CN102808018B - 一种奶山羊pitx2基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，该方法以奶山羊基因组DNA或包含奶山羊PITX2基因的DNA序列为模板，利用PCR引物对P为引物，扩增奶山羊PITX2基因；通过限制性内切酶RsaI对其进行酶切，再根据琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定奶山羊PITX2基因第543位的SNP。该SNP位点的TT基因型和TC基因型可作为显著提高奶山羊乳脂含量，而同时又显著降低乳糖含量、乳浓度的有效DNA标记。

Description

一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于奶山羊核苷酸多态性技术领域，涉及一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用。

背景技术

奶山羊在我国奶业建设中发挥着重要作用，然而，与奶牛的基础研究与实践应用相比，奶山羊该方面极其滞后，整体水平非常低，奶山羊中蕴含的、与泌乳性状相关的潜在重要基因资源仍未得到有效挖掘和利用。近年来，我国优良奶山羊品种，如关中奶山羊，生产性能下降较快，退化严重，直接影响了我国奶羊业的发展。自“三聚氰胺”事件发生以后，我国羊奶制品在国内外开始走俏，社会对羊奶制品需求越来越大，从而形成了羊奶制品的极大需求与奶山羊种源不断下降之间的矛盾。

泌乳性能属于数量性状位点（QTL），由微效多基因控制，遗传力较低。为此，在奶山羊育种方面，不能仅靠传统育种手段对这些泌乳性状进行改良，还需要应用涉及DNA标记的现代育种技术，因为DNA标记具有多态性丰富、遗传稳定、不受组织、生理发育阶段及环境影响等诸多优点。此外，随着基因组计划的实施，DNA标记的种类与数目的增多，基因图谱密度与精度在不断提高。因此，DNA标记辅助选择(MAS)方法，作为一种具有广阔应用前景的分子育种技术，将有利于奶山羊品种的遗传改良。

目前，利用DNA标记进行动物MAS育种的主要步骤如下：首先，在DNA水平上快速确定与泌乳性状密切相关的重要基因及其多态性；其次，建立基因多态与泌乳性状的关联分析，确定与泌乳性状显著关联的DNA标记或SNP位点；最后，实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。为此，在奶山羊MAS育种中，必须选择正确、可靠的重要候选基因，并确定快速检测基因多态性的有效方法并进行关联分析，从而达到利用DNA标记进行标记辅助选择的目的。为此，在奶山羊MAS育种中，必须选择正确、可靠的重要候选基因，并确定快速检测基因多态性的有效方法并进行关联分析，从而达到利用DNA标记进行标记辅助选择的目的。通常，重要候选基因是与泌乳性状有关的重要基因，可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。

下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴是哺乳动物一个至关重要的生物调节系统。作为HPA轴的关键组成部分，脑垂体前叶腺体是哺乳动物生长发育、泌乳、生殖的控制中心。在哺乳动物HPA轴的垂体腺细胞的发育过程中，包括PITX2等关键转录因子直接影响垂体前叶腺体的发育，因为它们至少调控生长激素（GH）、催乳素（PRL）、促甲状腺激素（TSH）、促黄体素（LH）/促卵泡素（FSH）和ACTH等五种不同类型细胞分泌至少六种重要功能激素。已有研究表明：GH和PRL具有极其重要的生物学功能，它们的缺乏将导致动物形体矮小、性晚熟，泌乳期延迟，泌乳能力下降等表型，而且，GH和PRL基因突变与动物泌乳性状显著关联，故这两个基因被国际公认为影响动物泌乳性状的重要基因。为此，将HPA轴相关转录因子基因作为影响泌乳性状表达的重要候选基因，分析其遗传变异与奶山羊泌乳性状的关联并应用于生产实践，在理论和实践上是完全可行的。

作为HPA轴相关基因中的重要成员，同源异型结构域蛋白转录因子(PITX)类转录因子成员在基因活化、垂体发育中的的关键性作用，故将此类基因与泌乳性能进行关联性研究。作为PITX家族的重要成员，同源异型结构域蛋白转录因子2（PITX2）基因被分别定位在人类第4号染色体、小鼠第3号染色体、褐鼠第2号染色体、犬第32号染色体、野猪第8号染色体、牛第6号染色体，但山羊的相应信息尚无报道。序列比对结果表明，PITX2在人类、黑猩猩、狗、鼠、鸡、斑马鱼、牛和野猪中的序列高度保守，在许多发育通路中发挥重要作用，包括影响脑垂体的器官发生，影响GH、PRL、TSH的表达从而影响动物的泌乳性能。

