CN113930525B - 用于乌鳢性别鉴定的特异性序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，公开了用于乌鳢性别鉴定的Indel标记及应用，本发明通过全基因组测序和一个生物信息分析流程，开发了乌鳢性别特异的标记，针对该特异性序列，可以利用HRM检测技术对乌鳢的XX、XY和YY性别进行鉴定，经验证准确率达100%。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，可为其它鱼类性别标记发掘、斑乌鳢性控育种和全雄鳢养殖产业的发展提供帮助。

Description

用于乌鳢性别鉴定的特异性序列及应用
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于乌鳢性别鉴定的特异性序列及应用。
背景技术
乌鳢(Channa argus)主要分布于长江及长江以北各水系，属鲈形目、鳢科、鳢属。乌鳢在淡水经济鱼类中体型中等偏大，是一种凶猛的肉食性鱼类。在鳢科鱼类的养殖实践中，人们发现以斑鳢作为母本与乌鳢杂交的F1代，即斑乌鳢，综合了亲本的优点，具明显杂交优势，生长速度、饲养性能、抗病力与父母本比较均有较大提高，研究人员发现斑乌鳢F1代雌雄个体生长速度差异很大，成鱼中雄性平均体重超过雌性的2倍，开展斑乌鳢全雄育种技术研究，对于提高杂交鳢的养殖产量和经济效益具有重要意义。在开展鱼类全雄育种技术研究中，筛选与性别相关的分子标记成为关键。培育全雄斑乌鳢的前提条件是需要开发其乌鳢性别特异的分子标记，尤其是早期可以区分乌鳢YY超雄个体的分子标记。
乌鳢目前已公开了雌性基因组序列，不含Y染色体，还不清楚X和Y染色体之间的保守序列，因而存在性别鉴定标记准确性不高的情况。例如已公开的申请“乌鳢雄性分子标记引物及应用”，申请号为CN201611247108.6，在实际的应用中，发现该标记会将少量的雄性个体判断为雌性个体，说明该分子标记区域仍然会在X和Y染色体之间产生交换，保守型不够高。
乌鳢的性别鉴定不仅仅是在于Y染色体的鉴定，本发明还需要解决YY染色体(超雄个体，区别于雄性XY个体)鉴定的问题，因此本发明的技术方案在筛选出X和Y染色体之间稳定的差异区域后，在差异区域两端的同源序列位置设计引物，实现了特异性地检测XX、XY和YY三种性染色体组合个体。
为了获得高质量的乌鳢DNA性别特异分子标记，本发明通过全基因组测序和一个生物信息分析流程，开发了乌鳢性别特异的标记。针对乌鳢中的该特异性标记序列，结合chelex100DNA提取、常规PCR扩增和HRM检测技术对乌鳢的性别进行鉴定，经验证准确率达100％。
发明内容
本发明的目的在于提供用于乌鳢性别鉴定分子标记，所述分子标记为SEQ IDNO.3所示。
本发明的另一个目的在于提供了乌鳢性别鉴定的DNA分子标记，所述分子标记为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的在于提供检测SEQ ID NO.3所示序列的引物在乌鳢性别鉴定中的应用。
本发明还有一个目的在于提供了检测SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物在乌鳢性别鉴定中的应用。
本发明的最后一个目的在于提供了用于乌鳢性别鉴定的检测引物在制备鉴定乌鳢性别试剂盒中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
乌鳢性别鉴定的Indel标记的获得：
利用图1所示的生物信息分析流程，获得了乌鳢性别染色体中的一个Indel标记，其为一段10个碱基的核苷酸序列：GTCTGCTGAG；在乌鳢的X染色体中含有这段序列，在Y染色体中则没有，因此可针对包含有这段Indel标记的序列进行检测，以此来鉴别乌鳢性别。在乌鳢的X染色体中含有这段序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，在Y染色体中对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
检测SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列在鉴定乌鳢性别中的应用，包括利用本领域的常规方式，对包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物，进行检测；或使用其余测序等方式进行检测。
检测SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物在乌鳢性别鉴定中的应用，包括利用本领域的常规方式，对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计引物，然后进行检测；或使用其余测序等方式进行检测。
以上所述的应用中，针对SEQ ID NO.3序列或是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计的检测引物为：
CAYSPE-F:GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATG
