CN108588244B - 一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用 - Google Patents
一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用，属于水产动物分子遗传学领域。本发明分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。该分子标记的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明还提供了一种含有该分子标记的引物对的试剂盒。以及该分子标记的引物对在鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼中的应用。本发明基于鲤基因组知识、开发了一个分子标记，在基因层面上提供了一种鉴别鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的方法，有效的避免了外观形态难以区分、背景来源不明确及加工形态破坏等造成的难以鉴定区分问题。具有简便、快速、高效、准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用，属于水产动物分子遗传学领域。
背景技术
鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)是常见的重要淡水经济鱼类，目前我国的年产量均在300万吨以上。鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)同属于鲤科鲤亚科，亲缘关系较近、形态结构相似。鲤生长速度较快、性成熟较鲫晚，商品鱼规格常在1-2千克；鲫生长较鲤慢，通常1年即性成熟，商品鱼规格常在0.5公斤左右。虽然鲤在生长速度等方面更具优势，但是鲫肉嫩味鲜的特点更为突出，相同环境下鲫品质一般优于鲤，市场上的单价约为鲤的一倍。鲤鲫种间杂交可以产出正常的后代，在外观形态、生长速度、鱼肉品质方面均介于鲤鲫之间。因此，有业者专门培育鲤鲫杂交种，综合鲤鲫两亲本的优点。
现有的鲤、鲫及鲤鲫间杂交品种的鉴定方法主要是依据外观形态区分或利用PCR-RFLP技术分析线粒体DNA的部分序列。前一种基于形态学鉴定的方法简单直观，如检测体长、体高、头长、吻长、眼间距、尾柄长、尾柄高与体长比等可量性状，但这种直观的检验方式对专业知识要求较高，同时还需要对被检测鱼的来源背景有一定的了解，鉴定结果才能具有较高的准确性。近些年随着分子生物学的兴起，诞生了后一种线粒体DNA的检测方式，但是由于线粒体DNA是母系遗传的，并不能单独依据这种方法的鲤鲫间杂交鱼的进行鉴定。到目前为止，现有的技术还没有能够高效解决这一问题的方法。
发明内容
为解决现有依据形态学鉴定方式外观形态难以区分、背景来源不明确及加工形态破坏等造成的难以鉴定区分，以及线粒体DNA不能够解决鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的鉴定问题。本发明提供了一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲫；同时具有SEQ IDNO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼。该分子标记位于鲤基因组的9号染色体上，位于2735622至2736099区间内。
优选地，所述分子标记的引物对如SEQ ID NO.1-2所示，其中：上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；通过所述引物对扩增出同时具有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.3所示的481bp核苷酸序列的样本鉴定为鲤；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.4所示的958bp核苷酸序列的样本鉴定为鲫。
本发明还提供了上述分子标记在鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼中的应用。
本发明还提供了一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，其中：上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过上述分子标记引物对扩增出同时具有SEQ IDNO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼；通过所述分子标记引物对对只扩增出SEQ ID NO.3所示的481bp核苷酸序列的样本鉴定为鲤；通过所述分子标记引物对只扩增出SEQ ID NO.4所示的958bp核苷酸序列的样本鉴定为鲫。
如SEQ ID NO.1-2所示的分子标记引物对在鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼中的应用。
一种用于鉴定鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的试剂盒，该试剂盒包含如SEQ IDNO.1-2所示的分子标记引物对。
本发明还提供了一种鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的方法，按照如下步骤进行：
1)提取待检验鱼样本的基因组DNA；
2)以待检验鱼样本的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-2所示的分子标记引物对进行PCR扩增反应，获得PCR产物；
3)电泳检测PCR产物，经检测若只得到长度为481bp的单一片段，则待检验鱼为鲤；若只得到长度为958bp的单一片段，则待检验鱼为鲫；若同时得到481和958bp两条片段，则待检验鱼为鲤鲫间的杂交鱼。
优选地，步骤2)所述PCR扩增反应的反应体系是由30ng/μL基因组DNA1.0μL，10μmol/L上游引物F 0.6μL，10μmol/L下游引物R 0.6μL，2μL 10×PCR Buffer，2μL 2mmol/LdNTP，1U Ex Taq酶和ddH2O组成的20μL反应体系。
优选地，步骤2)所述PCR扩增反应的条件为94℃预变性2min；35个循环，每个循环94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃终延伸7min。
本发明分子标记及其引物对的开发是根据NCBI数据库(National Center forBiotechnology Information)中已发布的鲤、鲫基因组数据信息，将鲤、鲫基因组进行同源序列分析比对，筛选获得大量的差异基因序列，从这些序列的同源区设计引物，分别以鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的DNA为模板进行PCR扩增及产物测序分析，从中筛选验证得到鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的差异序列SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4，同时筛选得到相应的分子标记的引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。
本发明有益效果：
本发明基于鲤基因组知识、开发了一个分子标记，在基因层面上提供了一种鉴别鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的方法，有效的避免了外观形态难以区分、背景来源不明确及加工形态破坏等造成的难以鉴定区分问题。具有简便、快速、高效、准确的优点。