作为遗传多态性中最重要、最普遍的类型，单核苷酸多态性（SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的变化而引起的多态性，其变异形式主要有转换、颠换、插入和缺失等。实验研究表明：PITX2是下丘脑核和中脑正常发育所必需的因子，敲除该蛋白的小鼠不能形成正常的胚胎，并在胚胎期死亡。PITX2蛋白在小鼠的多种组织中有表达，影响肌肉和垂体等正常发育，是左右不对称发育的信号分子，对细胞增殖发挥重要调控作用。目前，关于PITX2基因多态性研究多见于人、小鼠等生物的体外表达分析，且常被作为器官机能缺陷和重要的疾病预测相关的候选基因，而鲜见于家畜和家禽多态性分析。截至目前，中国奶山羊PITX2基因多态性领域的研究匮乏，基因位点的功能研究及其遗传变异与泌乳性能（如：产奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固体物含量等）的关联研究仍是空白。

发明内容

本发明解决的问题是提供一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，利用PCR-RFLP方法快速检测奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性（SNP），并将其与奶山羊泌乳性状进行关联分析，验证其作为奶山羊分子育种中辅助选择的DNA标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，以奶山羊基因组DNA或包含PITX2基因的DNA序列为模板，以PCR引物对P为引物，扩增奶山羊PITX2基因，然后利用限制性内切酶RsaI对PCR产物进行酶切，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定奶山羊PITX2基因第543位的单核苷酸多态性：TT基因型表现为432bp一条条带；TC基因型表现为432bp，320bp和112bp三条条带；CC基因型表现为320bp和112bp两条条带；

所述的引物对P为：

上游引物：tcgtccatga actgcatgaa aggc；

下游引物：aaaggaaggg aggtcagggt cgtaat。

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；35个循环（94℃变性30s，55.9℃退火30s，72℃延伸30s）；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为1.0%琼脂糖凝胶电泳。

所述的奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，将奶山羊PITX2基因第543位SNP位点的TT和TC基因型作为有效DNA标记。

所述的DNA标记为：

TT和TC基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊乳脂含量同时降低乳糖含量、乳浓度的DNA标记。

奶山羊PITX2基因第543位的单核苷酸多态性中的TT和TC基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊乳脂含量同时降低乳糖含量、乳浓度的DNA标记的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了与奶山羊泌乳性相关的功能基因PITX2第543位的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记：以关中奶山羊基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到奶山羊PITX2基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现在第543位（内含子1的第110位）存在SNP。

针对上述第543位的SNP，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸多态性。

本发明对关中奶山羊该SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与奶山羊的泌乳性能（包括产奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固体物含量）进行关联分析，结果表明：TT和TC基因型作为在奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中显著提高奶山羊乳脂含量而同时又降低乳糖含量、乳浓度的有效DNA标记。此检测方法在奶山羊的标记辅助选择（MAS）育种中，有利于快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。该方法操作简单、快速，成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。

附图说明

图1为奶山羊PITX2基因432bp片段的PCR扩增结果图；

图2为奶山羊PITX2基因第543位CC和TT基因型个体的测序图；

图3为RsaI PCR-RFLP方法检测山羊PITX2基因第1内含子SNP（NC_007304:g.543T>C or IVS1+110T>C）序列分析图，其中带框序列分别表示上下游引物序列，单个字母粗体且带框的黄色标记位点表示SNP位点。

图4为RsaI PCR-RFLP方法检测奶山羊PITX2基因第543位（内含子1第110位）SNP酶切电泳分型图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

（一）试剂及其来源

1.生化试剂与生物学试剂：

①Taq DNA聚合酶（购自MBI公司）；②限制性内切酶RsaI（购自MBI公司）；③dNTPs（购自MBI公司）；④Marker D2000（购自北京天根生化科技有限公司）；⑤蛋白酶K（购自华美生物工程公司）。

2.普通试剂：

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠（SDS）、溴化乙锭（EB）、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、琼脂糖等。

3．溶液与缓冲液

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in（1.034×10⁵Pa），25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

（1）样品采样所用溶液：抗凝剂ACD：柠檬酸0.48g；柠檬酸钠1.32g；葡萄糖1.47g。把它们定容于100mL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入1mL的ACD液。这一抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA，经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-70℃长期保存。

