CN111118130B - 快速鉴别罗氏沼虾性别的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于水产养殖技术领域，具体涉及一种快速鉴别罗氏沼虾性别的方法，该方法包括：从罗氏沼虾组织中提取罗氏沼虾基因组DNA；设计引物并进行PCR扩增，该引物对为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或者与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同源性80％以上的序列；将PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测罗氏沼虾的遗传性别。该方法能够通过一次PCR，采用一种引物对，快速区分三种不同基因型(ZZ、ZW和WW)的罗氏沼虾，可以用来鉴别产生单性苗种的亲虾及虾苗的性别，具有重大应用价值。

Description

快速鉴别罗氏沼虾性别的方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种快速鉴别罗氏沼虾性别的方法。
背景技术
罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)属于节肢动物门，生长在淡水或咸淡水中，分布于印度洋、太平洋热带及亚热带地区。其个体大，食性广，肉质鲜嫩，营养价值高，是世界上养殖价值较高的虾类品种之一。
罗氏沼虾的养殖过程存在以下特点：1.雌雄虾生长差异大，雄虾的生长速度比雌虾快50％以上；2.将罗氏沼虾雌雄混养，性成熟开始交配消耗能量影响生长；3.在养殖过程中，罗氏沼虾雌雄混养，雄性领域性更强，残杀严重；4.雌虾攻击行为弱，适合高密度养殖。因此，改变罗氏沼虾雌雄混养的格局，推广单性养殖模式，可以显著提高养殖的经济效益。
罗氏沼虾属于ZW或ZZ型，其中ZW发育为雌性个体，而ZZ发育为雄性个体。甲壳类动物所特有的内分泌腺—促雄性腺(androgenic gland)对其性别分化有举足轻重的作用。通过调控性别分化过程中促雄性腺激素基因的表达，可以得到假雄虾(遗传性别为ZW，但生理表现为雄性)、假雌虾(遗传性别为ZZ，但生理表现为雌性)和超雌性(遗传性别为WW，生理表现为雌性)。利用这些人工干预促雄性腺激素基因得到的虾，可进一步交配产生全雄或全雌单性虾苗(参见中国专利申请CN107406825A,CN101981046B)。如何快速、正确区分罗氏沼虾的遗传性别，对亲虾及虾苗进行性别鉴定，是产生单性苗种的重要步骤。
现有技术通过分析罗氏沼虾基因组的扩增长度多态性(amplified fragmentlength polymorphism)，获得了罗氏沼虾雌性特异扩增片段(Jiang et al.,2013)，建立了罗氏沼虾雌性性别特异扩增的方法(CN 102719531 A)。然而，由于缺乏雄性特异基因组片段，该方法存在一定的局限性：1.不能区分ZW和WW基因型；2.出现假阳性(如PCR污染)或假阴性(基因组质量问题或PCR扩增出现问题)时难以准确判断性别。
随着罗氏沼虾向单性养殖模式的转变，研发一种同时区分不同基因型(即ZW，ZZ和WW)的方法尤为重要。
参考文献：
Jiang XH,Qiu GF.Female-only sex-linked amplified fragment lengthpolymorphism markers support ZW/ZZ sex determination in the giant freshwaterprawn Macrobrachium rosenbergii.Anim Genet，201344:782-785.
