CN102260734A - 一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测山羊同源异型框6(six6)基因单核苷酸多态性(SNP)的方法，以包含Six6基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Six6基因；用限制性内切酶PstI消化PCR产物后，再进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的基因型(以序列Accession No.NM_001104993.1为参考)；在动物生产实践中，由于Six6基因单核苷酸变异或SNP对形成胚胎、调控生长激素和促进垂体分泌激素等具有重要的作用，故将该位点不同基因型与生长发育性状数据进行关联分析。结果发现：CT基因型个体的管围显著大于CC基因型个体(P＝0.047)，说明CT基因型可以作为一个提高山羊管围的分子遗传标记。故本发明提供的快速检测Six6基因SNP的检测方法，在中国山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)育种中，有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

Description

一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于动物分子育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测山羊同源异型框Six6基因第232位(以序列AccessionNo.NM_001104993.1为参考)单核苷酸变异或SNP的方法，及其在动物生长性状的标记辅助选择(MAS)育种中用于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

背景技术

山羊是人类的重要家畜物种资源之一，它在各国社会经济和人们生活中扮演着重要角色。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，期望山羊育种专家尽快培育出更早、更好、更快地获得山羊产品的优良品种。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，山羊育种专家一直关注生长发育性状，但现在的问题是仅靠传统育种手段不断改良并提高这些性状，显然是不行的，还需要标记辅助选择(MAS)介导的现代分子育种技术的介入。数量遗传学理论指出，生长性状是山羊有重要经济价值的数量性状之一，由微效多基因控制，其遗传力较低，所以仅用常规育种手段对其改良、提高时遗传进展无疑是非常缓慢的，且效果不会理想。DNA标记的出现为加速生长性状的遗传进展提供了可靠的手段和有力的保障，使标记辅助选择(MAS)育种成为一种具有广阔前景的分子育种技术，因为DNA标记具有“多态性丰富、遗传稳定、不受组织、生理发育阶段及环境影响”等诸多优点。为此，借助现代先进的MAS育种手段对我国山羊品种进行卓有成效的遗传改良，找到山羊生长发育性状的分子标记，是提高我国山羊生产水平，尤其是发育速度的根本途径。然而目前，在利用MAS育种技术改良山羊生长发育性状的实践中，首先需要在DNA水平上筛查和检测与山羊生长发育性状密切相关的DNA标记，其次是建立基因多态性的快速检测方法，然后是基因多态与生长发育性状数据进行数量遗传学分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。

在山羊生长发育性状的MAS育种中，研究DNA标记与目标性状之间的关系，有两种基本方法：候选基因分析和连锁标记分析。在动物研究中，候选基因分析比连锁标记分析更易操作，且不需要进行特意实验设计、费用低、统计功效强，被广泛采用，适用于任何可取得基因型和表型数据的群体。该方法通过统计方法建立相应的数学模型，从而确定该候选基因与未知基因的关系或效应。一般而言，候选基因通常是一些与研究性状生长发育过程有关的基因，可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。在本发明中，Six同源框(Six-homeobox)基因家族符合山羊生长发育性状的重要候选基因的要求。

Six同源框基因家族是一类处于哺乳和脊椎动物垂体内的核心转录调控因子，被命名为Six基因(Yajima et al，2010)。目前在小鼠、人、鸡、青蛙、线虫和果蝇等物种中均已鉴定出该类基因。至今，在脊椎动物中已发现了至少6个成员因子：Six1、Six2、Six3、Six4、Six5和Six6，分为3大亚家族，即Six1/2、Six3/6和Six4/5。该家族基因所编码氨基酸的结构域基本相似，分为N-端结构域(NT)、Six蛋白互作域(SD)、Homeobox同源结构域(HD)和C-端结构域(CT)。2009年，Kumar等揭示了该家族基因所编码的转录因子在胚胎发育、细胞分化、垂体前叶正常发育、垂体机能衰退、癌症和肿瘤等方面发挥着重要的作用。