（2）血样基因组DNA分离所用溶液：①PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌；②10% SDS：10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL；③0.5mol/L EDTA：EDTA 186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；④1mol/L Tris·Cl：121.14g Tris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；⑤5mol/L NaCl：NaCl292.2g溶于1000mL超纯水中；⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mmol/L EDTA 40mL，1mmol/L Tris·Cl 10mL；⑦5mmol/LNaCl 4mL，10% SDS 10mL定容至100mL。实际浓度为200mmol/L EDTA，pH 8.0；100mmol/L Tris·HCl，pH 8.0；200mmol/L NaCl，2% SDS；RNase 20μg/mL；⑧NaAc缓冲液：NaAc·3H₂O 20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL；⑨TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液（pH 8.0）10mmol/L，EDTA缓冲液（pH 8.0）0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存；⑩蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存；

（3）组织样DNA提取所用溶液：除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配置以下试剂：①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌；②组织DNA提取液（100mL）：l mol/L Tris-Cl（pH 8.0）l mL，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL；

（4）琼脂糖电泳分析所用溶液：①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL；②上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40.0%（w/v）蔗糖水溶液。

(二)奶山羊PITX2基因部分DNA序列的克隆与DNA测序

A、奶山羊样品的采集及生产数据的收集

提取DNA所用血样（静脉采血）和耳组织样均采自658只健康且无血缘关系的2-4岁关中奶山羊，采自陕西省三原县奶山羊育种场（2009年7月）。

关中奶山羊奶产量数据来自育种场记录；奶山羊乳脂含量（包括平均乳脂含量、晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量）、乳糖含量（包括平均乳糖含量、晨乳乳糖含量和晚乳乳糖含量）、乳浓度（包括平均乳浓度、晨乳乳浓度和晚乳乳浓度）、乳固体物含量（包括平均乳固体物含量、晨乳乳固体物含量和晚乳乳固体物含量）、乳非固体物含量（包括平均乳非固体物含量、晨乳乳非固体物含量和晚乳乳非固体物含量）均由MilkoScan FT120(FOSS Corporation,Denmark)仪器测量所得。其中，早奶为早晨5：00获得的奶样，而晚奶为下午5：00获得的奶样。

B、血样基因组DNA的提取与分离

（1）冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。（2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。（3）加蛋白酶K至30μL（20mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；（4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；（5）加氯仿500mL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；（6）加氯仿、异戊醇混合液（24：1）500mL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；（7）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；（8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；（9）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；（10）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

C、组织样品DNA的提取与分离

（1）取奶山羊耳组织样约10mg的组织样品，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎；（2）加入600μL组织提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中；（3）将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；（4）取上清液，加入等体积的酚：氯仿（1：1），盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；（5）取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min；（6）取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至出现白色絮DNA；（7）挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；（8）再一次向离心管中加入500μL70％乙醇，盖紧管盖，缓慢颠倒，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上；（9）待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，4℃保存过夜，待检测。

D、DNA的纯化

（1）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL；（2）5℃保温10h左右；（3）等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次；（4）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；（5）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；（6）倒掉液体，70%乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

E、分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。根据如下公式计算DNA浓度：DNA浓度（ng）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

F、DNA池的构建

DNA检测完毕后，从100个浓度为50ng/μL的关中奶山羊DNA样品中各取10μL混合，构建关中奶山羊群体DNA池。

G、引物的设计

由于目前美国国立医学图书馆（NCBI）网站上并未公布奶山羊PITX2基因的序列，为此，以NCBI上公布的牛PITX2基因(GenBank accession No.NC_007304)序列为参考，利用软件Primer 5.0设计了扩增奶山羊PITX2基因第1内含子的432bp片段的PCR引物对P，其引物对P的序列信息如下：

上游引物：F:5'-TCGTCCATGAACTGCATGAAAGGC-3'(nt220-243)（参考序列：GenBank Accession Number:NC 007304）

下游引物：5'-AAAGGAAGGGAGGTCAGGGTCGTAAT-3'(nt 626-651)（参考序列：GenBank Accession Number:NC 007304）

H、PCR克隆奶山羊PITX2基因

以构建好的关中奶山羊群体DNA池为模板，用上述设计的引物进行PCR扩增，PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

灭菌超纯水（H2O）	9.2μL
		10×PCR缓冲液（MBI，Fermentas）	1.25μL
MgCl2（25mmol/L）	0.75μL
		dNTPs（2.5mmol/L）	0.2μL
上游引物（10pmol/L）	0.25μL
		下游引物（10pmol/L）	0.25μL
Taq DNA聚合酶（5U/μL）	0.1μL
		DNA模板（50ng/μL）	0.5μL
总体积	12.5μL