发明内容
为解决以上问题，本申请的发明人通过较低的退火温度进行罗氏沼虾基因组的扩增长度多态性扩增(Jiang et al.,2013)，得到了罗氏沼虾雌雄性别的基因组特异片段(见附图1)。在此基础上，本发明首次建立了快速区分罗氏沼虾三种不同基因型的方法。
本发明提供了一种快速鉴别罗氏沼虾性别的方法，该方法能够快速对罗氏沼虾ZZ、ZW和WW基因型进行区分，解决了罗氏沼虾遗传性别鉴定问题，为罗氏沼虾性控育种奠定了良好的基础。
发明采用以下技术方案解决了上述技术问题：
一种快速鉴别罗氏沼虾性别的方法，包括以下步骤：
S1：从罗氏沼虾组织中提取罗氏沼虾基因组DNA；
S2：针对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列设计引物并进行PCR扩增；
S3：将S2中PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据电泳带型判定所检测的罗氏沼虾的遗传性别。
本发明还提供一种快速鉴别罗氏沼虾三种基因型的方法，该方法包括以下步骤：
S1：从罗氏沼虾组织中提取罗氏沼虾基因组DNA；
S2：利用如下引物对S1的基因组DNA进行PCR扩增：
F：GATGACTGACTGYNGACGACTGAC(SEQ ID NO:3)
R:TAGAAGAGAAAAGTCATTGGAAGC(SEQ ID NO:4)，
其中兼并碱基Y代表该位点碱基为C或T，兼并碱基N代表该位点碱基为A或T；
S3：将步骤S2扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测罗氏沼虾的遗传性别。
本发明还提供一种同时区分三种基因型罗氏沼虾的PCR检测试剂盒，该试剂盒包括如下引物：F：GATGACTGACTGYNGACGACTGAC(SEQ ID NO:3)；R:TAGAAGAGAAAAGTCATTGGAAGC(SEQ ID NO:4)，其中兼并碱基Y代表该位点碱基为C或T，兼并碱基N代表该位点碱基为A或T。
本发明的有益效果是：本发明的检测方法能够通过一次PCR，采用单一引物对，PCR产物中可以产生三种不同条带，由此快速区分三种不同基因型(ZZ、ZW和WW)的罗氏沼虾，进而鉴别产生单性苗种的亲虾及虾苗的性别。此外，本发明的检测方法可用于罗氏沼虾的任何组织，检测灵敏度高。
附图说明
图1是罗氏沼虾性别特异片段比对示意图；
图2是罗氏沼虾基因组电泳图；
图3是本发明实施例提供的罗氏沼虾基因型鉴别的PCR产物的电泳结果图。
图4是本发明实施例提供的罗氏沼虾基因型鉴别的PCR产物的测序结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种能够快速鉴别罗氏沼虾性别的方法，相对于现有的方法具有速度快，一次区分三种基因型，准确度高的优点，该方法包括以下步骤：
S1：从罗氏沼虾组织中提取罗氏沼虾基因组DNA；
S2：针对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2设计引物并进行PCR扩增；
S3：将S2扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测罗氏沼虾的遗传性别。
SEQ ID NO:1序列为：
GGGCAATGATGACTGACTGTAGACGACTGACAGAGGAGAGTTTACGATAATCAGACAAAGAGAAGTGTTAAAAGAATATTATATGGTGAAACAGCACAATAAACGTTACAAGTGCTATGTCAGAGACGGCACAAACATGGAGAGCCAGTGATTTCCGATAACAAAGAAGACCAAAATATCAGATAACTAAGAACACTACCCAAAAAGTATTTCAGTGGCATCTTTCGTAAGCTTCAAATCTGGCTTCCAATGACTTTTCTCTTCTAAATCTTTTGCAAAGAACAATCTCTCCTCCTTGCTGGGCCTATTCATACCATCAGGCGCTAA；
SEQ ID NO:2序列为：
GGGCAATGATGACTGACTGCTGACGACTGACAAAGGAGAGTTTATGATAAATATCAGATAACTGAGAACACTACCTAAAAAGTATTTTAGTGGCATCTTTCGTGAACTTCAAAATTGGCTTCCAATGACTTTTCTCTTCTAAATCTTTTGCAAAGGACCATCTCTCCTCCTTGCTGCGCTTATTCATACCATCAGGCGCTAA。
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为体现罗氏沼虾不同性别的基因序列，两者的比对参见图1。本发明实施例选用的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2与以往的用于性别筛选的基因序列不同，之前的研究者采用的序列也可以用于性别鉴定，但基于这些现有的序列无法设计出同时检测三种性别基因型(ZW，ZZ和WW)的引物序列及检测方法。
本发明的发明人针对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2设计引物序列，该引物对准确度高，操作简便，使用常规PCR即可完成。
