CN116516018A - 一种与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记、特异引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体公开了一种与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记、特异引物及其应用。在白色品系“粉玉”瓯江彩鲤Scarb1基因上游启动子区域(起始密码子ATG上游652bp处)有355bp的DNA片段插入，而纯合红色品系“全红”瓯江彩鲤无此355bp的DNA片段插入，该DNA片段即为所述的结构变异分子标记，其序列如SEQ ID NO:1所示。所述结构变异分子标记的特异引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。利用所述特异引物对待测红色品系瓯江彩鲤的基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱的条带大小即可判定红色品系瓯江彩鲤是纯合型还是杂合型。本发明能够辅助瓯江彩鲤的遗传育种工作，实现低成本且准确高效的红色品系瓯江彩鲤保种和选育。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记、特异引物及其应用。
背景技术
瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var.color)是浙江省瓯江流域广泛养殖的一种地方性鲤鱼种类，体色鲜艳，具有食用和观赏双重价值，已有1200余年的当地养殖历史。自1999年以来，以体色和生长等性状为选育指标，进行了“全红”(全身体表为红色)、“大花”(红色体表镶嵌大块黑色斑块)、“麻花”(红色体表镶嵌小的黑色斑点)、“粉玉”(全身体表为白色)和“粉花”(白色体表镶嵌大块黑色斑块)5个配套选育系的构建和选育，其体色纯度和生长速度、形态性状等均已取得了明显的选育效果。
在我国市场上，消费者明显偏爱体色为红色的瓯江彩鲤，“红色”成为了瓯江彩鲤的一种“包装性状”，红色瓯江彩鲤市场占有率高，售价也相对较高。然而，对于瓯江彩鲤的体色性状而言，红色对于白色在遗传上为显性性状。当纯合“全红”与“粉玉”瓯江彩鲤杂交后，子一代均为红色体色类型，但是其在遗传上为杂合状态(带有白色“粉玉”的遗传物质)，此子一代自交后在F2代中体色会出现性状分离，出现白色的“粉玉”个体(红色：白色为3：1)。因此，在瓯江彩鲤的实际育种工作中，对于红色品系的瓯江彩鲤，需要选择遗传上纯合的红色个体进行保种和选育。杂合状态的红色个体会造成后代出现白色个体，不利于红色品系“全红”瓯江彩鲤的保种、选育和产业推广应用。
由此可见，若能开发出体色特异的分子标记用于红色瓯江彩鲤遗传纯度的检测，将对红色品系“全红”瓯江彩鲤的选育和产业推广至关重要，这将明显缩短育种周期，提高育种效率，增强产业应用效果和市场占有率。
发明内容
鉴于以上所述现有的技术问题，本发明的目的之一是提供与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记。在白色品系“粉玉”瓯江彩鲤Scarb1基因上游启动子区域(起始密码子ATG上游652bp处)有355bp的DNA片段插入，而纯合红色品系“全红”瓯江彩鲤无此355bp的DNA片段插入，所述355bp的DNA片段即为所述的结构变异分子标记，将其命名为SV355，所述SV355的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的目的之二是提供一种用于鉴别红色品系“全红”瓯江彩鲤是否为纯合的特异引物。所述特异引物的序列为：
正向引物：5'-GCGCTCCAAAAGAATCCTAAGC-3'(SEQ ID NO:2)；
反向引物：5'-ACGCCTCCTACAGCTAGATAGA-3'(SEQ ID NO:3)。
本发明的目的之三是提供一种用于鉴别红色品系“全红”瓯江彩鲤是否为纯合的方法，包括以下步骤：
(1)收集待测红色品系瓯江彩鲤个体尾鳍样品，提取基因组DNA；
(2)采用权利要求3所述的特异引物对基因组DNA进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并根据电泳图谱的电泳条带大小判定待测样品为纯合型还是杂合型。
