CN107988421B - 与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用。所述SNP标记位于大豆第10号染色体的9763969位，所述分子标记的核苷酸为C或T；含有所述标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述标记区间是大豆第10号染色体的9753969位‑9773969位区间。该SNP标记属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高油分品系选育提供了极大的便利，可应用于大豆种子油分组分改良中的分子标记辅助选择以及在种子油分含量相关基因的精细定位以及图位克隆中的应用，从而加速大豆种子油分含量性状的改良进程。

Description

与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用

技术领域

本发明属于大豆分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用。

背景技术

大豆是重要的油料作物，其油脂是食品业、工业深加工以及医疗保健药品的重要来源。大豆油脂中不饱和脂肪酸含量高达85%，其中亚油酸和亚麻酸是人体必需脂肪酸，具有降低血清胆固醇和甘油三酯及软化血管等重要生理功能，被营养学家称之为“安全脂肪酸”。关于大豆油分表型鉴定的研究早有报道。大豆种质资源油分含量及脂肪酸组分存在广泛的遗传变异。科学工作者测定了18840份大豆种质资源的油分含量，油分含量在15.10%～20.00%之间的种质居多为92.40%，油分含量小于15.10%或大于20.00%的特异种质较少为7.60%，遗传多样性指数为2.61。种质资源油分表型鉴定，为种质创新与育种奠定了基础，但种质较多、数据量较大且缺乏脂肪酸组成分级评价，不利于高油种质的利用。

近十余年，伴随测序技术的发展，使研究者对大豆基因组有了较全面的认识。对17株野生大豆和14株栽培大豆的基因组重测序研究表明，发现了630多万个SNPs，分析表明，大豆存在较高程度的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），有利于对目标性状进行关联分析。1996年，首次利用LD定位了躁郁症相关基因。关联分析是LD应用的一种，其检测的是某群体内处于LD状态的一些标记或候选基因的遗传变异与特定表型显著关联的频率是否比期望的高。目前关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量，水稻氨基酸组分，黑小麦铝毒抗性等。近年利用关联分析法开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著提高种子油分含量遗传改良进程。

迄今为止，通过连锁分析对大豆种子油分含量相关基因进行数量性状基因位点(Quantitative trait locus，QTL)定位研究的较多，现发现100余个大豆种子油分含量相关QTL，主要分布在F、G、M、C2、I等连锁群上，相关的作用机理及其应用研究还尚未充分进行。然而并未发现与大豆种子油分含量性状相关的SNP（Single nucleotidepolymorphism，单核苷酸的多态性）分子标记，给大豆种子油分含量性状的遗传改良和分子标记辅助选择育种带来了困难。

发明内容

本发明提供的一种与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用，该分子标记与大豆种子油分含量性状密切相关，可以更有效反应大豆种子油分含量，可用于大豆分子标记辅助选择育种和遗传改良，显著提高种子油分含量较大材料的选择效率。

本发明的第一个目的是提供一种与大豆种子油分含量相关的分子标记，所述分子标记位于大豆第10号染色体的9763969位，所述分子标记的核苷酸为C或T。

本发明的第二个目的是提供一种含有所述的与大豆种子油分含量相关的分子标记的标记序列，所述标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有所述的与大豆种子油分含量相关的分子标记的标记区间，所述标记区间是大豆第10号染色体的9753969位-9773969位区间。

本发明的第四个目的是提供一种扩增所述的标记序列的引物，所述引物为：

M10-O1F：5’- AAACAGGATGCTACCGCA -3’，如SEQ ID NO. 2所示，

M10-O1R：5’- CATTTGGTCTCTTTCTCCCA -3’，如SEQ ID NO. 3所示。

本发明的第五个目的是提供一种所述的SNP标记在大豆油分含量品质育种中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种所述的标记序列在大豆油分含量品质育种中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种所述的标记区间在大豆油分含量品质育种中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种所述的引物在大豆油分含量品质育种中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种与大豆种子油分含量相关的SNP标记及其应用，具有以下有益效果：

（1）本发明提供的一种与大豆种子油分含量相关的分子标记，该分子标记为SNP标记，且属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高油分品系选育提供了极大的便利。本发明提供的分子标记可应用于大豆种子油分组分改良中的分子标记辅助选择以及在种子油分含量相关基因的精细定位以及图位克隆中的应用，从而加速大豆种子油分含量性状的改良进程。

（2）本发明的大豆10号染色体的9763969±100Kb的区间都是大豆种子油分含量的理想标记区间，其中9763969位SNP的贡献率为13.52%，加性效应为2.72。用该位点的SNP标记在高世代育种群体进行选择，可筛选到油分含量高于21.25%的材料，精确度约为70%，大大减少了选择成本，提高了品质改良的效率。

附图说明

图1为280个大豆关联群体种子油分含量分布图；

图2为基于SNP、通过admixture软件分析得到的关联群体的群体结构图；

图3为大豆种子油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中收集的并利用索氏抽提法测定了油分含量的大豆种质资源信息如下：包括我国40°N以北的大豆种质资源280份，均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。280份大豆种质资源来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古、新疆等。

