CN103290005B - 奶山羊adfp基因的单核苷酸多态性及其检测和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性及其检测和应用，其基因多态性包括：在奶山羊的ADFP基因序列表SEQ ID No.1第78位为A或C的碱基多态性。上述奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性为：以包含ADFP基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊ADFP基因后进行多态性的检测。RFLP多态性与产奶量关联分析证实：EcoRI多态位点与羊奶中的脂肪含量之间有显著相关，基因型为AA的个体产奶量显著高于基因型为AC和CC个体的。本发明可以用于奶山羊的辅助选择和分子育种，对提高奶山羊奶中的脂肪含量具有重要的作用。

Description

奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性及其检测和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性（SNP）的筛查和检测及其作为辅助选择标记在奶山羊育种中的应用。

背景技术

羊奶是保健营养品，作为人类的三大乳源之一，营养价值高，具有润心肺、利大肠、补肾益精、滋阴养胃、治消渴、食疗的功能，在西方国家被作为疗效食品。羊奶在国际营养界被誉为“奶中之王”。适用于婴儿、青少年、孕妇、成年人和老人（陈炜,2009）。近年来，随着我国人民生活水平的提高，人们对奶制品的需求也越来越多，在对牛奶需求量逐渐增加的同时，人们也了解到了山羊奶的营养价值，对山羊奶的需求也在渐渐的增加，但是由于山羊奶有膻味和奶山羊的产奶量较低；在我国优秀奶山羊品种种源不足和种群遗传品质较差也是制约我国奶山羊业发展的重要因素。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术（SSCP）、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。

ADFP又称脂肪分化相关蛋白，是脂滴周围蛋白PAT家族成员，是Jiang等通过差别杂交筛选技术在1246小鼠脂肪细胞中首次分离得到的一个蛋白质。ADFP基因在许多类型的细胞中都对中性脂肪的运输和储存有关系，富集的ADFP可以促进脂肪酸的摄入和甘油三酯的形成。

脂滴是乳汁的主要组成部分，它为新生儿细胞膜的形成提供了能量和必需脂肪酸。乳腺上皮细胞通过胞吐作用把脂滴释放到乳腺腔，然后形成一种球形结构，外面包被三层磷脂，称作乳汁脂肪球。ADFP是脂肪球上主要的蛋白质，另外还有两种蛋白质，膜绑定嗜乳脂蛋白和细胞质黄嘌呤氧化还原酶，它们三者之间相互作用把脂肪球转运到胞膜上。Bionaz和Loor等研究发现在哺乳期间ADFP基因mRNA的含量是嗜乳脂蛋白的2倍，同时ADFP和嗜乳脂蛋白和细胞质黄嘌呤氧化还原酶的含量都有所增加；后来Wickramasinghe的研究发现在牛的哺乳期ADFP的表达水平都保持相对的恒定。但至今，在奶山羊上有关ADFP基因对奶山羊泌乳的研究国内外还没有报道。

发明内容

本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查奶山羊ADFP基因的多态性位点，提供了一种奶山羊ADFP基因多态性及其检测和应用，所检测的多态性能够作为奶山羊分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：

在如SEQ ID N0.1所示的奶山羊的ADFP基因序列表的第78位为A或C的碱基多态性。

一种奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含ADFP基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊ADFP基因；

所述的引物对P为：

正向引物：aaaggtgtctctaatgtccc；

反向引物：cactgtgacaagattcccagatgaat；

用限制性内切酶EcoRI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的ADFP基因序列表SEQID No.1第78位的碱基多态性。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的根据3.0%的琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的ADFP基因序列表SEQ ID No.1第78位的碱基多态性为：AA基因型表现为196和27bp条带；AC基因型表现为223，196和27bp条带；CC基因型表现为223bp条带。

将SEQ ID N0.1所示的奶山羊的ADFP基因序列表的第78位AA基因型作为有效DNA标记。

所述的DNA标记为：

AA基因型作为提高奶山羊奶中脂肪含量的DNA标记。

SEQ ID N0.1所示的奶山羊的ADFP基因序列表的第78位的单核苷酸多态性中的AA基因型作为提高奶山羊奶中脂肪含量的DNA标记的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明对2个奶山羊品种和2个绒山羊样品的上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果表明EcoRI多态位点能够成为绒山羊与奶山羊的区分特征；同时也对EcoRI多态位点与萨能奶山羊生产性状之间进行了关联分析。方差分析结果表明，EcoRI多态位点能够成为提高奶山羊奶中脂肪含量的分子标记。针对上述SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增如图4的片段，能够用RFLP简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明把DNA池测序筛查SNP与CRS-RFLP结合起来解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，可用于奶山羊的辅助选择和分子育种。

