CN100376675C - 栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用，其方法是利用已构建好的栉孔扇贝DNA小型插入片段基因组文库和微卫星富集文库及计算机检索栉孔扇贝的GenBank数据库，得到含有微卫星重复的序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，并优化引物成为微卫星标记；再对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的10个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系，应用于栉孔扇贝种质及群体遗传学分析；利用上述的10个微卫星标记组成的评价体系再进一步对不同地理群体(种群)的栉孔扇贝进行综合种质资源评价。有望为保护和持续利用栉孔扇贝种质资源，建立集约型、健康型养殖产业和品牌战略提供技术支持。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域。具体涉及栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用
背景技术：
栉孔扇贝(Chlamys farreri)隶属于软体动物门(Mollusca)瓣鳃纲(Lamellibranchia)翼形亚纲(Pterimorphia)珍珠贝目(Pterioodae)扇贝科(Pectinidae)。栉孔扇贝产于我国北方近海，在日本、韩国沿海以及俄罗斯南部沿海均有分布。栉孔扇贝肉质鲜美，营养丰富，是我国重要的海水养殖对象，具有很高的经济价值。
在真核生物基因组中，存在着由1-6个碱基对组成的简单重复序列(Simple Sequence Repeats)，简称SSRs，又称之为微卫星DNA(Microsatellite DNA)。随着标记技术的发展和完善，微卫星标记已经成为国际上主流的标记技术之一。微卫星标记有诸多优点，如：随机分布在整个基因组中，多态性高；可通过PCR迅速扩增，需要的DNA样品量较少，并且重复性好；孟德尔式遗传，共显性标记。因此，微卫星标记在遗传图谱的构建、遗传多样性分析和种质鉴定等方面得到广泛的应用。
遗传多样性是种质资源评价中最为重要的指标之一。遗传多样性，也叫基因多样性，是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异的总和。它不但是生物多样性的重要组成成分，而且是物种多样性和生态系统多样性的基础。一般认为，遗传多样性的大小及其群体遗传结构跟一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力密切相关，与生物多样性的形成、消失和发展休戚相关。因此，研究生物的遗传多样性对于保护、开发及永续利用生物种质资源都是十分重要的。重要的海水养殖生物在人工放养、放流以及由于人为或自然原因造成的逃逸个体很容易进入野生自然群体从而对其遗传结构、遗传多样性以及种质资源产生极大的影响。由于这种影响是不可逆的，因而会影响该物种或种群的存在、繁衍。因此如何采取措施，在进行海水养殖动物品种选育的过程中充分保护遗传多样性的稳定也是目前海水养殖业中需要解决的问题。因此，建立一个适用的分子标记种质资源评价体系，随时检测和评价宝贵的种质资源，在养殖业蓬勃发展的今天显得尤为重要。同时利用DNA分子标记技术进行种质分析，对于栉孔扇贝资源保护、持续利用和品牌战略具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于构建一组适用于栉孔扇贝种质鉴定和遗传分析的微卫星标记，及利用这些标准微卫星标记进行栉孔扇贝种质分析——栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用。
其步骤包括：利用已经构建好的栉孔扇贝DNA小型插入片段基因组文库和微卫星富集文库，筛选阳性克隆测序获得微卫星DNA；并利用计算机检索栉孔扇贝的GenBank数据库，得到含有微卫星重复的序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，并进一步优化引物成为微卫星标记；然后再对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值(PIC)进行综合评价，确认其中的10个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系(表1)，而应用于栉孔扇贝种质及群体遗传学分析；然后利用上述的10个微卫星标记组成的评价体系再进一步对不同地理群体(种群)的栉孔扇贝进行综合种质资源评价。
附图说明：
图1位点CFMSP075扩增四个地理群体的带谱图(每个群体示5个个体)。
图2位点CFMSP011扩增四个地理群体的带谱图(每个群体示5个个体)。
具体实施方式
本方法具体为位点的筛选及其用于种质资源评价位点的确定，详细步骤为：
1、利用已经构建好的栉孔扇贝小型插入片段基因组文库及微卫星富集文库，通过(GA)20和(CA)20探针筛选文库，并对阳性克隆测序获得含有微卫星重复的序列。并利用微卫星检索软件RepeatReporter1.5对GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行微卫星DNA的查找，对于二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于4次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星DNA进行快速分离得到含有微卫星重复的序列；
2、在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier5和Oligo6.44设计引物；引物设计应满足下列条件：(1)引物长度为20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度大于45℃(4)预期PCR产物长度为80-400bp；
3、引物的优化：不同的引物根据不同的Tm值，在温度梯度PCR仪上做温度梯度(在Tm值上下各做10度)优化。扩增反应采用BiometraT-GradientPCR系统，PCR程序为：95℃下预变性5分钟，95℃变性45秒，退火45秒，72℃延伸45秒，反应进行30个循环。反应体系为20μL：含有正、反引物各0.2μM、dNTPs各0.2mM、1×PCRbuffer、1.2mM的Mg2+、1个单位的Taq酶，80ngDNA作为PCR模板，该模板是从40个个体中任意取5个个体的DNA等量混合得到。扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta；
4、标准微卫星位点的确立
微卫星位点的多态性水平可用多态信息含量值[PIC(Polymorphism Information Content)]衡量。一般情况下，多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息，而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差。依据上述优化获得的Ta值，选取40个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算。PCR程序为在95度下预变性5分钟，95度变性45秒，Ta(各引物优化的最佳退火温度)退火45秒，72度下延伸45秒，反应进行30个循环。反应体系为20μL，含有正反引物各0.2μM、dNTPs 0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1个单位的Taq酶、20ng DNA模板。PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后用溴化乙锭(浓度为0.15μg/mL)染色，紫外观察成像并对电泳谱带利用公式PIC＝1-∑Pi 2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出。根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25标记，最后共筛选出重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的10个位点，如表1，作为栉孔扇贝标准微卫星评价体系，用于栉孔扇贝的种质资源评价。