作为Six家族中一个新同系物成员，Six6基因(又名OPTX2和Six9)与Six3基因紧密相关，其编码氨基酸含有两个高度保守的HDs结构域和SDs结构域。人Six6基因定位于染色体14q22.3-q23，DNA序列全长2567bp，含有2个外显子和一个内含子，共编码246个氨基酸。牛Six6基因定位于10号染色体上，DNA序列全长共2574bp，包括3个外显子和2个内含子，共编码222个氨基酸。Six6基因的主要功能是调控垂体早期特克氏囊中细胞分化及垂体前叶细胞的形成，为是一个缺陷相关的重要候选基因。Six6基因的表达比较不广泛，主要表达在发育的下丘脑、垂体等区域。已有研究表明，缺乏Six6转录因子的动物常会出现垂体发育不全和视网膜与视神经缺陷等症状；在正常发育过程中，Six6主要作用机理是通过与辅阻遏蛋白Tle1和Dach1互作来抑制P27Kip1启动子，而该启动子自身就是胚胎发育中垂体前体细胞分化和视网膜的抑制剂；Gallardo等(2001)揭示Six6基因的缺失或单倍剂量不足，都将会导致垂体异常和双边无眼畸形。在成年鼠大脑中，Six6基因与Six3基因在胚胎发育早期的神经板区域重叠表达，随着胚胎的发育开始分离成不同的区域，其中，Six6则主要分布在丘脑和小丘脑区域，提示Six6在脑发育过程中具有重要作用(Conte et al.，2005)。

单核苷酸多态性(SNP)是指DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异，在人群中这种变异的发生频率至少大于1％，它是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs极其罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。根据SNPs在基因组中分布的位置，可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总体而言，cSNP比较少，又分为同义cSNPs和错义cSNPs，而pSNP和iSNP较多。就SNP得生物功能而言，错义cSNPs涉及碱基序列的改变，将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能；同义cSNP虽然未能改变目的蛋白质的氨基酸序列，但有研究显示同义突变会影响目的蛋白质的翻译效率，进而对基因功能产生重要影响；pSNPs和iSNPs产生功能的机制主要是影响转录因子与启动子的的结合能力从而调控基因的转录，或者内含子区域SNP产生功能的分子机制是与附近其它基因SNP连锁或者可能影响mRNA的剪接从而影响蛋白质的功能。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。因此，SNP在遗传病和育种的研究中却具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸连接反应、PCR-RFLP和引入突变位点的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等(Liu et al，2010)。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，故DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。PCR-RFLP和Forced-PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点，它们不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。但是由于通常的PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位点的限制，故在实际应用中受到了一定的限制，不过，Forced PCR-RFLP由于可以通过设计引物过程中进行定点突变从而使新的人工引入突变与待检测突变构成一个新的酶切位点。因此，Forced-PCR-RFLP的使用性和广泛性受到科研工作者的热切关注。

目前，关于Six6基因SNP研究，多见于人、小鼠、海洋鱼等生物的体外表达分析，且常被作为器官机能缺陷和重要的疾病预测相关的候选基因，而鲜见于家畜和家禽SNP分析，目前在山羊中还未见相关报道。中国山羊Six6基因SNP领域的研究匮乏，基因位点的功能研究及其遗传变异与生长发育(如：体重、体斜长、胸围等性状)的关联研究仍是空白。在动物生产实践中，由于Six6基因SNP位点对形成胚胎、调控生长激素和促进垂体分泌激素等具有重要的作用，为此，本发明提供了一种引入突变位点的Forced PCR-RFLP方法快速Six6基因SNP，同时分析SNP与生长性状关系，并发现该位点可以作为提高山羊管围的分子遗传标记，在中国山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)育种中，将有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。

主要参考文献：

Conte I，Morcillo J，Bovolenta P.Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing andadult mouse brain.Developmental Dynamics，2005，234：718-725

Kumar JP.The sine oculis homeobox(Six)family of transcription factors as regulators of development anddisease.Cellular and Molecular Lift Sciences，2009，66：565-583.