本发明的一对分子标记引物，基于鲤鲫保守的基因序列，引物具有特异性强、扩增效率高的特点，且产物不会产生非特异性扩增，结果不需测序检测，只需琼脂糖凝胶电泳(无需酶切)便可以直观的从片段大小上进行区分，且可以同时鉴定多个待检验样品。具有简单、高效、精确、成本低等特点。
本发明利用一对分子标记引物对鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼在基因水平上进行鉴别，引物对序列为F和R。利用这一对引物对待检验鱼样本进行基因型的PCR扩增检测，若只得到长度为481bp的单一片段，则待检验鱼为鲤；若只得到长度为958bp的单一片段，则待检验鱼为鲫；若同时得到481和958bp两条片段，则待检验鱼为鲤鲫间的杂交鱼。
附图说明
图1为实施例1电泳图；
图中，泳道M为DL2000 DNA marker；泳道1-4为鲤样品；泳道5-8为鲫样本；泳道9-12为鲤鲫间杂交鱼样本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：
根据NCBI数据库(National Center for Biotechnology Information)中已发布的鲤、鲫基因组数据信息。将鲤、鲫基因组进行同源序列分析比对。筛选获得大量的差异基因序列。从这些序列的同源区设计引物，分别以鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的DNA为模板进行PCR扩增及产物测序分析，从中筛选验证得到鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼的差异序列，即分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4，同时还筛选得到相应的分子标记的引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。
上述分子标记可以用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的鉴别，具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲫；同时具有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼。
上述分子标记的引物对由上游引物F和下游引物R组成，其中：上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体核苷酸序列为：
F:TTATGCTGTGGCTGTGGTCAAGA
R:GAGGGCTCCTTCATCACCAGAGT。
通过上述引物对扩增出同时具有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.3所示的481bp核苷酸序列的样本鉴定为鲤；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.4所示的958bp核苷酸序列的样本鉴定为鲫。
实施例2
本实施例提供了一种鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的方法，按照如下步骤进行：
1)提取待检验鱼样本的基因组DNA；
2)以待检验鱼样本的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-2所示的引物对进行PCR扩增反应，获得PCR产物；
3)电泳检测PCR产物，经检测若只得到长度为481bp的单一片段，则待检验鱼为鲤；若只得到长度为958bp的单一片段，则待检验鱼为鲫；若同时得到481和958bp两条片段，则待检验鱼为鲤鲫间的杂交鱼。
实施例3
本实施例以4个鲤样本(分别标号样本1-4)、4个鲫样本(分别标号样本5-8)和4个鲤鲫间杂交鱼样本(分别标号样本9-12)作为待检验样本，分别利用实施例1的分子标记的引物对和鉴别方法对鲤、鲫及鲤鲫间杂交鱼样本在基因水平上进行鉴别和验证方法的准确性，具体检验方法及流程如下：
一、待检验鱼的基因组DNA提取：
(1)剪取少量待检验鱼的鳍条或肌肉组织，放入2mL离心管中；
(2)加入600μLDNA提取裂解液。裂解液成分:1M Tris pH8.0、5M NaCl、0.5M EDTApH8.0、10％SDS和200μg/mL Protein K，混匀；
(3)于55℃消化10小时；
(4)加入等体积600μL的酚氯仿混合液(1:1)抽提1次，高速离心机12000rpm离心10min；
(5)吸取上清(约550μL)加入1ml无水乙醇沉淀，12000rpm离心10min，弃上清；
(6)加入1ml 70％酒精洗涤1次，5000rpm离心3min，弃去上清液留沉淀；
(7)室温干燥10min，加入100μL的0.1×TE溶液使沉淀充分溶解。
(8)利用仪器Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)测定DNA浓度后稀释至30ng/μL，保存于4℃备用。
二、PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板，利用Ex Taq(TaKaRa公司)进行PCR扩增，引物(F，R)的扩增体系如下：
PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，反应结束后72℃延伸5min，4℃保存。
三、凝胶电泳检测
PCR扩增反应结束后，向产物中加4μL的6×溴酚蓝均匀混合后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳条件采用140V电压，20min。电泳结束后将凝胶置于多功能凝胶成像仪的紫外光下检测PCR扩增产物目的片段的长度。泳道1-12依次加入样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6、样本7、样本8、样本9、样本10、样本11和样本12。
电泳过程中所用到的0.5×TBE缓冲液及用1％琼脂糖凝胶配制方法如下：
(1)0.5×TBE缓冲液：5.4g的Tris粉，2.7g的硼酸，加入800ml双蒸水中充分溶解，再加入2ml0.5M的EDTA(pH＝8.0)混匀后，定容1000ml，此时得到的即为0.5×TBE缓冲液
(2)1％琼脂糖的制备：称取琼脂糖0.5g于三角瓶中；加入0.5×TBE缓冲液，50mL；采用微波炉中火加热2min使其充分溶解，室温放置3min，溶液温度冷却至50℃-60℃，加入核酸染料2μL，摇匀使其充分混合，倒入制胶模中，缓缓插上梳子并静止冷却使其凝固。
四、结果分析：
如图1所示：泳道M为DL2000 DNA marker；泳道1-4待检测样品的电泳结果为481bp的单一片段，按照本发明方法鉴定为鲤；泳道5-8检测样品的电泳结果为958bp的单一片段，按照本发明方法鉴定为鲫；泳道9-12检测样品的电泳包含481bp与958bp的两条片段，按照本发明方法鉴定为鲤鲫间杂交鱼。
将上述鉴定结果与每个泳道对应的样本实际品种进行比较发现：本发明方法的鉴定结果与每个样本对应的实际鱼类品种完全一致，说明本发明鉴别方法的准确率高达100％。
实施例4
本实施例提供了一种用于鉴定鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的试剂盒，该试剂盒含有如SEQ ID NO.1-2所示的鉴别引物对，具体核苷酸序列为：
F:TTATGCTGTGGCTGTGGTCAAGA
R:GAGGGCTCCTTCATCACCAGAGT。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
<120> 一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记及其引物与应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 上游引物F
