CN110747279B - 暗纹东方鲀snp分子标记及其在遗传育种的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种暗纹东方鲀SNP分子标记及其在遗传育种的应用。公开的暗纹东方鲀SNP分子标记包括体重、标准头长相关的SNP分子标记TGF120和与抗寒能力相关的SNP分子标记CIRP41，它们所在碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述TGF120位于SEQ ID NO:1所示序列的第120位m，碱基为C或A，所述CIRP41位于SEQ ID NO:2所示序列的第41位y，碱基为A或T。利用本发明的两个分子标记，可以有效实现对长势好、耐低温的暗纹东方鲀的育种亲本的选择，促进河鲀良种化和产业发展。本发明还提供了一种暗纹东方鲀遗传质量判断系统，可以降低在育种选择上的工作量，提高工作效率。

Description

暗纹东方鲀SNP分子标记及其在遗传育种的应用
技术领域
本发明属于水产育种技术，尤其涉及暗纹东方鲀的SNP分子标记以及在遗传育种中的应用。
背景技术
暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)俗名河豚，为硬骨鱼纲，辐鳍鱼亚纲，鲀形目的名贵经济鱼类，广泛分布于中国、日本和朝鲜半岛国家的沿海地区和内陆河流。随着工业技术的发展，捕捞技术与效率迅速提升，无节制的捕捞与排放污染使得暗纹东方鲀种群数量迅速下跌，野生暗纹东方鲀的渔汛已经基本消失，严重威胁了生态的多样性与稳定性，也致使暗纹东方鲀贸易经济遭受打击。所以，对暗纹东方鲀一类的名贵鱼物种进行人工选育来缓解市场供求矛盾，不仅是一种高效促进河豚产业发展的措施，也是减缓野生暗纹东方鲀种质资源压力的一种方法。
暗纹东方鲀属江海洄游性鱼类，对环境抵抗力较差，应激反应明显，时常出现病害增加、肉质下降等种质退化现象，再加上不断扩大的市场需求对现有的暗纹东方鲀品种长势要求越来越高，种质改良和优良品系繁育已成为突破暗纹东方鲀产业制约的重要方法。随着暗纹东方鲀的人工育种进程的开展，其良种的繁育已经逐渐进入正途，但仍面临多种问题：尽管已经保证了养殖密度的适宜与饵料充足，仍然有不少个体会出现与同期其他个体相差较大的长势，而这多体现在体重上；有的个体虽然与其它个体体重差异不大，却躯干短小，这意味着可食用部分不多；自然条件下，暗纹东方鲀生存的自然水体多为海水，进入河流和人工养殖环境后有可能受低温环境刺激而导致批量死亡，同时人工养殖的暗纹东方鲀需要在人工水环境中进行高密度越冬，一旦控温出现失温就会造成巨大损失。耐低温的暗纹东方鲀可以减少人工繁育暗纹东方鲀时的控温设备投入，也可大大增加暗纹东方鲀的越冬存活率。所以，按需繁育优良的暗纹东方鲀品系，不能仅从一方面入手，还需要将多种需要的品质考虑在内，结合生长、抗寒抗病等多种品质进行不断地选育。标准头长(头长与体长的比值)计算方式为：个体头长/个体体长，表现的是头部与躯干的比例。标准头长越小，说明头部越小，对于暗纹东方鲀这样几乎不食用头部的名贵商品鱼来说，头部比例越小说明躯干则越长，也意味着可食用部分更多，经济价值更大。
分子育种也称为分子标记辅助育种，利用了DNA分子标记对育种目标进行标记选择，从而达到选育、改良特定遗传性状的目的，是一种传统遗传技术与现代分子生物学技术有机结合的新育种策略。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)标记是第三代分子标记，具有多态性高、遗传稳定和检测方便等优点，已被广泛应用于各种分子育种的研究领域。一个SNP位点大多为三种碱基型，第一为纯碱基一型，第二为纯碱基二型，第三为碱基一与碱基二兼有型(如AA，CC，AC)。虽然不是所有的SNP位点都会给个体带来表型差异，但通常情况下带来表型差异的个体中纯碱基一型与纯碱基二型都有显著的性状差异，而兼有型则介于二者之间。转化生长因子β(TGF-β)是一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，具有促进细胞生长、成骨、组织修复的作用，对生物生长与分化都有重要调节作用；冷诱导结合蛋白(CIRP/CIRBP)是一种应激应答因子，特别是在寒冷应激时的上调最为明显。对暗纹东方鲀而言，这两种基因的相关研究与SNP报道都未见发布。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供长势好、耐低温的暗纹东方鲀SNP分子标记以及相应PCR引物，并提供利用该分子标记实现准确选择遗传质量良好的亲鱼的信息化手段。