具体的，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系为10μL体系，包括：正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，2×PCR Taq mix 5μL，ddH2O 3μL，模板DNA 1μL。所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
具体的，步骤(3)中，所述琼脂糖凝胶电泳采用1.2％的琼脂糖凝胶，电泳的时间为30min。根据电泳图谱的条带大小判定遗传纯度的方法如下：如果只有843bp(序列如SEQ IDNO:4所示)的电泳条带，则待测红色品系瓯江彩鲤个体为纯合型；如果有843bp和1198bp(序列如SEQ ID NO:5所示)两条电泳条带，则待测红色瓯江彩鲤个体为杂合型。
本发明基于与瓯江彩鲤体色相关的结构变异分子标记，利用一对特异引物就能快捷高效地在分子水平上鉴别瓯江彩鲤的红色个体是否为纯合，根据琼脂糖凝胶电泳扩增产物特异性条带就可鉴别瓯江彩鲤全红个体的遗传纯度。本发明具有以下优点：(1)本发明所提供的分子标记、特异引物及方法可以无损检测红色品系瓯江彩鲤的遗传纯度，通过采集鳍条或者血液DNA即可完成检测；(2)本发明所述方法不受瓯江彩鲤性别、年龄以及生理状态的限制，任何时期任何状态下均可进行检测；(3)本发明所述方法不用进行测序分型，仅通过琼脂糖凝胶电泳检测即可完成精准检测，成本低、时间快、准确性高。
附图说明
图1：实施例1中“粉玉”瓯江彩鲤Scarb1基因启动子区域的结构变异模式图；
图2：实施例2中纯合“全红”和“粉玉”个体结构变异区域的序列比对图；
图3：实施例3中瓯江彩鲤24条“全红”和“粉玉”家系的F2代红色个体SV355结构变异扩增的凝胶电泳图，其中第1泳道为Marker，第2-25泳道均为瓯江彩鲤红色个体扩增的条带。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1：结构变异分子标记SV355的获得
Scarb1基因(B类Ⅰ型清道夫受体)在类胡萝卜素吸收和转运过程中发挥重要作用，在瓯江彩鲤中，利用CRISPR-Cas9技术敲降红色品系“全红”瓯江彩鲤Scarb1基因的表达后，与野生型“全红”彩鲤相比，突变嵌合体“全红”彩鲤皮肤出现显著的红色减退现象，表明Scarb1基因与瓯江彩鲤红色体色形成密切相关。我们对“全红”和“粉玉”瓯江彩鲤Scarb1基因进行PCR扩增，然后送至生工生物工程股份有限公司进行单克隆测序，测序结果发现在Scarb1基因的启动子区域存在一个结构变异，在白色品系“粉玉”瓯江彩鲤起始密码子(ATG)上游652bp处存在一个355bp的DNA片段插入(如图1所示)，将该片段命名为SV355，白色品种基因型定义为SV355+/+；而“全红”瓯江彩鲤个体中，存在完全没有此355bp片段插入的纯合型和有此355bp片段插入的杂合型，将红色纯合型和杂合型分别定义为SV355-/-和SV355-/+。因此，利用此分子标记可以准确、便捷地检测瓯江彩鲤的红色个体为纯合还是杂合状态，从而便于进行红色品系“全红”瓯江彩鲤的遗传育种和产业上的苗种纯合度检测。
实施例2：“全红”和“粉玉”瓯江彩鲤结构变异SV355的检测1.引物设计
根据瓯江彩鲤Scarb1基因启动子区域的序列(SEQ ID NO:4)设计引物，具体是对包含所述SV355片段插入位置的DNA区域设计PCR扩增引物，在结构变异SV355上游504bp处设计的上游引物，在结构变异SV355下游296bp处设计的下游引物效果最佳，无非特异性扩增。设计的引物序列如下：
正向引物F：5'-GCGCTCCAAAAGAATCCTAAGC-3'(SEQ ID NO:2)；
反向引物R：5'-ACGCCTCCTACAGCTAGATAGA-3'(SEQ ID NO:3)。
2.样品基因组DNA的提取
取瓯江彩鲤纯合“全红”和“粉玉”个体，收集鳍条组织，采用常规苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。
3.目标序列的PCR扩增
采用上述步骤1的引物对上述步骤2瓯江彩鲤基因组DNA进行PCR扩增。PCR的反应体系为：正向引物和反向引物各0.5μL(10uM),2×PCR Taq mix 5μL,DNA 1μL(100ng),用超纯水补足至10μL。PCR的反应条件为：首先95℃预变性5min，然后进行35个循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min20s)，最后72℃延伸10min，4℃保存。
4.SV355基因型的判定