本发明提供的一种与大豆种子油分含量相关的分子标记，所述分子标记是与大豆油分含量极显著相关的SNP标记，该SNP标记位于大豆第10号染色体的9763969位（参考基因组为Wm82.a2.v1），核苷酸基因型为C或T，属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高油分品系选育提供了极大的便利；含有所述分子标记（SNP标记）的标记序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，为：

AAACAGGATGCTACCGCAAAAAAGACTATACAAGGAGAAA TATAAAGAT TTTCTCTCTAAGACTGTTAGAAAATAAAATAAAAATAAAAGAAATAAATACGAAGAAGATGCACAGTCTTAATTAAATAACAAAATAATAATAGCAAAATAAATTTAATTGACAGCACATGAATAACGCATTATAACATACAATAAGTGAAAAAATAAATTAGGGAAAGAAAGATATAGTCTGGGTTGAAGCGCGTAAACGCTATTCTTAGAGAGAAAACACCCTACTGCATTGATAGGAAAAAATTTGATTGTGCT[C/T]CTCTTCCAAGATACGACAACCTGTTGATTCCGATCGTGTGCAGCGAAAGGATCCCCGAACCTTCTAAACACCAATGCTCTTGCTCTCACAAAAATAAGTTTTTTTATAAGAAAAGAAAGAGACAAATTGTTGGGAGAAAGAGACCAAATG ；

含有所述的与大豆种子油分含量相关的SNP标记的标记区间9753969位-9773969位（即9763969±100Kb）区间。

上述SNP标记具体按照以下方法获得：

一、大豆关联群体的种子油分含量测定

田间种植280份大豆种质资源，待种子完全成熟后，收获种子，提取种子油分（粗脂肪含量），以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。操作步骤如下：

（1）10g大豆种子用烘箱80℃烘烤12h至恒重。

将滤纸切成4cm×4cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔做好记号，将滤纸包称重（记做a）。

种子粉碎，过60目筛子后，称取约0.2g 粉末放入上述已称重的滤纸包中装入，封好包口称重（记做b）。

将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，向其中注入约20ml的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温为55 ~ 60℃，使冷凝下滴的乙醚成连珠状，抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（约1h）。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，提取瓶中的乙醚另行回收。

待乙醚挥发之后，将滤纸包置于65℃烘箱中干燥8min，放入干燥器冷却至恒重为止（记做c）。

油分含量 = （b-c）/（b-a）×100%。280份资源的油分含量在群体内符合正态分布，属于数量性状，遗传多样指数为2.71，如图1所示，图1为280个大豆关联群体种子油分含量分布图，图1中纵坐标表示样品个数，横坐标表示大豆种子的油分含量。

二、大豆种子油分含量全基因组关联分析

利用SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技术对280份种质进行全基因组测序，利用BWA将测序reads比对到参考基因组上，并使用GATK和Samtools两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。具体步骤如下：

1、用CTAB法提取上述280份种子单株叶片DNA，用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度达100ng/μL，并用1%琼脂糖电泳检测DNA的纯度及完整性，要求DNA无降解，DNA中无蛋白质、多糖等污染。

2、利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的SLAF-seq技术对280份种子单株叶片DNA进行群基因组测序，具体步骤如下：

（1）基因组酶切：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶 RsaI 和 HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，然后选择基因组片段范围在 364 ~ 414bp的SLAF片段。

（2）基因测序：对得到的SLAF片段用Klenow Fragment（3′→ 5′exo–）（NEB）和dATP 在 37℃下进行 3′ 端加A处理，连接Dual-index测序接头，然后进行PCR 扩增及PCR扩增产物的纯化、混样、切胶回收目的片段，并对回收的目的片段进行cDNA文库质检，cDNA文库质检合格后用 Illumina HiSeqTM 2500 进行测序。共获得713.59M reads数据，测序平均Q30为95.80%，平均GC含量为43.21%。为评估建库实验的准确性，选用水稻（Oryzasativa）作为对照（Control）进行相同的处理参与建库和测序。

其中，所述PCR 扩增使用的引物为F：5’- AATGATACGGCGACCACCGA-3’（SEQ ID NO.4）和R：5’- CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’（ SEQ ID NO. 5）。

其中，利用Agencourt AMPure XP beads（Beckman Coulter, High Wycombe，UK）进行PCR扩增产物的纯化。

（3）SNP标签与基因分型：根据测序 Reads 在参考基因组上的定位结果，利用GATK软件进行局部重比对（Local Realignment）和变异检测，同时采用samtools软件进行变异检测，取GATK软件和samtools软件两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）的准确性，最终筛选可用的SNP标签为1819858个。得到SNP数据集。

3、系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于上述1819858个SNP，通过MEGA5软件，neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。