PCR反应的程序如下：95℃预变性5min，35个循环（94℃变性30s，55.9℃退火30s，72℃延伸30s）；72℃延伸10min。

奶山羊PITX2基因432bp片段的PCR扩增结果图如图1所示，其中泳道2-8为不同个体的432bp PCR扩增产物；泳道1为Marker=D2000,Ladder分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp）

I、PCR产物纯化和DNA池测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以关中奶山羊DNA池为模板的PCR纯化产物送南京金斯瑞有限公司进行双向测序。对奶山羊PITX2基因第1内含子432bp片段的测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰表示发生了单核苷酸突变。具体的测序图如图2所示，带框的字母C或T表示该位点为C或T等位基因（NC_007304:g.543C或NC_007304:g.543T）；绿线代表A碱基的测序峰，红线代表T碱基的测序峰，蓝线表示C碱基的测序峰，黑线代表G碱基的测序峰）。

具体的432bp的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，该序列对多态性进行了体现。

然后利用Blastn软件和BioXM（2.6）软件对T等位基因和C等位基因的相应序列进行序列比对和酶切位点分析，发现T>C的突变(NC_007304:g.543T>C)存在RsaI多态性，其分析结果如图3所示，图3为RsaI PCR-RFLP方法检测山羊PITX2基因第1内含子110位SNP(NC_007304:g.543T>C或IVS1+110T>C)序列分析图，其中带框序列分别表示上下游引物序列，单个字母粗体且带框的黄色标记位点表示SNP位点。

这表明筛查到了奶山羊PITX2基因的1个SNP，在其第543位为T或C的单核苷酸多态性，可表示为T>C。并且该多态性能够通过PCR-RFLP方法检测。

（三）奶山羊PITX2基因543位T>C多态性的RsaIPCR-RFLP分析

A、多态位点分析

当奶山羊PITX2基因第543位发生T>C突变时，即T突变为C，原来GTAT序列相应地变成GTAC，从而增加了RsaI限制性内切酶识别序列，能被限制性内切酶RsaI所切割。

B、PCR反应条件

PCR扩增体系和反应条件分别如前面所述，其中模板使用奶山羊个体基因组DNA，2.5ul PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，可以清晰的看到432bp的条带。

C、PCR产物酶切（RsaI）及RFLP检测

对PCR扩增产物首先分别进行RsaI酶切，然后根据琼脂糖凝胶电泳结果判定该位点的单核苷酸多态性。

酶切：RsaI酶切体系（20μL）：10μL奶山羊个体DNA PCR产物，2.0μL10×buffer缓冲液（含BSA），1.0μL（浓度10U/μL）的RsaI限制性内切酶，7μL灭菌超纯水（H₂O）。37℃恒温水浴或空气浴中消化6h。

琼脂糖凝胶电泳分型：制作1.0%的琼脂糖凝胶，100V电压下电泳，当分子量不同的DNA片段分离清晰时，EB染色，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像分析系统照相分析，人工进行判型。

检测结果如图4所示，其中，泳道1为Marker（D2000），Ladder大小分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp;泳道7、12、13、14和15为TT基因型；泳道2、3、4、5、6、8、9、10、11和16为TC基因型；泳道17和18为CC基因型。奶山羊PITX2基因PCR扩增产物的SNP位点所在序列为GTAT时，不能被限制性内切酶RsaI识别，432bp的基因片段不被切为121bp、109bp两条带，仅表现1条带；当上述该位点发生T>C的突变时(即GTAC)，能被限制性内切酶RsaI识别，432bp的基因片段被切为121bp、109bp两条带；由于山羊为二倍体动物，当发生T>C突变时，可形成不同的基因型，分别为TT、TC和CC，可以通过其酶切后的电泳图来进行判别：TT基因型表现为432bp一条带，TC基因型表现为432bp、320bp、112bp三条带，CC基因型表现为320bp和112bp两条带。

（四）DNA标记在关中奶山羊群体多态性中的诊断应用

A、群体多态性中的诊断:

利用上述的SNP检测方法对所有关中奶山羊的DNA样品分别进行PCR-RFLP的基因型鉴定。

B、SNP位点的频率统计分析:

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋N_Aa3＋N_Aa4＋……＋N_Aan）/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_T=（2N_TT+N_TC）/2N