附图说明

图1是本发明的技术流程示意图；

图2是本发明中PCR克隆筛查到的奶山羊ADFP基因序列表SEQ IDNo.1第78位A-C突变的SNP多态性测序结果图；

图3是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点、带波浪下划线为内切酶识别序列，小写“g”是引入的错配碱基；

图4是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为1.0%；

图5是本发明中奶山羊ADFP基因序列表SEQ ID No.1第78位的EcoRI-CRS-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0%；其中，AA基因型表现为196和27bp条带；AC基因型表现为223，196和27bp条带；CC基因型表现为223bp条带。

具体实施方式

本发明首先根据ADFP基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序。然后，进行测序图的分析和序列的比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的EcoRI-CRS-RFLP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和产奶量的关联分析，筛选出与奶山羊泌乳性状密切相关的分子标记。下面结合图1对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、山羊ADFP基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4种山羊品种，包括2中奶山羊和绒山羊，具体为：

1）关中奶山羊血样440份采自陕西省西安市三原塔南保种场；

2）西农萨能奶山羊血样268份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能奶山羊繁育中心（201份）和西北农林科技大学奶山羊场（67份）；

3）陕北白绒山羊血样192份采自陕西省横山县陕北白绒山羊种羊场；

4）新疆白绒山羊血样119份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；

2、血样基因组DNA的提取

1）将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

3）加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

7）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

8）4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

9）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（ng/μL）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；按照同样的方法也构建萨能奶山羊、陕北绒山羊、新疆绒山羊品种DNA池。

4、扩增引物设计

由于之前山羊ADFP基因的序列未知，故从NCBI数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得同源动物牛的GenBank登录号为：NC_007306的ADFP基因DNA序列，以该基因序列同源保守区序列为参考，用Primer5.0设计山羊ADFP基因的测序PCR引物对，扩增包含部分5’UTR、外显子1、内含子1和部分外显子2共886bp片段，其测序引物对序列如下：

正向引物：ggacgggctaatgataactgt         21；

反向引物：gtactgatgtaagccgaggaca        22。

5、PCR克隆山羊的ADFP基因

分别以4个山羊品种的DNA池为模版，用相应的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，见表1；PCR反应程序，见表2。

表1本发明的PCR反应体系

表2PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

最后，把以四个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。山羊ADFP基因目的片段886bp的测序结果如核苷酸序列表SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1的第1位为GenBank登录号：NC_007306的第330位。

对测序峰图进行分析和序列比对分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图2左起第4个位点发生了单核苷酸的突变，均出现了A、C两种检测结果，即本发明筛查到了奶山羊ADFP基因的1个SNP多态性，分别为：在奶山羊的ADFP基因序列表SEQ ID No.1第78位为A或C的碱基多态性。

奶山羊ADFP基因序列表SEQ ID No.1第78位由A突变为C，称为A>C突变。

b、奶山羊ADFP基因A>C突变的PCR-RFLP检测

在78位点无论发生A>C突变与否，与周围的其他序列都不能形成内切酶识别序列。这时需要通过引物引入错配，使得引物3’端和此处的野生型“A”在PCR扩增后形成一个EcoRI限制性内切酶识别序列GAATTC（见图3）。这样当第78位点发生A>C突变时，即A突变为C，内切酶识别序列GAATTC相应变成GCATTC，从而破坏了EcoRI限制性内切酶识别序列。

1、RFLP-PCR引物设计

针对SEQ ID No.1包含的第78位的A>C突变，利用Primer5.0进行设计引物，引物设计如图4所示，上游的正向引物设计为：

aaaggtgtctctaatgtccc20；

针对SEQ ID No.1包含的第78位的A>C突变，利用引入酶切位点在线设计软件（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）进行设计引物，引物设计如图4所示，下游的反向引物设计为：

cactgtgacaagattcccagatGaat26；

G为引入错配的碱基，它与野生型“A”形成EcoRI内切酶识别序列。

上述引物能够扩增山羊ADFP基因5’UTR223bp片段，其扩增的序列如图3所示，其中画框表明“A>C”即为SNP多态性位点。

2、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.0%琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示，可以清晰的看到223bp的条带。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