技术方案：本发明以养殖场随机选取暗纹东方鲀群体为试材，开展暗纹东方鲀生长性状分子标记的开发及标记辅助育种体系的建立。
本发明提供的暗纹东方鲀SNP分子标记，包括体重、标准头长相关的SNP分子标记TGF120和与抗寒能力相关的SNP分子标记CIRP41，它们所在碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
所述名为TGF120的SNP分子标记来源基因(TGF-β)的部分基因组序列如SEQ IDNO：1所示，自5’端起，该序列的第120位m存在SNP：g.120C>A SNP位点，碱基为C或A或AC。该位点呈现CC(CC表示位点碱基为纯C，下同)型的个体体重显著高于AA(AA表示位点碱基为纯A，下同)型个体，标准头长(头长与体长的比值)显著低于AA型个体；
用于检测所述名为TGF120的SNP分子标记的引物对，其正向引物序列为5’-GCATAGCTCCTCAGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物序列为5-’CGGTAGATTAAGTTAAGTTCC-3’(SEQ ID NO：4)。用于检测所述名为TGF120的SNP分子标记的试剂盒，应当包含所述的引物对。
所述名为CIRP41的SNP分子标记来源基因(CIRP)的部分基因组序列如SEQ ID NO：2所示，自5’端起，该序列的第41位y存在SNP：g.41A>T SNP位点，碱基为A或T或AT。该位点呈现AA型的个体耐低温表现显著高于TT(TT表示碱基位点为纯T，下同)型个体；
用于检测所述名为CIRP41的SNP分子标记的引物对，其正向引物序列为5’-AAAGTAGGTCACTGGTGC-3’(SEQ ID NO：5)；反向引物序列为5-’CCCGTCTGTATTTGTTATG-3’(SEQ ID NO：6)。用于检测所述名为CIRP41的SNP分子标记的试剂盒，应当包含所述的引物对。
本发明还提供一种暗纹东方鲀遗传质量判断系统，包括：SNP信息选择模块，用于提供查看和选择SNP信息及SNP扩增必要引物的功能，所述SNP信息包括如上所述的TGF120标记和CIRP41标记的SNP名称、SNP功能，所述SNP扩增必要引物包括如上所述的正向引物序列和反向引物序列；
SNP判断模块，用于根据对待测个体进行扩增测序后所得的SNP标记碱基型，判断所述个体在该SNP位点的遗传质量等级：对于SNPg.120C>A位点碱基为CC型个体，判断遗传质量为较好GOOD，为AA型判断遗传质量为较差BAD，为AC型判断遗传质量为一般NORMAL；对于SNP位点SNPg.41A＞T碱基呈现AA型个体，判断遗传质量为较好GOOD，TT型判断遗传质量为较差BAD，AT型判断遗传质量为一般NORMAL。
输出模块，用于输出SNP判断模块的判断结果。
所述的SNP分子标记、引物对和所述的试剂盒在暗纹东方鲀选育中的用途主要是作为一种检测暗纹东方鲀长势、低温耐性优劣的方法，通过应用试剂盒与正反向引物对待筛选暗纹东方鲀进行所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测暗纹东方鲀各性状的优劣，而所述系统是对这些SNP信息的储存与整合，是更快速更便捷的SNP汇集方法，便于信息的保留、传递与使用。
所述判断暗纹东方鲀遗传质量的方法，具体包括以下步骤：
a)获得暗纹东方鲀群体；
b)提取暗纹东方鲀尾鳍DNA；
c)基于前述的引物对或试剂盒，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP分子标记的碱基型；
e)TGF120标记SNPg.120C>A位点碱基型与暗纹东方鲀生长性状的相关性分析；
f)CIRP41标记SNPg.41A>T位点碱基型与暗纹东方鲀抗寒表现的相关性分析；
g)在前述系统中录入对应标记的信息以及各碱基型意义，用于后续直接进行比对分析。
通过对暗纹东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析，所述标记名为TGF120的SNPg.120C>A位点CC碱基型个体的体重显著高于AA型个体，标准头长显著低于AA型个体；标记名为CIRP41的SNPg.41A>T位点的AA碱基型个体抗寒表现显著高于TT型个体。录入系统后通过Matlab GUI界面可直观显示出判断必须条件与遗传质量判断结果。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