CAYSPE-R:CCATGCTCTGATCAGTAAATACAC。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)本发明筛选乌鳢性别标记的方法与之前报道的相比，在减少分析数据量的同时，提升了标记的准确性：在获得大量的潜在性别标记位点(超过5万个)后，进一步在不同水域的16尾雌性和16尾雄性的乌鳢测序reads中进行完全比对(-all)，充分评价标记位点的等位性和唯一性，找到了足够保守和稳定的差异性Indel位点，即可实现乌鳢性别的精准区分；初始仅对2个样本的测序数据(60G)进行电子酶切，按照正常使用进度普通超算1-2个星期可进行一轮性别标记的筛选。较之于CN111394445B中的信息分析流程需对18个样本的数据(540G)进行电子酶切，按照正常使用进度普通超算2-3个月才能进行一轮性别标记的筛选。本发明方法在性别标记发掘质量和效率上均有质的提升。后续针对乌鳢中的该特异性标记序列，结合chelex100 DNA提取、常规PCR扩增和HRM检测技术对乌鳢的性别进行鉴定，经验证准确率达100％。
2)本发明提供的性别鉴定的Indel标记，解决了乌鳢早期XX、XY和YY性别鉴定的难题，可以对乌鳢的XX、XY和YY性别进行鉴定，经验证准确率达100％。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点。本发明可为鱼类性别特异性标记发掘、杂交鳢性控育种和鳢养殖产业的发展提供帮助。
附图说明
图1为开发乌鳢性别鉴定的Indel标记的生物信息分析流程。
图2为开发的Indel标记进行乌鳢性别鉴定的结果。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
乌鳢性别鉴定的Indel标记的获得：
1)选择性别确定的不同水域雌性和雄性个体各16尾，进行全基因组测序，获得数据量约30G/尾。各选一尾雌、雄测序数据，进行AC、AG、AT、GA、GC和GT六种碱基起始的60bp电子酶切处理。去冗余后获得各种酶切片段的频数。根据频数分布，确定单拷贝位点频数范围内的酶切片段，并进行比较，获得共有片段(A)和雌雄特异片段(B)。
2)共有片段(A)采用Velvet软件进行组装，获得A-contig。以A-contig为reference，A和B为query，用Boutai2软件进行缺省值比对。在输出结果中，根据片段的比对起始坐标进行配对获得等位片段。以等位片段为参考序列，对16尾雌性和16尾雄性测序样本进行酶切片段基因型鉴定。在测序样本中，A+B的检出频数≥7的为有效位点；在有效检出位点中，如果同时出现AB，即判断为AB杂合基因型，若只出现A或B，即判断为纯合基因型。
3)在基因型检测结果中，筛选雌雄测序样本中都成功分型的位点。统计在雌鱼中都为AA，而在雄鱼中都为AB的位点数量。另一方面，统计在雌鱼中都是AB，而在雄鱼中都是AA的位点数量。结果前者数量远多于后者，因此判断乌鳢为XY性别决定类型。在雌鱼中都为AA，而在雄鱼中都为AB的位点即为潜在的性别标记位点。
4)在一对雌、雄测序样本中分离潜在的性别标记所在的reads。采用Velvet软件对来源于雌性的reads组装，获得X染色体的局部组装X-contig。以X-contig为reference，分别以雌性、雄性reads以及潜在的性别标记片段为query，进行Boutai2缺省值比对，筛选X和Y的Indel差异大于或等于10bp的位点。进一步在不同水域的16尾雌性和16尾雄性的测序reads中进行完全比对(-all)，找到保守的差异性Indel位点，即可实现性别的区分。
5)使用IGV软件可视化Manual check，在Indel位点两侧设计PCR检测引物。最终获得雄性Y染色体中的含有Indel标记序列的CAYSPE序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，雌性中的X染色体中的对应序列为SEQ ID NO.2所示，较之于雄性的标记序列插入了GTCTGCTGAG(SEQ ID NO.3所示)，因此，可针对乌鳢中包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物进行乌鳢性别鉴定。
6)生物信息分析流程如图1所示。
实施例2：
SEQ ID NO.3所示序列在乌鳢性别鉴定中的应用过程：
1)针对包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物：
CAYSPE-F:GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATG
CAYSPE-R:CCATGCTCTGATCAGTAAATACAC
2)基因组DNA提取：
将150μl 5％浓度的chelex100加入装有尾鳍的96孔板，58℃消化1小时，100℃煮沸8分钟，4000转离心5分钟，取1μl上清作为PCR反应模板。
3)PCR扩增：
在96孔板配置反应体系，反应体系为10×Buffer(Mg2+plus)1μl；LC Green 1μl；dNTP(10mM each)0.2uL；CAYSPE-F(10mM)0.2uL；CAYSPE-R(10mM)0.2uL；Taq(5U/uL)0.1uL；模板DNA 1μl，最后补充ddH2O至10μl。PCR反应条件均为94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸25s，40个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
超雄个体中的扩增得到的特异性序列为：
GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATGAGGATATTGTTAGAGAGTGTATTTACTGATCAGAGCATGG；
雌性个体中扩增得到的特异性序列为：
GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATGAGGATATTGTTAGTCTGCTGAGGAGAGTGTATTTACTGATCAGAGCATGG；
雄性个体中扩增得到的特异性序列为：
GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATGAGGATATTGTTAGAGAGTGTATTTACTGATCAGAGCATGG；
和GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATGAGGATATTGTTAGTCTGCTGAGGAGAGTGTATTTACTGATCAGAGCATGG。
针对上述的PCR扩增产物，可利用本领域的常规方案，对扩增产物进行检测。
在本发明中，是利用HRM对扩增结果进行检测，PCR反应结束后，将96孔板直接放入LightScanner 96仪器板槽中进行HRM扫描，设置起始扫描温度68℃，终止扫描温度94℃，点击“Start Run”开始扫描；扫描结束后，得到分离曲线。
该曲线可完全分离出乌鳢的雌性个体、雄性个体和超雄个体。
实施例3：
SEQ ID NO.2所示序列在乌鳢性别鉴定中的应用过程：
1)收集已知性别的乌鳢个体雌雄各36尾，超雄12尾，采集鳍条组织样本保存于96孔板中冷冻保存，利用chelex100煮沸法提取其基因组DNA。
2)利用实施例2的方法对上述乌鳢DNA样本进行PCR扩增。
3)PCR扩增产物进行HRM分型。
4)HRM分型结果显示，利用本发明提供的Indel标记进行鉴定的结果，与已知结果完全一致，鉴定的准确率达到了100％。
5)检测结果如图2所示。
实施例4：
已公开申请“乌鳢雄性分子标记引物及应用(CN201611247108.6)”所示序列在乌鳢性别鉴定中的应用过程：
1)该申请引物序列为Contig-359642上游引物：TATGTAGCCACCACTGTCTGC，Contig-359642下游引物：GGGTGGAGTCTGTCCTGCT；Contig-418354上游引物：TTTCAAAACAAATACTCCCTC，Contig-418354下游引物：TGAACCAGGCACAAACTTA。
2)收集实施例3中的乌鳢个体雌雄各36尾，超雄12尾基因组DNA。
3)对上述乌鳢DNA样本进行PCR扩增，反应体系为2×Taq MasterMix 10μl 20μl；上、下游引物(10mM)各0.8μl；模板DNA 1μl，最后补充ddH2O至20μl。PCR反应条件均为94℃预变性2min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸2min；4℃保存。
4)PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，结果发现2尾雄性个体并未扩增出预期大小237bp和158bp的条带，在实际应用中可能被误判为雌性个体。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 用于乌鳢性别鉴定的特异性序列及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgtcaattg tgagtccttg atgaggatat tgttagagag tgtatttact gatcagagca 60
tgg 63
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgtcaattg tgagtccttg atgaggatat tgttagtctg ctgaggagag tgtatttact 60
gatcagagca tgg 73
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctgctgag 10
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtcaattg tgagtccttg atg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccatgctctg atcagtaaat acac 24

Claims (6)

1.一种用于乌鳢性别鉴定的DNA分子标记，所述分子标记为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
2.检测SEQ ID NO.3所示序列的引物在乌鳢性别鉴定中的应用。
3.检测SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物在乌鳢性别鉴定中的应用。
4.权利要求2或3所述的检测引物在制备乌鳢性别鉴定试剂盒中的应用。
5.权利要求2或3所述的检测引物在超雄乌鳢性别鉴定中的应用。
6.根据权利要求2或3所述的应用，所述的引物为：CAYSPE-F:GTGTCAATTGTGAGTCCTTGATG和CAYSPE-R: CCATGCTCTGATCAGTAAATACAC。
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