PCR扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，采用1.2％的琼脂糖凝胶，电泳的时间为30min。电泳结束后，用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶拍照，获得电泳图谱。根据电泳图谱的条带大小判定遗传纯度，结果如下：红色品系“全红”瓯江彩鲤样品只扩增出843bp的单条带，基因型为SV355-/-，白色品系“粉玉”瓯江彩鲤样品只扩增出1198bp的单条带，基因型为SV3565+/+。
5.序列比对
将PCR产物送生物公司进行测序，分别获得纯合“全红”和“粉玉”的PCR扩增序列后，利用Clustal W软件进行序列比对，即可展示出“粉玉”个体相较于“全红”个体有355bp的序列插入(如图2所示)。
实施例3：“全红”和“粉玉”瓯江彩鲤家系F2子代中红色个体SV355分子标记的检测
随机收集“全红”和“粉玉”家系的F2代中24条红色个体，采集鳍条组织后，提取基因组DNA，然后按照实施例2的方法，进行24个个体的PCR扩增和电泳图谱检测，若电泳图谱显示只有一条843bp(SEQ ID NO:4)的条带,此时所检测的红色瓯江彩鲤个体为遗传纯合，若电泳图谱显示有1198bp(SEQ ID NO:5)和843bp的两条带，此时所检测的红色瓯江彩鲤个体为遗传杂合。
电泳结果如图3所示，在随机选取的24个瓯江彩鲤个体中有7个样本只扩增出一条843bp的特异性条带，表明这些样本为纯合样本；17个样本扩增出两条条带，长度分别为843bp和1198bp，证明这些样本为杂合样本。
本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记，其特征在于：所述结构变异分子标记是瓯江彩鲤Scarb1基因起始密码子ATG上游652bp处的插入或缺失的355bp的DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的与瓯江彩鲤体表体色相关的结构变异分子标记，其特征在于：白色品系瓯江彩鲤表现为所述结构变异分子标记的插入，纯合红色品系瓯江彩鲤表现为所述结构变异分子标记的缺失。
3.权利要求1所述的结构变异分子标记的特异引物，其特征在于：所述特异引物的序列为：
正向引物：5'-GCGCTCCAAAAGAATCCTAAGC-3'；
反向引物：5'-ACGCCTCCTACAGCTAGATAGA-3'。
4.权利要求1所述的结构变异分子标记在鉴定红色品系瓯江彩鲤遗传纯度中的应用。
5.根据权利要求4所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于：应用方法包括以下步骤：
(1)收集待测红色品系瓯江彩鲤个体尾鳍样品，提取基因组DNA；
(2)采用权利要求3所述的特异引物对基因组DNA进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并根据电泳图谱的电泳条带大小判定待测样品为纯合型还是杂合型。
6.根据权利要求5所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系为10μL体系，包括：正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，2×PCR Taq mix 5μL，ddH2O 3μL，模板DNA 1μL。
7.根据权利要求5所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸1min20s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。
8.根据权利要求5所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述琼脂糖凝胶电泳采用1.2％的琼脂糖凝胶，电泳的时间为30min。
9.根据权利要求5所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于：步骤(3)中，根据电泳图谱的条带大小判定遗传纯度的方法如下：如果只有843bp的电泳条带，则待测红色品系瓯江彩鲤个体为纯合型；如果有843bp和1198bp两条电泳条带，则待测红色瓯江彩鲤个体为杂合型；所述843bp的序列如SEQID NO:4所示，所述1198bp的序列如SEQ ID NO:5所示。
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