1)本发明公开的SNP位点可以进行分子标记辅助育种，不受暗纹东方鲀的性别限制，可用于暗纹东方鲀的亲本选择，显著体高暗纹东方鲀的遗传质量。
2)本发明通过SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6所示的两对引物，检测SEQ ID NO：1所示碱基序列自5’端第120位与SEQ ID NO：2所示碱基序列自5’端第41位碱基型的方法，结果精确稳定。
3)根据本发明所提供的两种与暗纹东方鲀优良性状相关的SNP分子标记，还建立一种可不断补充数据的暗纹东方鲀遗传质量判断系统，可经由不断补充数据以覆盖暗纹东方鲀更全面的性状，实现利用暗纹东方鲀多种基因上与优良遗传性状显著相关的多个SNP位点系统地、全面地进行分子标记辅助育种。
4)该系统通过Matlab GUI设计界面和录入SNP信息，条件与结果清晰直观，信息收录全面，具有可扩展性，持久性与开源性，数据容量巨大，结果显示简洁，便于各人群使用。
附图说明
图1是根据本发明实施例的操作流程图；
图2是根据本发明实施例的TGF120标记碱基型为CC时的系统界面。
具体实施方式
本发明基于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所述的两对引物对暗纹东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析。得到了与暗纹东方鲀生长显著相关的SNP位点(SNPg.120C>A)以及与抗寒能力显著相关的SNP位点(SNPg.41A>T)。将两个位点的相关生物信息录入本发明所提的遗传质量判断系统，即可得到与暗纹东方鲀生长和抗寒能力相关的遗传质量判断程序，可应用于目前与将来的暗纹东方鲀分子标记辅助育种进程。
所述过程主要步骤包括：
(a)暗纹东方鲀群体的获得；
(b)暗纹东方鲀基因组DNA提取；
(c)基于所述SNP引物，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增；
(d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP的碱基型；
(e)SNP位点碱基型与暗纹东方鲀体重、抗寒能力的相关性分析；
(f)SNP位点生物信息的录入与判断系统建立。
下面结合具体实施例进行详细说明。
(a)暗纹东方鲀群体的获得。
本发明实验所用鱼取自江阴市申港三鲜养殖有限公司和江苏中洋集团股份有限公司五月龄左右的随机东方鲀600尾。用游标卡尺和电子天平测量其中300尾的头长、体长、体重三项生长指标，并取对应尾鳍于-20℃的95％乙醇中保存，以备基因组DNA提取；将剩余300尾置于可控温的循环水体中，在保持其它环境条件不变的情况下以每小时-1℃的温度降温，取出因水温关系失衡的个体并记录失衡温度，取对应尾鳍于-20℃的95％乙醇中保存，以备基因组DNA提取。
(b)暗纹东方鲀DNA的提取。
(1)取20～50mg的尾鳍，去离子水清洗尽量去除酒精，加入200μl组织裂解液TL后剪碎。完成后加入20μl(20mg/ml)的Proteinase K，震荡混匀1分钟，置于55℃裂解2h，至裂解液澄清。
(2)依次加入200μl结合液CB和100μl异丙醇，摇匀，13,000rpm离心5分钟。
(3)将上清液仔细吸出到GenClean Column中(放入收集管)，避免吸到沉淀与杂质。
(4)10,000rpm离心0.5分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。
(5)加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
(6)加入700μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
(7)加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
(8)将GenClean Column放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟。
(9)取出GenClean Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在70℃水浴中预热)，室温放置3分钟后12,000rpm离心1分钟。
