CN109852703A - 一种与暗纹东方鲀肥满度相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记及其应用。所述的SNP分子标记来源暗纹东方鲀血清素受体4(HTR4)基因序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第100位存在SNP位点，碱基为C或G。本发明公开的SNP位点与暗纹东方鲀肥满度显著相关，可以有效应用于暗纹东方鲀的分子标记辅助育种，从而可以节省该鱼良种选育时间。该方法操作准确、简单实用。
Description
技术领域
本发明涉及一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记及其应用，属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域。
背景技术
暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)，俗称河鲀鱼，属硬骨鱼纲，辐鳍鱼亚纲，鲀形目，东方鲀属，是一种味道鲜美的名贵经济鱼类，与刀鱼、鲥鱼合称为“长江三鲜”，主要分布在中国、朝鲜半岛和日本等国家的沿海地区和内陆河流。直到1954年，长江下游野生河豚的产量可达到每年1000吨，但半世纪以来随着捕捞技术的迅速发展，无节制的捕捞使得暗纹东方鲀种群数量迅速下跌，致野生暗纹东方鲀的渔汛已经基本消失。所以，通过人工繁育来缓解市场对暗纹东方鲀的供求矛盾，不仅是一种必要的措施，也是减缓野生资源压力的方法。目前中国有江苏、广东、上海、福建、海南、浙江、四川、河南、湖北、安徽等省市开展了暗纹东方鲀的养殖，年产量约2万吨，产值可达数十亿。
但是，在暗纹东方鲀的实际生产的过程中，商品鱼生长速度依然较慢，抵抗力也较差，时常出现病害增加、肉质下降等种质退化现象。良种繁育已成为突破暗纹东方鲀产业瓶颈的要素之一。在实际暗纹东方鲀生产中，一些体重大的个体可能出现体型瘦长、肉质少且口感松散的发育特征，所以在该球形体型的鱼良种选育时仅仅对单一体长或者体重进行评价，可能会使得结论不太精确，不能全面而准确地反映其生长状况。而肥满度K(K＝(W/L3)×100％)是鱼体重量(W)与鱼体体长(L)立方数的比值，是反映鱼类肥瘦程度和生长情况的综合指标。因此以肥满度为参考指标，培育出体形浑圆、肉质饱满、生长快速的优良新品种是提升暗纹东方鲀产业养殖效率的有效方法。
分子育种，即分子标记辅助育种，是指利用DNA分子标记对育种目标进行标记选择，从而达到选育、改良特定遗传性状的目的，是一种传统遗传技术与现代分子生物学技术有机结合的新育种策略。随着分子生物技术的发展，分子标记辅助育种在鱼类育种工作中越来越重要，并开始展现出独特的优越、精确性和可靠性。单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms,SNPs)标记是第三代分子标记，具有多态性高、遗传稳定和检测方便等优点，已被广泛应用于各种分子育种的研究领域。迄今为止已有研究证实血清素受体4(HTR4)会显著影响动物胃排空和摄食能力，在人类和小鼠胃动力研究中都有报道，而在在虹鳟和齐口裂腹鱼中也有血清素拮抗剂的研究，但尚未见到有关暗纹东方鲀HTR4相关的SNPs应用报道。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明目的是：
a)提供一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记，即利用暗纹东方鲀HTR4基因上与肥满度显著相关的一个SNP位点进行分子标记辅助育种；
b)提供用于检测上述SNP分子标记的一对引物；
c)提供上述SNP分子标记的应用。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记，所述的SNP分子标记来源基因(HTR4)的部分基因组序列如SEQ ID NO：1所示，自5’端起，该序列的第100位存在SNP：g.100C>G SNP位点，核苷酸为G或C。该位点呈现CC型的个体肥满度显著高于GG型个体；
SEQ ID NO：1：219bp，DNA，HTR4(5-Hydroxytryptamine Receptor 4)
ATGCAGGTGTGTGTTGGGTTTCTAACACGGTTCCTGACGTGACTCTCCTCAGATCGAGGAGCGGCGCCACAGCGAGGGCAGTAACTCCACTTCCTGTGTGTTCATGGTCAACAAGCCCTACGCGCTCACCTGCTCCGTGGTGGCCTTCTACATCCCTCTGGTCCTCATGGTGCTGGCTTACCAGAGGATCTACGTCACGGCCCGAGCTCACGCCCTGCA
用于检测所述的SNP分子标记的引物对(特异性引物)，其上游正序引物序列为5’-CTCAGATCGAGGAGCGGC-3’(SEQ ID NO：2)；下游反向引物序列为5-’CCGAGCTCACGCCCTGC-3’(SEQ ID NO：3)。用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，应当包含所述的引物对。
所述的SNP分子标记、引物对和所述的试剂盒在暗纹东方鲀选育中的用途，进一步为检测或辅助检测暗纹东方鲀的肥满度性状中的应用。
一种检测暗纹东方鲀肥满度优劣的方法，包括以下步骤：提取待测暗纹东方鲀的基因组DNA，通过应用上述试剂盒与正反向引物对待筛选暗纹东方鲀进行所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测暗纹东方鲀肥满度的优劣。
