蛋白酶K，置于55℃水浴槽中进行水溶溶解，然后在4h过夜裂解，直至裂解澄清。

然后在裂解提取液中加入等体积苯酚：氯仿(1:1)，颠倒2-3min,使两者混合均匀,12000r/min离心15min,取上清再加入2μL20m g/mL的RNase A酶，水浴30min，加入等体积氯仿离心，重复上步直至上清液澄清无浑浊，取上清用乙醇沉淀法回收DNA，晾干沉淀，加入50μL TE缓冲液溶解沉淀。

1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，DNA样品保存于-20℃备用。

3、使用提取的海参DNA作为模板进行微卫星标记

将5个东科1号”海参，5个“高抗一号”海参的基因组DNA按照等体积进行混合，作为PCR扩增的模板。

PCR反应总体积为25μL，模板为含有20ng基因组DNA的10μL混合模板，其它组分根据Taq酶的说明书要求进行添加。

PCR反应条件如下：94℃2min；94℃30s，60℃45s，72℃50s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

扩增产物用ABI3730XL(美国应用生物系统公司)DNA分析仪进行自动荧光检测。用Genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出PCR扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。确定能在耐高温的海参品系中有扩增产物，且具有多态性的微卫星引物对。

对筛选的13对PCR引物对分别在20个“东科1号”(DK)、20个“高抗一号”(GK)和20个市场购买的非耐高温的养殖海参(SJ)进行扩增。扩增产物用ABI3730XL(美国应用生物系统公司)DNA分析仪进行自动荧光检测。用Genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出PCR扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。Popgene32计算等位基因数(numbers of the alleles，Na)、有效等位基因数(numbers of the effective alleles，Ne)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)、观测杂合度(observedheterozygosity，Ho)及Hard-weinberg平衡检验(P值)。参照Botstein等的方法计算多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)。

结果显示，13个微卫星位点在DK群体中共检测到36个等位基因，平均等位基因数为2.769，有效等位基因数为1.4532-4.2145，平均值为2.1313。在高抗一号群体GK中共检测到38个等位基因，平均等位基因数为2.923，有效等位基因数为1.0824-4.2218，平均值为2.2061(表2)。

表2：两个具有耐高温特性的海参群体遗传多样性分析

上述结果表明这两个耐高温特性的海参群体，由于经过了人工选育，其遗传多态性相对较低。

实施例2：与耐高温相关的微卫星标记

对20个“东科1号”(DK)、20个“高抗一号”(GK)和20个市场购买的非耐高温的养殖海参(SJ)进行扩增，用Genemapper4.0软件生成每个样品的扩增图谱文件，获得每个位样品的基因型。

分析结果表明，引物对SJ-ssr-05和y在DK和GK群体中扩增出特定的片段。其中引物对SJ-ssr-05在东科1号”(DK)、“高抗一号”(GK)中扩增出了特异的197bp的片段(表3、图1和图2)。

表3：引物对SJ-ssr-05在耐高温海参群体中的基因型数目表

SJ-ssr-05的扩增片段的核苷酸序列如下：

Ggagctactgtaccaacatcgacttctcactccaggtgcatcgcctgcaaggtccaccccatctaggaat

cggattctctcaccagtcacaccgcccacccagcacacacacacacacacacacacaacacaaagggttac atcacctgccccaactcttgtatcatttaccttatttcttctagagtctgtagt；

其核心重复为(CA)_n，其中在耐高温海参群体中n的数目主要为13，而在非耐高温海参群体中并不存在该核心重复数目的扩增片段。

引物对SJ-ssr-10在DK和GK群体中扩增出了特异的254bp的片段，其在DK和GK中的基因型如表4，图3-图5分别为三种基因型254/254、254/258和258/258的电泳图。