(10)-20℃长期保存，4℃短期保存防止反复冻融。
(c)基于所述SNP引物，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增：
TGF120标记的PCR产物扩增长度约为350bp，PCR引物为：
正向引物(SEQ ID NO：3)：5’-GCATAGCTCCTCAGGGTA-3’；
反向引物(SEQ ID NO：4)：5’-CGGTAGATTAAGTTAAGTTCC-3’；
SNP41标记的PCR产物扩增长度约为420bp，PCR引物为：
正向引物(SEQ ID NO：5)：5’-AAAGTAGGTCACTGGTGC-3’；
反向引物(SEQ ID NO：6)：5’-CCCGTCTGTATTTGTTATG-3’。
PCR反应体系为20μL:Master Mix 10μL，正反向引物各0.8μL，DNA模板1μL，灭菌水7.4μL。
PCR反应共计35个循环，包括95℃预变性5min。每个循环包括95℃变性30s，60℃褪火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。
(d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP型。
基于Hiseq2000高通量测序平台和ABI3730测序仪对上述的暗纹东方鲀600尾个体的PCR扩增产物进行双向测序与拼接。基于测序结果，将暗纹东方鲀SNP位点分型。
(e)SNP位点碱基型与暗纹东方鲀生长性状的相关性分析。
暗纹东方鲀300尾个体的SNP位点碱基型与生长性状如表1所示(见末尾表1)，其余300尾个体的SNP位点碱基型与抗寒表现如表2所示(见末尾表2)。
根据表1的数据，利用SPSS(25.0)GLM程序进行基因多态性与性状间的关联分析，统计数据用平均值±标准偏差表示。SNP不同碱基型与生长性状相关性如表3所示。
根据表2的数据，利用SPSS(25.0)GLM程序进行基因多态性与性状间的关联分析，统计数据用平均值±标准偏差表示。SNP不同碱基型与抗寒能力相关性如表4所示。
表3.暗纹东方鲀TGF-β基因SNP位点与生长的相关性：
Figure BDA0002282344890000061
Figure BDA0002282344890000071
*表中表达方式为均值±标准偏差；平均值差值的显著性水平为0.05。
结果显示：SNPg.120C>A位点CC型与AA型的体重具有显著差异(P<0.05)，标准头长(头长与体长的比值)具有显著差异(P<0.05)。证明SNPg.120C>A是一个与生长显著相关，且可以区分两种不同长势的暗纹东方鲀的SNP位点。
表4.暗纹东方鲀CIRP基因SNP位点与生长的相关性：
Figure BDA0002282344890000072
*表中表达方式为均值±标准偏差；平均值差值的显著性水平为0.05。
结果显示：SNPg.41A>T位点AA型与TT型的失衡温度具有显著差异(P<0.05)。证明SNPg.41A>T是一个与抗寒能力显著相关，且可以区分两种不同抗寒能力的暗纹东方鲀的SNP位点。
分析可知，位于TGF-β基因上的SNP位点SNPg.120C>A与暗纹东方鲀生长显著相关，具体体现在CC型个体的体重显著高于AA型个体，而CC型个体的标准头长小于AA型个体(P<0.05)，CC型个体呈现出躯干更长，体重更大，因此可食用部分相对更多的长势；位于CIRP基因上的SNP位点SNPg.41A＞T与暗纹东方鲀抗寒表现显著相关，具体体现在低温下存活的AA型个体显著多于TT型个体(P＜0.05)，AA型的个体更能承受低温的环境刺激，越冬能力更强。因此可以优先选择SNPg.120C>A位点碱基型为CC的个体作为长势优良的育种亲本，优先选择SNPg.41A>T位点碱基型为AA的个体作为抗寒品系的育种亲本。在以快长、抗寒为选育目标的暗纹东方鲀遗传育种研究过程中，可以优先选择标记TGF120中SNPg.120C>A位点碱基型为CC的个体，且标记CIRP41中SNPg.41A＞C位点碱基型为AA的个体为育种亲本，这对于暗纹东方鲀优良新品系的选育具有重要的指导意义。
(f)SNP位点生物信息的录入以及判断系统建立与使用。
本发明根据Matlab编写了遗传质量判断系统，包括：