所述检测暗纹东方鲀肥满度的方法，具体包括以下步骤：
a)暗纹东方鲀群体的获得；
b)暗纹东方鲀尾鳍DNA提取；
c)基于权利要求2所述的引物对，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP分子标记的核苷酸型；
e)SNPg.100C>G位点核苷酸型与暗纹东方鲀生长性状的相关性分析。
通过对暗纹东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析，所述SNPg.100C>G位点的CC核苷酸型个体的肥满度显著高于GG核苷酸型个体。
本发明以暗纹东方鲀HTR4基因的单核苷酸多态位点为研究目标，发现位于HTR4基因上的SNP位点SNPg.100C>G与暗纹东方鲀生长显著相关，具体体现在CC型个体的肥满度显著高于GG型(P<0.05)个体。在以肥满度为选育指标的暗纹东方鲀遗传育种研究过程中，可以优先选择SNPg.100C>G位点核苷酸型为CC的个体为育种亲本，这对于暗纹东方鲀优良新品系的选育具有重要的指导意义。
技术效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明公开的SNP位点可以进行分子标记辅助育种，不受暗纹东方鲀的性别限制，可用于暗纹东方鲀的早期选育，显著促进暗纹东方鲀的育种进程。
2)通过SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的一对引物，检测如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端第100位SNP位点的方法，准确可靠，操作方便。
附图说明
图1为暗纹东方鲀HTR4基因5’端第100位点部分测序峰图：其中①为CC型，②为CG型，③为GG型；
具体实施方式
通过具体实施例对本发明所述的技术进一步详细说明。
本发明基于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所述的一对引物对暗纹东方鲀基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析。得到了与暗纹东方鲀肥满度显著相关的SNP位点(SNPg.100C>G)，可应用于暗纹东方鲀分子标记辅助育种。
下面将通过具体实施例进一步说明
a)暗纹东方鲀群体的获得；
b)暗纹东方鲀基因组DNA提取；
c)基于所述SNP引物，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增；
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP的核苷酸型；
e)SNP位点核苷酸型与暗纹东方鲀肥满度(K＝(体重/体长3)×100％)的相关性分析；
f)SNP位点应用于暗纹东方鲀分子标记辅助育种。
具体操作如下：
a)暗纹东方鲀群体的获得：
本发明实验所用鱼取自江阴市申港三鲜养殖有限公司和江苏中洋集团股份有限公司5月龄左右的暗纹东方鲀301尾。用游标卡尺和电子天平测量其体长、体重两项生长指标。随后剪取鱼体尾鳍于95％乙醇-20℃保存，以备基因组DNA提取。
b)暗纹东方鲀DNA的提取：
(1)取15mg尾鳍，加入400uL ACL Solution，剪碎，再加10uL的Proteinase K，震荡混匀1分钟，置于55℃裂解约2h，至裂解液澄清。
(2)然后依次加入300uL Ext solution和300uL AB solution，用力摇匀，在12,000rpm离心5分钟。
(3)将枪头穿过上层溶液深入到下层溶液中，将溶液仔细吸出到GenClean Column中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。
(4)8000rpm离心1分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。
(5)将GenClean Column放回收集管中，加入500uLWash Solution，8,000rpm室温
离心1分钟。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12,000rpm室温离心1分钟，以除去残留Wash Solution。
(8)将柱放入新的洁净1.5mL离心管中，在柱中央加入60μL Elution Buffer，室温放置2分钟。然后12,000rpm室温离心1分钟。离心管中的液体即为所提取的DNA，-20℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
c)基于所述SNP引物，对暗纹东方鲀的基因组DNA进行PCR扩增
PCR产物扩增长度约为143bp，PCR引物为：
上游引物(SEQ ID NO：2)：5’-CTCAGATCGAGGAGCGGC-3’
下游引物(SEQ ID NO：3)：5’-CCGAGCTCACGCCCTGC-3’
PCR反应体系为50μL:2×Taq Master Max 25μL，正反向引物各2μL，DNA模板1μL，灭菌水20μL。
PCR反应共计35个循环，循环前95℃预变性5min，每个循环包括95℃变性30s，60℃褪火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20℃保存以用于后续的测序反应。
d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP型。