对PCR扩增后的产物首先分别进行EcoRI酶切，然后根据琼脂糖凝胶电泳结果判定其SNP多态性。

20μL的EcoRI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer（含BSA）2.0μL，EcoRI（10U/μL）1.0μL，8.0μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，65℃水浴5小时，3.0%的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1.5小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；由于PCR扩增的223bp片段中不包含其它的EcoRI酶切识别位点，因此与野生型“A”形成的酶切位点后，酶会将PCR扩增片段切为两个片段。

由于山羊为二倍体动物，当发生A>C突变时，可形成不同的基因型，分别为AA、AC、CC；可以通过其酶切后的电泳图来进行判别，如图5所示，其中各个泳道从左到右依次为DNA Maker（其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200、100bp）、AA、AC、CC，其中纯合子AA的两条DNA链均能被酶切，所以表现为196bp和27bp的条带；发生突变后的纯合子CC的两条链均不能被酶切，所以表现为223bp的条带；杂合子AC的两条链中的一条能够被酶切而另一条不能，所以表现为223、196和27bp三条带。由于27bp较小，在图5中未能看到。根据条带的个数、条带的大小在图5中能够判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

c、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对萨能奶山羊268份DNA样品、关中奶山羊440份DNA样品、陕北白绒山羊192份样品和新疆白绒山羊119份分别进行EcoRI-CRS-RFLP（图5）基因型的鉴定。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋……＋N_Aan）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3四个山羊品种中ADFP基因多态位点的基因型和等位基因频率

从表3可以看出:乳用品种（萨能奶山羊和关中奶山羊）的C等位基因频率较绒用品种（内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊）高，这表明等位基因C可能与泌乳性状相关。在绒用品种（内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊）中不存在CC基因型，这表明CC基因型可以作为绒山羊与奶山羊区分特征。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：EcoRI（AA、AC和CC）。

生产数据：体高、体长、胸围、年产奶量、奶中脂肪含量、蛋白含量和总固体的量。

关联分析样本：有完整泌乳记录的萨能奶山羊201只。

关联分析模型：

利用SPSS（16.0）软件分析基因位点、公畜、产羔季节、年龄和胎次因素与泌乳性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn=μ+Genotype_i+S_j+LS_k+LN_l+ Age_m＋Xn＋e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；μ为总体均值；Genotype为基因型效应；S_j为种公畜效应；LS_k为产羔季节效应；LN_l为胎次效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应,如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差。运用SPSS（16.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间与产奶量指标进行差异显著性检验。

结果表明（见表4）：在EcoRI可识别的SNP位点，三种基因型对体高、体长、胸围、产奶量、奶中蛋白质含量和总固体的量影响均不显著（P>0.05），但在奶中脂肪含量却差异显著（P<0.05）。说明AA基因型可以成为一个提高奶山羊奶中脂肪含量的分子遗传标记，应用于奶山羊的辅助选择或分子育种。

表4EcoRI多态位点与莎能奶山羊生产性状之间的方差分析（kg）

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P<0.05）。

Claims (3)

1.一种奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性分子标记，其特征在于，该分子标记的序列如SEQ ID No.1所示，在如SEQ ID No.1所示的奶山羊的ADFP基因序列表的第78位为A或C的碱基多态性。

2.一种奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含ADFP基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊ADFP基因；

所述的引物对P为：

正向引物：aaaggtgtctctaatgtccc；

反向引物：cactgtgacaagattcccagatgaat；

用限制性内切酶EcoRI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的ADFP基因序列表SEQID No.1第78位的碱基多态性；

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；

根据3.0％的琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的ADFP基因序列表SEQID No.1第78位的碱基多态性为：AA基因型表现为196和27bp条带；AC基因型表现为223，196和27bp条带；CC基因型表现为223bp条带；

将SEQ ID No.1所示的奶山羊的ADFP基因序列表的第78位AA基因型作为有效DNA标记；

所述的DNA标记为：

AA基因型作为提高奶山羊奶中脂肪含量的DNA标记。

3.如权利要求1所述的奶山羊ADFP基因的单核苷酸多态性分子标记作为提高奶山羊中脂肪含量的DNA标记的应用。