SNP录入模块，用于添加生SNP生物信息，包括SNP名称、SNP功能、引物信息、碱基型所关联的性状，SNP名称和功能描述了一个SNP位点与某一性状的关系，引物信息是利用基因组DNA根据所述SNP位点所设计得到的引物序列，即SNP的引物碱基序列，包括正向引物序列和反向引物序列。系统提供GUI页面供用户录入。
在本实施例中，在步骤(e)得到SNP位点相关性分析后，通过系统提供的GUI录入CODE ID NO:1(见说明书末尾)所示的代码，目的是将所述的SNPg.120(TGF120标记)与SNPg.41(CIRP41标记)生物信息录入系统，形成完整的判断系统。具体如下：
添加所需要radiobutton按钮，若需要添加SNP信息及引物信息，按照Matlab GUI通用radiobutton规则添加。添加方式为添加文本显示，采用的命令应符合此规则：str＝['For[SNP名称],[SNP功能],F-Primer:[正向引物序列]and R-Primer:[反向引物序列]']；其中，“SNP名称”为该SNP位点的命名，“SNP功能”为该位点与何种性状有关，“正向引物序列”为检测该位点的正向引物序列，“反向引物序列”为检测该位点的反向引物序列。本实施例中应按此格式添加TGF120与CIRP41的信息：
str＝['For TGF120,body weight-related SNP,F-Primer:GCATAGCTCCTCAGGGTAand R-Primer:CGGTAGATTAAGTTAAGTTCC']和['For CIRP41,cold resistance-relatedSNP,F-Primer:AAAGTAGGTCACTGGTGC and R-Primer:CCCGTCTGTATTTGTTATG']。
SNP每个碱基型所代表的SNP意义共有三种，较好GOOD,较差BAD,一般NORMAL。添加方式为添加文本显示，采用的命令应符合此规则：
①str＝['[SNP名称][三种碱基型中对性状有促进作用的碱基型GOOD]']；
②str＝['[SNP名称][三种碱基型中混合型碱基型NORMAL]']；
③str＝['[SNP名称][三种碱基型中对性状无促进作用的碱基型BAD]']
SNP信息选择模块，用于提供查看和选择SNP信息及SNP扩增必要引物的功能，所述SNP信息是SNP名称、功能，即此SNP位点与某一性状的关系，SNP扩增必要引物即SNP的引物碱基序列；系统提供GUI页面供用户选择，在当前实现中，可供验证的SNP碱基型可从TGF120位点与CIRP41位点中选择，在选择SNP分子标记后自动关联显示相应的引物序列信息。
SNP判断模块，从SNP信息选择模块中获得拟筛选性状引物并对未知个体进行扩增测序后，在判断模块中根据扩增测序后所得的SNP标记碱基型，判断所述个体在该SNP位点的遗传质量等级。
针对本模块，由于SNPg.120C>A位点中，碱基呈现CC型个体的体重显著高于AA型个体，且标准头长小于AA型个体(P<0.05)，CC型个体呈现出躯干更长，体重更大的长势。如有未知个体经过测序得到SNPg.120为CC(即测序峰图体现为纯C)，回馈结果即为GOOD，为AA(即测序峰图体现为纯A)则为BAD，AC型为NORMAL(即测序峰图体现为AC)；SNP位点SNPg.41A＞T的AA型个体相对于TT型个体而言有更高几率能承受低温的环境刺激，则如有未知个体经过测量得到SNPg.41为AA，回馈结果即为GOOD，为TT则为BAD，AT型为NORMAL。
输出模块，用于显示和输出SNP判断模块的判断结果。
参照图1，该质量判断系统的应用场景如下：
开始选育前，标记待选亲本，选育时，剪取小部分对应尾鳍组织进行基因组DNA提取；
根据需求调取对应标记的引物信息进行合成：从本系统调取CIRP41的引物信息合成验证抗寒能力引物；调取TGF120的信息合成验证长势优良的引物。合成采用一般PCR引物合成方法，本发明不做赘述；
根据步骤(c)进行PCR扩增和测序，得到待测亲本对应位点的碱基型；
根据得到的碱基型点击系统中对应标记的对应碱基型按钮，从显示框得到判断结果。GOOD判断为有较好遗传质量，BAD判断为遗传质量较差，NORMAL判断为遗传质量一般。图2示出了一实施例中TGF120标记碱基型为CC时的界面。