Liu Y，Li M，Cheung，YM.Sham PC，Michael KN.SKM-SNP：SNP markers detection method.Journal ofBiomedical Informatics，2010，43(2)：233-239.

Yajima H，Motohashi N，Ono Y，Sato S，Ikeda K，Masuda S，Yada E，Kanesaki Hi，Miyagoe-Suzu ki Y，Takeda Si，Kawakami K.Six family genes control the proliferation and differentiation of musclesatellite cells.Experimental Cell Research，2010，316(17)：2932-2944.

发明内容

本发明解决的问题在于利用Forced PCR-RFLP方法检测山羊Six6基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为山羊分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，以包含Six6基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Six6基因；用限制性内切酶PstI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊基因NM_001104993.1：g.232位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TCCTCCAATCCCTCCCG-3’         17nt；

下游引物：5’-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTGC-3’26nt。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30～35个循环94℃变性30s，51.3℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为3.5％的琼脂糖凝胶电泳。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为184bp条带；CT基因型表现为184bp、156bp和28bp条带；TT基因型表现为156bp和28bp条带。其中，28bp条带在3.5％琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但不影响鉴定基因型。

本发明根据Six6基因的序列设计引物，分别以5个山羊品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到山羊Six6基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现在第232位存在SNP多态性。

针对上述第232位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个山羊品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与山羊一些生长性状(成年体重、体高、体斜长、胸围、胸深、胸宽、腰角宽、管围、体躯指数、体长指数、胸围指数、管围指数、胸宽指数和髋骨指数)进行关联分析，结果表明该位点可以作为山羊管围性状的分子标记。

附图说明

图1为山羊Six6基因第232位CC基因型个体的测序图；带框的字母

表示该位点发生突变：NM_001104993.1：g.232C；蓝线表示C碱基的测序峰，红线代表T碱基的测序峰；黑线代表G碱基的测序峰；绿线代表A碱基的测序峰)

图2为山羊Six6基因第232位CT基因型个体的测序图；带框的字母

表示该位点发生突变：NM_001104993.1：g.232C＞T；

图3为山羊Six6基因的PCR产物电泳(1-7分别表示PCR扩增产物；Marker I大校分别是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)；

图4为山羊Six6基因第232位不同基因型PCR产物的PstI酶切电泳结果(泳道1为CC基因型；泳道2，3，4均为CT基因型；Marker为MarkerI，分别是600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)；

图5为山羊Six6基因Forced PCR-RFLP中的序列分析图，采用PstIForced PCR-RFLP方法检测山羊Six6基因5’UTR和部分Exon1(NM_001104993.1：g.232C＞T)，图中，

分别对应表示上游和下游引物序列；CTGCAG表示PstI内切酶识别位点；或

表示突变位点，为NM_001104993.1：g.232C＞T；阴影A表示引入的突变碱基。Sequence1为NM_001104993.1序列(Six6基因序列)；Sequence 2为山羊Six6基因5’UTR区域的NM_001104993.1：g.232C等位基因的序列；Sequence3为山羊Six6基因5’UTR区域的NM_001104993.1：g.232T等位基因的序列。

具体实施方式

本发明利用Forced PCR-RFLP方法对山羊Six6基因5’UTR和部分Exon1区域的第232位突变的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

I、山羊Six6基因部分DNA序列的克隆与DNA测序

1、山羊样品的采集及处理

本发明采用了5种山羊品种共计619个个体，包括3个肉用山羊品种和2个绒山羊品种，具体为：(1)无血缘关系的海南黑山羊(HNBG)耳组织样品269份采自海南省；(2)无血缘关系的徐淮山羊(XH)耳组织样品35份，采自江苏省；(3)无血缘关系的徐淮山羊(BJ)肌肉样品21份，采自贵州省；(4)无血缘关系的陕北白绒山羊(SBWC)耳组织样品201份，采自陕西省白绒山羊场；(5)无血缘关系的新疆白绒山羊(XJWC)耳组织样品93份，采自新疆自治区。取山羊耳组织样，在70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室，-80℃保存备用。