以下为利用上面得到的评价体系进行栉孔扇贝不同群体评价的实例及其方法步骤。
1、提取栉孔扇贝DNA：
选用采自胶南(青岛市)、长岛(烟台市)、寻山(威海市)和日照的栉孔扇贝样品，每个取样地随机选取40只健康的贝，贝样活体解剖后取闭壳肌约0.1克，加入500μl STE裂解缓冲液(NaCl：100mM：EDTA：1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min。将核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNaseA，4℃冰箱保用于PCR扩增。
2、PCR扩增：
PCR反应条件为：40ng栉孔扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。使用这两对引物时设置的PCR程序参数为：95℃变性45秒，Ta退火45秒，72℃延伸45秒，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存得到的PCR扩增产物。
3、电泳检测：
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准(pUC19/HaeIII)。电泳2-3小时后用溴化乙锭(浓度0.15mg/mL)染色，凝胶成像系统上紫外成像(代表图谱见图1、图2)，并利用软件Quantity One对扩增产物和标准分子量相比照，对每个个体的扩增产物进行准确的大小确定，从而进行快速的、准确的确定基因型。将谱带转换成软件POPGENE32能够识别的数据，利用软件POPGENE32对遗传学数据进行计算。其结果可以反应出不同地理群体(种群)的Hardy-Weinberg平衡性、杂合度、等位基因频率等遗传学数据，从而应用于栉孔扇贝不同地理群体(种群)的种质资源分析。因此，以10个微卫星标记作为标准评价体系的建立，为相关研究室之间数据的比对和交流提供了基础，也有望为保护和持续利用栉孔扇贝种质资源，建立集约型、健康型养殖产业，坚持品牌战略提供技术支持。
| 位点名称 | 引物序列(5’-3’) | 退火温度(℃) | 重复单元 | 等位基因大小范围(bp) | 等位基因数目 | PIC |
| CFMSP002AY682108CFMSP003AY682109CFMSP006AY682118CFMSP007AY682116CFMSP011AY682110CFMSP075DQ022568CFMSM009DQ104704CFMSM014DQ104705CFMSM020DQ104709CFSSR001AY164680 | F：CAACTTCGTCAGACAAATGR；GTAAAAGAACCCAAACACCF：CGACTGCCCCTAGTGTCTTCR；AACAAGGGTACTTCACGGTCGGF：CAGACTGTCGGTACTTGTCR：AAAGTCTGTACCTCTCTGF：CTGACAACCTGGTCAAACR；GCGTTATCACAAGGAGACF：GCAAAACCAACTCCTTCACAACR；GGCGATATTCCACCTGACCF：GAGAAAGACTTCGTTCGTCGR：GGGACTTTCGTTTGGTACAGCF：GTAGTCACATGATGACATAGAGR；CACAACTCCGTCAATCATTCTCF：CATCTGATGGCATGATACR；GAACTAACGAGGAGACAACTGF：CAAAGGCATTTGTAGGAAGGCR；ACGGCACTTCGTTGATTAACF：CAGGAGACTTGCGTTTTACGR：TATGTTTAGACCACCCAC | 49525450625456606254 | A<sub>9</sub>(CA)<sub>7</sub>A<sub>6</sub>...(CAAA)<sub>7</sub>(AGC)<sub>9</sub>(AC)<sub>11</sub>(CA)<sub>8</sub>(ACAAA)<sub>5</sub>(AC)<sub>10</sub>CT(AC)<sub>6</sub>(AG)<sub>4</sub>G(AG)<sub>5</sub>...(AG)<sub>5</sub>(AG)<sub>10</sub>...(AC)<sub>4</sub>(CAC)<sub>11</sub>(TTTA)<sub>5</sub> | 140-17580-10197-111170-182174-204160-194203-217230-256167-191170-190 | 683661261375 | 0.720.820.480.560.660.790.390.910.820.62 |
表1 用于栉孔扇贝种质资源分析的标准微卫星标记
Claims (5)
1.一种栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是利用已经构建好的栉孔扇贝DNA小型插入片段基因组文库和微卫星富集文库及计算机检索栉孔扇贝的GenBank数据库，得到含有微卫星重复的序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，并进一步优化引物成为微卫星标记；然后再对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的10个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系，上述10个微卫星标记如下：
2.如权利要求1所述的栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是上述得到含有微卫星重复序列的步骤为：利用已经构建好的栉孔扇贝小型插入片段基因组文库及微卫星富集文库，通过(GA)20和(CA)20探针筛选文库，并对阳性克隆测序获得含有微卫星重复的序列。并利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5对GenBank进行微卫星DNA的查找，对于二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于4次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星DNA进行快速分离得到含有微卫星重复的序列。
3.如权利要求1所述的栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是上述在微卫星重复的侧翼序列设计引物步骤为：在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5和Oligo 6.44设计引物；引物设计应满足下列条件：(1)引物长度为20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度大于45℃(4)预期PCR产物长度为80-400bp。
4.如权利要求1所述的栉孔扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，并确认其中重复性、稳定性好和PIC值大于0.25的10个位点作为标准微卫星标记评价体系。
5.如权利要求1构建的栉孔扇贝标准微卫星标记的应用，其特征是上述的10个微卫星标记组成的标准微卫星标记评价体系应用于不同地理群体的栉孔扇贝综合种质资源评价。
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| 栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选. 李红蕾等.高技术通讯，第12期. 2003 * |
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