优选地，本发明使用的引物对为：F：GATGACTGACTGYNGACGACTGAC(SEQ ID NO:3)；R:TAGAAGAGAAAAGTCATTGGAAGC(SEQ ID NO:4)，上述引物对中包括兼并碱基Y和N，其中Y代表该位点碱基为C或T，兼并碱基N代表该位点碱基为A或T。兼并引物的设计提高了引物覆盖范围，可以同时覆盖三种基因型的罗氏沼虾，能一次性对三种不同罗氏沼虾基因型进行区分。
所述步骤S1中罗氏沼虾组织可以是任意组织，优选为罗氏沼虾的触角。触角部分便于取材和处理。进一步地，本发明实施例还可采用与上述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同源性80％以上(大于或等于)的序列作为引物序列。
具体地，所述步骤S2中基因组DNA模版量为50±5ng,PCR引物浓度为10±1μm,引物退火温度为50±2℃，扩增循环数为39±3。
具体地，所述步骤S3中采用的凝胶为琼脂糖凝胶，其浓度为1.5±0.2％，凝胶电泳时间为20±3分钟。
本发明实施例还提供一种PCR检测试剂盒，用于区分罗氏沼虾三种不同性别基因型：ZZ、ZW和WW，其中该试剂盒包括一对引物F：GATGACTGACTGYNGACGACTGAC(SEQ ID NO:3)；R:TAGAAGAGAAAAGTCATTGGAAGC(SEQ ID NO:4)，这对引物对包括兼并碱基Y和N，兼并碱基也称为简并碱基，其根据密码子的兼并性,用一个符号代替某两个或者更多碱基。本发明申请中兼并碱基Y代表该位点碱基为C或T，兼并碱基N代表该位点碱基为A或T。
该PCR检测试剂盒为常规PCR检测试剂盒，其中还包括Taq酶缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq酶等常规PCR必须的成分，这些成分的浓度也为常规浓度。
进一步地，PCR检测试剂盒还可采用与上述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同源性80％以上(大于或等于)的序列作为引物序列。
优选地，上述引物也可以用于其他类型的PCR检测。
与现有的罗氏沼虾性别鉴定技术相比，本发明的检测方法具有如下优点：
(1)进行多基因型分析
本发明仅采用一对引物，即可对三种不同罗氏沼虾基因型进行区分。
(2)方法简单易操作
本发明采用的方法是常规实验室方法，简单易行易推广。
(3)性别判定结果明了可靠
与微卫星标记扩增相比，本方法扩增得到的条带高度特异，判定结果可靠。
为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1
通过较低的退火温度进行罗氏沼虾基因组的扩增长度多态性扩增(Jiang etal.,2013)，得到了罗氏沼虾雌雄性别的基因组特异片段。
1.罗氏沼虾基因组DNA的提取
剪取罗氏沼虾触须，用酚-氯仿方法提取基因组DNA：
取罗氏沼虾雌虾(ZW)4只。将镊子消毒，剪取约2-3根触须，经组织裂解液和蛋白酶K(共600μL)消化至组织完全溶解。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，混匀后离心。将上清液转移到新的离心管中并加入等体积预冷的无水乙醇，混匀后离心，弃上清。采用70％乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后空气干燥沉淀；加入20-50μL TE缓冲液，检测DNA浓度。
2.PCR扩增
采用20μL PCR扩增体系进行PCR扩增，在PCR管中加入以下成分：
Figure BDA0002368103180000071
其中Scar202F序列为GGGCAATGATGACTGACT(SEQ ID NO:5)，反向引物Scar202R序列为TTAGCGCCTGATGGTATG(SEQ ID NO:6)(Jiang et al.,2013)。PCR反应程序设定：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度48℃30s，72℃30s，共39个循环，最后72℃延伸7min。
将扩增得到的PCR产物进行电泳，得到2条不同大小DNA条带。经测序后得到图1中的两条序列。
实施例2
本实施例提供一种快速鉴别罗氏沼虾性别的方法，包括以下步骤：
1.罗氏沼虾基因组DNA的提取
剪取罗氏沼虾触须，用酚-氯仿方法提取基因组DNA：
分别取罗氏沼虾雄虾(ZZ)、雌虾(ZW)及超雌虾(WW)各4只。将镊子消毒，剪取约2-3根触须，经组织裂解液和蛋白酶K(共600μL)消化至组织完全溶解。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)溶液，混匀后离心。将上清液转移到新的离心管中并加入等体积预冷的无水乙醇，混匀后离心，弃上清。采用70％乙醇洗涤沉淀，弃乙醇后空气干燥沉淀；加入20-50μL TE缓冲液，检测DNA浓度。罗氏沼虾基因组电泳图如图2所示。
2.PCR扩增
采用20μL PCR扩增体系进行PCR扩增，在PCR管中加入以下成分：
Figure BDA0002368103180000081
其中GF序列为GATGACTGACTGYNGACGACTGAC(SEQ ID NO:3)，反向引物GR序列为TAGAAGAGAAAAGTCATTGGAAGC(SEQ ID NO:4)，正向引物中包括兼并碱基Y和N，其中Y代表该位点碱基为C或T，N代表该位点碱基为A或T。
PCR反应程序设定：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度50℃30s，72℃30s，共39个循环，最后72℃延伸7min。