基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的暗纹东方鲀301尾个体的PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行双向测序与拼接。基于测序结果，将暗纹东方鲀SNP位点分型。
e)SNP位点核苷酸型与暗纹东方鲀生长性状的相关性分析
暗纹东方鲀301尾个体的SNP位点核苷酸型与生长性状如表1所示：根据表1的数据，利用SPSS(25.0)GLM程序，根据性状及试验群体的特点，构建线性分析模型从而进行基因多态性与性状间的关联分析：yij＝u+Gi+eij式中，yij为性状表型值，u为群体均值，Gi为标记为基因型效应(i＝1，2，1，4)，eij为随机残差效应。统计数据用平均值±标准偏差表示。SNP不同核苷酸型与肥满度相关性如表2所示。
表1暗纹东方鲀301尾个体SNP位点基因型与体长(L)、体重(W)和肥满度(K)的关系
备注：K＝(W/L3)×100％,K代表肥满度，W代表体重(克)，L代表体长(厘米)。
表2暗纹东方鲀HTR4基因SNP位点与生长的相关性
注：表中表达方式为均值±标准偏差。
结果显示：SNPg.100C>G位点CC型与GG型的肥满度具有显著差异(P<0.05)，其余指标无显著差异。证明SNPg.100C>G是一个与生长显著相关，且可以区分两种不同肥满度的暗纹东方鲀的SNP位点。
f)SNP位点应用于暗纹东方鲀分子标记辅助育种
如上文所述暗纹东方鲀HTR4基因上，SNPg.100C>G位点的CC型个体肥满度显著高于GG型个体。因此可以优先选择SNPg.100C>G位点基因型为CC的个体作为育种亲本。即选育前，先取小部分亲本组织进行PCR和测序，判断其肥满度遗传潜力。
本发明通过选取301尾暗纹东方鲀的样本，并对每个个体进行基因组DNA提取、扩增和单核苷酸多态位点分析，发现SNPg.100C>G与暗纹东方鲀的肥满度存在显著的相关性，并且能够有效地分辨两种不同肥满度质量的暗纹东方鲀。因此，在优质高产暗纹东方鲀的选择育种过程中，可以优先选择SNPg.100C>G位点为CC的个体作为育种亲本，以辅助实现快速、精确选育更肥美暗纹东方鲀优良品种的目标。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> HTR4(Hydroxytryptamine Receptor 4)
<400> 1
atgcaggtgt gtgttgggtt tctaacacgg ttcctgacgt gactctcctc agatcgagga 60
gcggcgccac agcgagggca gtaactccac ttcctgtgtg ttcatggtca acaagcccta 120
cgcgctcacc tgctccgtgg tggccttcta catccctctg gtcctcatgg tgctggctta 180
ccagaggatc tacgtcacgg cccgagctca cgccctgca 219
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcagatcga ggagcggc 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgagctcac gccctgc 17
Claims (8)
1.一种与暗纹东方鲀肥满度相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO：1所示序列的第100位，碱基为C或G。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，SNP位点的CC型暗纹东方鲀个体的肥满度性状显著高于GG型个体。
3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如下所示：
正向引物：5′-CTCAGATCGAGGAGCGGC-3′，如SEQ ID NO:2所示；
反向引物：5′-CCGAGCTCACGCCCTGC-3′,如SEQ ID NO:3所示。
4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的特异性引物。
5.权利要求1或2所述的SNP分子标记，权利要求3所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒在暗纹东方鲀的分子辅助选择育种中的应用。
6.权利要求1或2所述的SNP分子标记，权利要求3所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测暗纹东方鲀的肥满度性状中的应用。
7.一种检测暗纹东方鲀的肥满度性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测暗纹东方鲀的基因组DNA，利用权利要求3所述的特异性引物或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，检测权利要求1所述SNP位点基因型是CC、CG还是GG，最后进行不同基因型与暗纹东方鲀的肥满度性状的相关性分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP位点的CC型个体的肥满度性状显著高于GG型个体。
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