表4：引物对SJ-ssr-10在两种海参群体中的基因型信息表

SJ-ssr-10的扩增片段的核苷酸序列如下：

Ttgactgctagtcgtgtggacttctccttggtaaaaaaaaaacaaaacacacacacacagataccaac

cctaacccacacacatacaaaaagacacattaaatatgatatatataccaactgtttgtagtcgtttgatttcagtt

cagagctctttcctataatcctctatggttataaatataccctaaatgcatcaatacctattgtgcttttgacatatga

aaaacatggaatctgggacacccttgggat；

其核心重复为(CA)_n，其中在耐高温海参群体中n的数目主要为6，而在非耐高温海参群体中并不存在该核心重复数目的扩增片段。

因此，使用SJ-ssr-05和SJ-ssr-10在野生海参种群中分别筛选具有特异的197bp、254bp的片段的个体。

实施例3：筛选具有特定微卫星标记的野生海参

2021年3月在对200头经过福建漳浦南移耐高温养殖筛选的海参的子代个体进行检测，通过无损伤取样的方式获得每头海参的基因组DNA，使用SJ-ssr-05和SJ-ssr-10分别进行检测；筛选具有特异的197bp、254bp的片段的个体。

从总共200头海参中共筛选了24头具有特定片段的海参，其中含有SJ-ssr-05引物对扩增的特定的197bp片段的海参共12头；而SJ-ssr-10引物筛选的，具有254bp的片段的个体有15头，且同时具有197bp和254bp的片段的个体为3头。

2021年4月，在威海西港水产有限公司开始进行养殖试验，去掉偏小的个体，将20头(平均体重为1.96g/头)的幼参作为实验组，50头类似重量的不包含特定片段的个体作为对照组(平均体重为2.14g/头)；在相同的养殖条件下进行室内养殖。养殖水体为经过沙滤、紫外消毒的天然海水，海水盐度为20‰左右，养殖池内投放附着基。养殖水温保持在24±1℃；每天换水1-2次，养殖期间定期倒池清污。在养殖期间投喂养殖生产配合饲料和海泥。

养殖期间随时记录死亡的个体，并进行微卫星引物检测。养殖至2022年8月结束，共养殖16个月。养殖结束后，统计死亡的个体数目；并对对于存活的海参个体，称量体重。

在养殖一年时间内，实验组和对照组并没有海参个体死亡的记录，表明24℃的养殖水温并不会对幼参产生致死效果。但在养殖12月后，即2022年4月起，对照组逐渐出现了死亡个体，且对照组的海参出现了夏眠的现象。至2022年8月实验结束，对照组共有8只海参出现死亡，而实验组并没有出现死亡现象；表明筛选的海参个体对于24℃的水温具有更好的耐受性。

实验结束后，对实验组20头海参和对照组存活的海参中选择大的个体20头分别进行称重(表4和表5)。

表4：实验组的海参的体重统计表(g)

其中W1为实验结束后测量的养每个个体的体重；

为初始的平均体重，

为实验结束后测量的平均终末体重。

表5：对照组的海参的体重统计表(g)

上述结果表明，与实验组相比，对照组的养殖海参在生长到一定阶段后，存在着明显的夏眠状态，导致其成参存在生长停滞，或是到夏眠结束时终末体重降低。

因此，本发明所提供的微卫星标记能够用于耐高温海参的筛选，作为分子标记用于海参的遗传育种操作。

Claims (10)

1.一种与海参耐热性状相关的微卫星标记，其特征在于，所述的微卫星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

2.用于检测权利要求1所述的微卫星标记的引物对，其特征在于，所述的引物对，其中用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO:1的微卫星标记的引物对，其上下游引物的序列为SEQID NO:3、SEQ ID NO:4。

3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，其中用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO:2的微卫星标记的引物对，其上下游引物的序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。

4.权利要求1所述的微卫星标记在筛选耐热性海参亲本个体中的应用。

5.一种筛选耐热性海参亲本的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测待筛选个体中权利要求1所述的微卫星标记的基因型来进行筛选。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求2或权利要求3所述的引物对来扩增待筛选个体的基因组DNA，并对扩增产物的基因型进行分析来筛选。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的筛选，其中权利要求2所述的引物对的扩增产物中包含有197bp的扩增片段。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的筛选，其中权利要求2所述的引物对的扩增产物中包含有254bp的扩增片段。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中待筛选个体的基因组DNA是通过非损伤方式提取海参个体的基因组DNA。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过DNA分析仪进行自动荧光检测来进行基因型分析。

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