P_C=（2N_CC+N_TC）/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

如表2所示的基因频率分布，关中奶山羊PITX2基因RsaI位点SNP中的T等位基因频率为0.953，C等位基因频率为0.047，符合等位基因频率大于0.01（1.0%）的SNP的定义，故本位点属于单核苷酸多态位点。

表2关中奶山羊PITX2-RsaI位点等位基因频率及基因型频率

（五）奶山羊PITX2基因SNP位点的基因效应关联分析

A、基因型数据：限制性内切酶RsaI识别的基因型（TT、TC和CC）。

B、生产数据：关中奶山羊奶产量、乳脂含量（包括平均乳脂含量、晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量）、乳糖含量（包括平均乳糖含量、晨乳乳糖含量和晚乳乳糖含量）、乳浓度（包括平均乳浓度、晨乳乳浓度和晚乳乳浓度）、乳固体物含量（包括平均乳固体物含量、晨乳乳固体物含量和晚乳乳固体物含量）、乳非固体物含量（包括平均乳非固体物含量、晨乳乳非固体物含量和晚乳乳非固体物含量）。

C、关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS（18.0）软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk=μ+A_i+G_j+(AG)_ij+e_ijk，

其中：Y_ijk为泌乳性状的观察值，μ为总体均值，A_i为年龄效应，G_j为基因型效应，(AG)_ij为年龄和基因型的交互效应，e_ijk为随机误差。由于所有实验动物（关中奶山羊）都由同一养殖场提供，且均为初产胎次，因此农场效应和胎次效应不予考虑。

结果表明(见表3)：关中奶山羊TT基因型晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量均显著高于TC基因型和CC基因型（P<0.05），而且TC基因型个体晨乳乳脂含量和晚乳乳脂含量均显著高于CC基因型个体（P<0.05），即：TT和TC基因型个体乳脂含量均显著高于其他基因型。这结果揭示，T等位基因对乳脂含量具有显著的正遗传效应，表明TT和TC基因型可以作为一个提高奶山羊乳脂含量的候选DNA遗传标记。

另一方面，CC基因型个体晨奶乳糖含量（%）和晚奶乳糖含量（%）显著地优于TT基因型和TC基因型（P<0.001或P=0.018），而TT基因型和TC基因型个体之间差异不显著；同时，CC基因型个体晨奶乳浓度（%）和晚奶乳浓度（%）极显著地优于TT基因型和TC基因型（P<0.001），而TT基因型和TC基因型个体之间差异不显著。即：CC基因型个体乳糖含量和乳浓度均显著高于其他基因型。

这些结果说明：T等位基因对乳糖含量（%）和乳浓度（%）具有显著的负向遗传效应，表明TT和TC基因型可以作为一个显著降低奶山羊乳糖含量（%）和乳浓度（%）的有效DNA遗传标记。

因此，在分析中国本土奶山羊PITX2基因内含子1的单核苷酸多态性（SNP）的基础上并通过性质关联分析，结果表明该位点的多态性中，（IVS1+110T>C)的TT基因型和TC基因型可以作为显著提高奶山羊乳脂含量而降低乳糖含量、乳浓度的有效DNA标记，从而应用于分子育种。

表3关中奶山羊P1位点(PITX2-RsaI)SNP与泌乳性能的关联分析

Claims (6)

1.一种奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，以奶山羊基因组DNA或包含PITX2基因的DNA序列为模板，以PCR引物对P为引物，扩增奶山羊PITX2基因，然后利用限制性内切酶RsaI对PCR产物进行酶切，

再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定SEQ.ID.NO.1所示的奶山羊PITX2基因第324位的单核苷酸多态性：TT基因型表现为432bp一条条带；TC基因型表现为432bp，320bp和112bp三条条带；CC基因型表现为320bp和112bp两条条带；

所述的引物对P为：

上游引物：tcgtccatga actgcatgaa aggc；

下游引物：aaaggaaggg aggtcagggt cgtaat。

2.如权利要求1所述的奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；35个循环：94℃变性30s，55.9℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为1.0%琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，将奶山羊PITX2基因第324SNP位点的TT和TC基因型作为有效DNA标记。

5.如权利要求4所示的奶山羊PITX2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的DNA标记为：

TT和TC基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊乳脂含量同时降低乳糖含量、乳浓度的DNA标记。

6.SEQ.ID.NO.1所示的奶山羊PITX2基因第324位的单核苷酸多态性中的TT和TC基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊乳脂含量同时降低乳糖含量、乳浓度的DNA标记的应用。

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