3.基因型分析
取10μl步骤2获得的PCR产物置于预先制好的1.5％琼脂糖凝胶泳道中，电泳20分钟(100V)分离DNA片段。电泳结果如图3所示，图3中有12条泳道，ZZ基因型扩增条带为259bp左右单一条带，见图3中泳道1-4中位于上面的条带；ZW扩增为259bp和134bp两条条带，见泳道5-8中的两条条带；而超雌罗氏沼虾WW基因型扩增为134bp的单一条带，见泳道9-12。图3的泳道1-6中有引物二聚体(＜100bp)(最下面的条带，泳道1和5中箭头所示)，其余泳道中没有引物二聚体。通过片段测序确定扩增的目的条带与预期一致(见图4,其中雄虾ZZ扩增得到片段的测序结果为SEQ ID NO:1的部分序列；超雌虾WW扩增得到片段的测序结构为SEQID NO:2的部分序列)。
结果：本实施例对三种不同基因型的罗氏沼虾进行鉴定，能够精准的鉴别出罗氏沼虾的遗传性别。
另外，发明人用包含上述引物对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的PCR检测试剂盒，利用常规PCR对虾群进行性别鉴定，准确率为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不能限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市泽龙生物技术有限公司
<120> 快速鉴别罗氏沼虾性别的方法
<130> 20I0036CN
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾(Macrobrachium Rosenbergii)
<400> 1
gggcaatgat gactgactgt agacgactga cagaggagag tttacgataa tcagacaaag 60
agaagtgtta aaagaatatt atatggtgaa acagcacaat aaacgttaca agtgctatgt 120
cagagacggc acaaacatgg agagccagtg atttccgata acaaagaaga ccaaaatatc 180
agataactaa gaacactacc caaaaagtat ttcagtggca tctttcgtaa gcttcaaatc 240
tggcttccaa tgacttttct cttctaaatc ttttgcaaag aacaatctct cctccttgct 300
gggcctattc ataccatcag gcgctaa 327
<210> 2
<211> 202
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾(Macrobrachium Rosenbergii)
<400> 2
gggcaatgat gactgactgc tgacgactga caaaggagag tttatgataa atatcagata 60
actgagaaca ctacctaaaa agtattttag tggcatcttt cgtgaacttc aaaattggct 120
tccaatgact tttctcttct aaatcttttg caaaggacca tctctcctcc ttgctgcgct 180
tattcatacc atcaggcgct aa 202
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgactgac tgyngacgac tgac 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagaagagaa aagtcattgg aagc 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcaatgat gactgact 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagcgcctg atggtatg 18

Claims (4)

1.一种快速鉴别罗氏沼虾三种基因型的方法，所述三种基因型为ZZ、ZW和WW，所述方法包括以下步骤：
S1：从罗氏沼虾组织中提取罗氏沼虾基因组DNA；
S2：利用SEQID NO: 3和SEQ ID NO: 4作为引物进行PCR扩增，其中兼并碱基Y代表该位点碱基为C或T，兼并碱基N代表该位点碱基为A或T；
S3：将S2扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测罗氏沼虾的遗传性别，其中ZZ基因型扩增条带为259 bp单一条带；ZW扩增为259 bp和134 bp两条条带；而超雌罗氏沼虾WW基因型扩增为134 bp的单一条带。
2.根据权利要求1中任一项所述的方法，其特征在于：采用罗氏沼虾触须或触角组织来提取基因组DNA。
3.根据权利要求1中任一项所述的方法，其特征在于：基因组DNA模版量为50 ng ± 5ng, PCR引物浓度为10 μm± 1 μm, 引物退火温度为50℃± 2℃，扩增循环数为39 ± 3。
4.根据权利要求1中任一项所述的方法，其特征在于：电泳中使用的凝胶的浓度为1.5%± 0.2 %，凝胶电泳时间为20分钟±3分钟。
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