<400> 1
ttatgctgtg gctgtggtca aga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 下游引物R
<400> 2
gagggctcct tcatcaccag agt 23
<210> 3
<211> 481
<212> DNA
<213> 分子标记481bp
<400> 3
ttatgctgtg gctgtggtca agagtgacac agacttcagc atcaatgatc tcaaaggaaa 60
gacttcatgc cacagttgtt atcaaagccc tggaggctgg aatataccca ttggaagact 120
ggttgcacaa aataagcttc cctgggatgg tcctgatgac atgcctcttg agaagggcta 180
gcaaaaatta catcagatga ctaaaatatt aatattactg tattatttat tttattgttt 240
tatgaggtgc cgtctgataa gcgggataca aaaacaataa caatatagat ttcacaatac 300
attaacagtt ttttttgttg tgtttttttt ttgtgtgtgt cttccagctg tgtcacaatt 360
cttttcaagc agttgcattc ctggaatatc gaaagccctg tacccacatt tgtgtcaagc 420
ttgccagggt gactgcagct gctcacaaaa tgaaaagtac tctggtgatg aaggagccct 480
c 481
<210> 4
<211> 958
<212> DNA
<213> 分子标记958bp
<400> 4
ttatgctgtg gctgtggtca agagagacac agacttcagc atcaatgatc tcaaaggaaa 60
gacttcatgc cacagttgtt atcaaagccc tggaggctgg aataatgcca ttggaagact 120
ggttgcacaa aacaagattc cctgggatgg tcctgatgac atgcctcttg aaaagggtta 180
gtgtggctag attattaatg tgtaaattat tattacacag gaatctgaaa tatcagtatt 240
cagtggtctt gtatttgcta atattaaccg tcatccatgg taactctgcg tccatcatat 300
ttttaaaata aaatcagacc caaccatttt ttacttcagt gtacaaggct tccagtgttg 360
gccgcatagt aattttatct aaaacagtcc gttataattc ttaatgttgt aaactggtat 420
ttgtcattat atttgttcaa tttttattgt cataaccatg aggacctttt tactgcactt 480
tgttattctt gtagattttt ttatctatag tggctatcca ctcattcctg taactgaaag 540
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tttcacacca cattctcatt ttatacaagt gcacctggca ccatcttgga tctctgatat 660
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ttcaagcagt tgcattcctg gaatatcgaa agcactgtac ccaaacctgt gtcaagcttg 900
ccagggtgac tgcagctgtt cagacaggga aaagtactct ggtgatgaag gagccctc 958
Claims (8)
1.一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲫；同时具有SEQ ID NO.3及SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼。
2.权利要求1所述的分子标记在鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼中的应用，其特征在于，所述应用中具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤；具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲫；同时具有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼。
3.一种用于鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的分子标记引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，其中：上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求3所述的分子标记引物对在鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼中的应用，其特征在于，所述应用为上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；通过所述引物对扩增出同时具有SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的样本鉴定为鲤鲫间杂交鱼；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.3所示的481bp核苷酸序列的样本鉴定为鲤；通过所述引物对只扩增出SEQ ID NO.4所示的958bp核苷酸序列的样本鉴定为鲫。
5.一种用于鉴定鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如SEQ ID NO.1-2所示的分子标记引物对。
6.一种鉴别鲤、鲫和鲤鲫间杂交鱼的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
1)提取待检验鱼样本的基因组DNA；
2)以待检验鱼样本的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-2所示的分子标记引物对进行PCR扩增反应，获得PCR产物；
3)电泳检测PCR产物，经检测若只得到长度为481bp的单一片段，则待检验鱼为鲤；若只得到长度为958bp的单一片段，则待检验鱼为鲫；若同时得到481和958bp两条片段，则待检验鱼为鲤鲫间的杂交鱼。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）所述PCR扩增反应的反应体系是由30 ng/µL基因组DNA 1.0µL，10μmol/L上游引物F 0.6µL，10μmol/L下游引物R 0.6µL，2µL10×PCR Buffer，2µL 2mmol/L dNTP，1U Ex Taq酶和ddH2O组成的20µL反应体系。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）所述PCR扩增反应的条件为94℃预变性2min；35个循环，每个循环94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃终延伸7min。
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