2、基因组DNA的提取

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，DNA浓度(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从海南黑山羊群体中随机选择100个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；按照同样的方法，也构建徐淮山羊、板角山羊、陕北白绒山羊和新疆白绒山羊群体的DNA池。

4、扩增引物设计

(1)山羊Six6基因5’UTR和第1外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NM_001104993.1)序列为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含山羊Six6基因5’UTR和第1外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

SIX6-E1F：5′-TCC TCC AAT CCC TCC CG-3′(Accession No.NM_001104993.1，nt 75-91)，17nt；

SIX6-E2R：5′-CGT TCA AGG CTC GGA GGT CTA T-3′(Accession No.NM_001104993.1，nt 835-858)，22nt。

以上述引物对山羊池DNA的混合基因组扩增，能够扩增包含山羊Six6基因(NM_001104993.1序列)Six6基因5’UTR和第1外显子区域第75bp～858bp的784bp的基因片段，扩增后PCR产物进行纯化、测序，获得测序结果。对山羊Six6基因目的片段784bp测序峰图进行分析，其中在测序片段的第158位点(NM_001104993.1：g.232)有两个不同峰单核苷酸测序峰，说明第158位存在单核苷酸突变NM_001104993.1：g.232C＞T，但不能形成任何酶切位点。故采用Forced PCR-RFLP技术引入突变碱基从而构成酶切位点。

(2)山羊Six6基因Forced PCR-RFLP分析中引入突变酶切位点的引物P的设计

上游引物：5’-TCCTCCAATCCCTCCCG-3’        20bp；

下游引物：5’-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACT

C-3’    26bp。

其中下游引物3’端起第2位引入错配碱基T＞A，从而人为构建了一个PstI的酶切位点CTGCAG，可以使用Forced PCR-RFLP方法进行基因型的判定。

以上述引物对山羊基因组扩增，能够扩增包含山羊Six6基因(NM_001104993.1序列)Six6基因5’UTR和第1外显子区域第73bp～256bp的184bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示；

当第232位为T时，PCR扩增Six6基因产物的第231bp～236bp序列为CTGCAG，形成了限制性内切酶PstI的酶切位点CT/GCAG，当在232位点由T突变为C时，PCR扩增Six6基因产物的第231bp～236bp序列序列为CCGCAG，限制性内切酶PstI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。当用限制性内切酶PstI对引物P扩增的基因片段进行酶切消化时，可以将PCR产物切成3个片段、2个片段或不能切开。

5、PCR克隆山羊的Six6基因

分别以5个山羊品种的DNA池为模板，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs>(北京天根科技有限公司Mix)，0.45μL山羊基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL；

PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，51.6℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以5个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。对山羊Six6基因目的片段184bp测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图3中CT型的第158位发生了单核苷酸的突变，出现了C、T两种检测结果，即本发明筛查到了山羊Six6基因的SNP多态性，在山羊Six6基因第158位(对应于NM_001104993.1第232位)为C或T的核苷酸多态性.

当第158位由C突变为T时，PCR扩增Six6基因产物的第157bp～162bp序列为CGCAG，形成了限制性内切酶PstI的酶切位点CT/GCAG，当在158位点由C突变为C时，PCR扩增Six6基因产物的第157bp～162bp序列序列为CGCAG，限制性内切酶PstI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

当用限制性内切酶PstI对引物P扩增的基因片段进行酶切消化时，可以将PCR产物切成2段或不能切开。

II、山羊Six6基因C＞T突变多态性的Forced-PCR-RFLP检测

1、多态位点分析

当PCR扩增产物的第158位点发生C＞T突变时，即C突变为T，原来C

GCAG序列相应地变成CGCAG，从而形成了PstI限制性内切酶识别序列。

2、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以清晰的看到184bp的条带。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别进行PstI酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