本发明通过选取600尾暗纹东方鲀样本并对每个个体进行基因组DNA提取、扩增和单核苷酸多态位点分析，发现SNPg.120C>A与暗纹东方鲀的体重、标准头长存在显著的相关性，能够有效地分辨两种不同长势的暗纹东方鲀，而SNPg.41A>T与暗纹东方鲀的抗寒能力存在显著的相关性，并且能够有效地分辨两种不同抗寒能力的暗纹东方鲀。将两种SNP标记生物信息录入质量判断系统，可省去非录入者以外的使用者验证标记的时间与资源消耗。新使用者仅需打开系统即可了解对应标记的信息与意义，并且可以自主添加新验证过的标记信息到系统，丰富系统的开源功能，大大提高了育种推广效率，加速了育种进程。因此，在高遗传质量暗纹东方鲀亲本的选择过程中，可以根据系统所提示的第三代分子标记选择优良遗传质量的亲本，例如优先选择SNPg.120C>A位点为CC的个体作为好长势的育种亲本，SNPg.41A>T位点为AA的个体作为耐低温的育种亲本，以达到精确选育，便捷推广，投入高新技术的育种目标。
本系统经推广进入各阶层科研院所后，可经科研、生产人员补充系统内容，将其标记内容涵盖方面扩大。当某一育种设施需要选择优良遗传质量亲鱼时即可通过此系统便捷获取各个标记信息进行亲鱼筛选，实现将科学技术推广至各层工作者的目的。
表1.暗纹东方鲀300尾个体SNP位点碱基型与体长、头长、体重和标准头长的关系
Figure BDA0002282344890000101
Figure BDA0002282344890000111
Figure BDA0002282344890000121
Figure BDA0002282344890000131
Figure BDA0002282344890000141
表2.暗纹东方鲀300尾个体SNP位点碱基型与耐受低温的关系
Figure BDA0002282344890000142
Figure BDA0002282344890000151
Figure BDA0002282344890000161
CODE ID NO:1
Figure BDA0002282344890000162
Figure BDA0002282344890000171
Figure BDA0002282344890000181
Figure BDA0002282344890000191
Figure BDA0002282344890000201
Figure BDA0002282344890000211
Figure BDA0002282344890000221
Figure BDA0002282344890000231
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 暗纹东方鲀SNP分子标记及其在遗传育种的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 353
<212> DNA
<213> 转化生长因子β(Transforming growth factor-β gene)
<400> 1
actgaatggg tgtggggggg atttgagtgt tgaatcaaag cctatctgca ggtacagtaa 60
gcagcaacag ctgttgtgaa agccagggag acagctctgt aattatccat ataggaggam 120
ccagattcca gcaacaacca aaagccccgc cttccctagg cacacttttg tttgcacgct 180
ttctttttta ccattaaata tgataattat tccagactgc taattttgac ttccagcaaa 240
aacaaagtgg ctggtttcca aaaccagaac agtatgtgca gcgattttaa ttgggcttcc 300
agggacacgt gtcgcagcaa aacggctgaa ggaacttaac taaatctacc gaa 353
<210> 2
<211> 418
<212> DNA
<213> 冷诱导结合蛋白(Cold inducible RNA-binding Protein)
<400> 2
tataaagacc ctttattcaa aagccctcaa ggtccaattg ygactaaata tggcaagtaa 60
catgtacata cgcacattca cgtcgagggc gcaggctatg ctaggccgca tggccgtgtg 120
ctaggtgtcg gtttggagct aacgggccgc attttttatc agcgccattt tgtagcattt 180
aagcccacgg tgctcatttt tgttttccag gccgatttca atacaaggcg agcacacacg 240
cgtcgggtat tacgagcaaa tctcggcata gataggctac aaacaaatta gataaattta 300