4、获得遗传结构数据：群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于1819858个SNP，通过admixture软件，分析样品的群体结构，分别假设样品的分群数（K值）为1 ~ 20，进行聚类，聚类结果如图2所示。图2为基于SNP、通过admixture软件分析得到的关联群体的群体结构图，分别假设样品的分群数（K值）为1-20，进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为12。

5、基于1819858个SNP，通过EIGENSOFT软件，进行主成分分析（Principalcomponents analysis，PCA）分析，得到样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。

6、获得亲缘关系Kinship矩阵数据：使用SPAGeDi 软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系（relative kinship）进行估计，得到亲缘关系Kinship矩阵数据。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。

7、基于关联群体SNP标记数据、遗传结构数据、亲缘关系Kinship矩阵数据以及油分含量数据，利用TASSEL5.0软件的混合线性模型（M ixed linear model，MLM）进行全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）。X为基因型，Y为表型，最终每个SNP位点都能得到一个关联结果，图3为大豆种子油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图，纵坐标为p-value的负对数，横坐标为染色体，一个点代表一个SNP位点；红色虚线（图3下方的虚线）为0.1/SNP数目的负对数，蓝色虚线（图3上方的虚线）为0.01/SNP数目的负对数，高于蓝线的点，表明对应的SNP标记与油分含量显著相关，其中10号染色体蓝线上的最高的绿点对应的是9763969位SNP。以 LOD≥8为筛选标准，在10号染色体的9763969位得到与油分含量显著关联的SNP标记（C/T），该SNP标记详细信息如表1所示。

表1 大豆种子油分含量显著关联的SNP标记信息

染色体	SNP类型	物理位置（bp）	标记区间	贡献率（%）	加性效应
						10	C/T	9763969	9763969±100Kb	13.52	2.72

三、种子油分含量显著关联SNP标记的应用

与大豆种子油分含量紧密连锁的SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，命名为M10-O1，其中具有多态性的位点基因型为C/T（序列表的SEQ ID NO. 1序列的第308位以[c/t]表示），该基因型位于大豆第10号染色体的9763969位，其是以待鉴定材料的基因组DNA 作为模板，以M10-O1引物进行PCR扩增所得的片段。

其中，扩增引物为：

M10-O1F：5’- AAACAGGATGCTACCGCA -3’（SEQ ID NO. 2）

M10-O1R：5’- CATTTGGTCTCTTTCTCCCA -3’（SEQ ID NO. 3）

利用上述SNP标记辅助判断大豆油分含量的具体步骤如下：

1.利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA

1) 取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。

2) 加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。

3) 加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5-10次，10000rpm离心15min。

4) 取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24:1（V/V）的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase（10mg/mL）室温下放置 30min。

5) 加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。

6) 用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。

7) 用0.8％的琼脂糖检测 DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。

2.利用M10-O1F/ M10-O1FR的引物进行PCR扩增，得到M10-O1扩增产物。

1)PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10ng基因组模板DNA 2μL，2×Es TaqMasterMix 10μL，10mM的引物各2μL和ddH₂O 4μL。

2) PCR扩增条件：94℃预变性3min ；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s ；循环35次；72℃终延伸10min。

3. 根据序列比对结果判断油分含量高低

将M10-O1扩增产物进行测序分析，扩增产物自5’端第308位为T的品系亚群油分含量均值显著高于该位点为C的品系亚群均值。280份样品中有61.23%的样品的第308位为T的品系油分含量高于21.25%，这表明该SNP标记用于辅助选择是切实有效的。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> 与大豆种子油分含量相关的分子标记、区间、引物及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 458

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 1

aaacaggatg ctaccgcaaa aaagactata caaggagaaa gtataaagat tttctctcta 60

agactgttag aaaataaaat aaaaataaaa gaaataaata cgaagaagat gcacagtctt 120

aattaaataa caaaataata atagcaaaat aaatttaatt gacagcacat gaataacgca 180

ttataacata caataagtga aaaaataaat tagggaaaga aagatatagt ctgggttgaa 240

gcgcgtaaac gctattctta gagagaaaac accctactgc attgatagga aaaaatttga 300

ttgtgct[c/t]ct cttccaagat acgacaacct gttgattccg atcgtgtgca gcgaaaggat 360

ccccgaacct tctaaacacc aatgctcttg ctctcacaaa aataagtttt tttataagaa 420

aagaaagaga caaattgttg ggagaaagag accaaatg 458

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacaggatg ctaccgca 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catttggtct ctttctccca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagcagaag acggcatacg 20

Claims (2)

1.一种含有与大豆种子油分含量相关的分子标记的核苷酸序列在大豆油分含量品质育种中的应用，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，SEQ ID NO. 1中的第308位为C/T。

2.根据权利要求1所述的含有与大豆种子油分含量相关的分子标记的核苷酸序列在大豆油分含量品质育种中的应用，其特征在于，扩增所述核苷酸序列的所述引物为：

M10-O1F：5’- AAACAGGATGCTACCGCA -3’，

M10-O1R：5’- CATTTGGTCTCTTTCTCCCA -3’。

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