20μL的PstI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer(含BSA)2.0μL，PstI(10U/μL)1.0uL，7.0μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，37℃恒温培养箱中消化5～10h，3.5％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳2h，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。由于扩增的184bp片段中第157-162位含有一个PstI的酶切位点，故多态位点含有“T”的个体的PCR产物会被PstI切成两段(184bp，156bp，28bp)，但由于28bp太短而在电泳图中看不见，故在实际的电泳分析中，只能观察到两条带；含有“C”的个体的PCR产物会被PstI切成一段(184bp)。

由于山羊为二倍体动物，当发生C＞T突变时，可形成不同的基因型，分别为CC、CT和TT；可以通过其酶切后的电泳图来进行判别，如图3所示，其中各个泳道从左到右依次为CC基因型、CT基因型、DNA Maker I、CT基因型、CT基因型(其条带分布由上到下依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。根据条带的个数和条带的大小，如图3和图4，就能够判定第158位的碱基类型，从而检测其SNP。

III、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对5个山羊品种的DNA样品(海南黑山羊281份、徐淮山羊35份、板角山羊21份、陕北白绒山羊201份和新疆白绒山羊93份)分别进行Forced PstI-RFLP(图3)的基因型的鉴定。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有A_ai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表1。

表1 5个山羊品种中Six6基因PstI位点的基因型和等位基因频率

从表1可以看出，肉用品种(海南黑山羊、徐淮山羊和板角山羊)和绒用品种(陕北白绒山羊和新疆白绒山羊)的C和T等位基因频率均大于1.00％，符合SNP的定义标准。因此，本发明首次成功利用PstI ForcedPCR-RFLP方法快速检测了山羊Six6基因的SNP位点。

IV、山羊Six6基因SNP位点基因效应的关联分析

1、基因型数据

PstI识别的基因型(CC和CT)；

2、生产数据

海南黑山羊的成年体重、体高、体斜长、胸围、胸深、胸宽、腰角宽、管围、体躯指数、体长指数、胸围指数、管围指数、胸宽指数和髋骨指数数据；其中，体躯指数＝胸围/体长×100；体长指数＝体斜长/体高×100；胸围指数＝胸围/体高×100；管围指数＝管围/体高×100；胸宽指数＝胸宽/胸深×100；髋骨指数＝胸宽/腰角宽×100。

3、关联分析模型

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS(9.1)软件的GLM过程分析基因型和品种对各性状效应。

在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+F_i+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，F_i为第i个农场的固定效，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。

表2Six6基因PstI多态与海南黑山羊成年体重等生长性状之间的t检验分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

结果表明(见表2)：山羊Six6基因5’UTR区域的PstI位点，CT基因型个体的管围显著大于CC基因型个体(P＝0.047)，且成年海南黑山羊CT基因型个体的管围性状比CC基因型个体的管围性状高了4.011％。而在其他性状上这两种基因型的个体之间差异不显著(P＞0.05)。以上说明CT基因型可以作为一个提高山羊管围性状的候选DNA标记。

Claims (6)

1.一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Six6基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Six6基因；用限制性内切酶PstI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的单核苷酸多态性，

所述的引物对P为：

上游引物：5’TCCTCCAATCCCTCCCG-3’          17nt；

下游引物：5’-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTGC-3’26nt。

2.如权利要求1所述的快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；35个循环94℃变性30s，51.6℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为3.5％琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为184bp条带；CT基因型表现为184bp、156bp和28bp条带；TT基因型表现为156bp和28bp条带，其中，28bp条带在3.5％琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但不影响鉴定基因型。

5.权利要求1至4中任意一项权利要求所述的快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性方法在鉴定不同山羊群体多态性中的诊断应用。

6.权利要求5所述的诊断应用，其特征在于，鉴定不同山羊群体多态性是，山羊Six6基因第232位SNP作为一个在山羊生长性状的标记辅助选择育种中提高山羊管围的分子遗传标记，CT基因作为一个提高山羊管围的分子遗传标记。

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