acggatgctc cctgcagacc gtgccaggca gacgtacacg caaatatcaa aaagcacgtt 360
ttgcacgcgt cgcagtgctt aattgacaca caataaaata tatcgacata acaaaacc 418
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcatagctcc tcagggta 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtagatta agttaagttc c 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagtaggtc actggtgc 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgtctgta tttgttatg 19

Claims (6)

1.暗纹东方鲀SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记是与暗纹东方鲀抗寒能力相关的SNP分子标记CIRP41，其所在碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述CIRP41位于SEQ IDNO:2所示序列的第41位y，碱基为A或T。
2.权利要求1所述的SNP分子标记在检测暗纹东方鲀的遗传育种质量中的应用，其特征在于，所述遗传育种质量为抗寒能力，包括以下步骤：
1）提取待测暗纹东方鲀的基因组DNA；
2）利用特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物包括正向引物、反向引物，其碱基序列分别为：
正向引物：5′- AAAGTAGGTCACTGGTGC-3′；
反向引物：5′- CCCGTCTGTATTTGTTATG-3′；
3）检测PCR扩增产物SNP位点CIRP41的碱基型是TT、AA还是TA；
4）选择SNP CIRP41位点AA型个体用作育种亲本。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为20μL: MasterMix 10μL，正反向引物各0.8μL，DNA模板1μL，灭菌水7.4μL；PCR反应共计35个循环，包括95℃预变性5min，每个循环包括95℃变性30s，60℃褪火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。
4.暗纹东方鲀遗传质量判断系统在检测暗纹东方鲀的遗传育种质量中的应用，其特征在于，所述遗传育种质量为抗寒能力，包括以下步骤：
1）提取待测暗纹东方鲀的基因组DNA；
2）根据需求从系统调取对应标记的引物信息进行合成；
3）进行PCR扩增和测序，得到待测亲本对应位点的碱基型；
4）根据得到的碱基型点击系统中对应标记的对应碱基型按钮，从显示框得到判断结果；
其中所述系统包括：
SNP信息选择模块，用于提供查看和选择SNP信息及SNP扩增必要引物的功能，所述SNP信息包括如权利要求1所述的CIRP41标记的SNP名称、SNP功能，所述SNP扩增必要引物包括正向引物序列和反向引物序列，其中，
正向引物序列为：5′- AAAGTAGGTCACTGGTGC-3′；
反向引物序列为：5′- CCCGTCTGTATTTGTTATG-3′；
SNP判断模块，用于根据对待测个体进行扩增测序后所得的SNP标记碱基型，判断所述个体在该SNP位点的遗传质量等级，其中，对于SNP位点SNPg. 41 A＞T碱基呈现AA型个体，判断遗传质量为较好GOOD，呈TT型判断遗传质量为较差BAD，呈AT型判断遗传质量为一般NORMAL；
输出模块，用于输出SNP判断模块的判断结果。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述系统还包括：SNP录入模块，用于添加SNP分子标记生物信息，包括SNP名称、SNP功能、正向引物序列和反向引物序列、碱基型所关联的性状。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述系统由Matlab软件实现。
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