CN116926234B - 与大豆籽粒油分含量相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP分子标记及其应用。该分子标记位于大豆20号染色体的897±50kp，分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该SNP的油分含量遗传贡献率为18.21~18.60%，加性效应为0.62%。该标记的发现大大减少了选择成本，提高了大豆品质改良的效率。
Description
技术领域
本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及一种大豆籽粒油分含量相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
大豆是世界上最常见的豆科植物，不仅属于粮食作物，更是重要的经济作物。因其籽粒富含优质油分，对人类消费和工业应用具有很大贡献。目前，我国是世界上大豆进口最多的国家，而且需求量还在与日俱增，选育高油大豆新品种已成为育种者和生产者关注的关键问题。从遗传角度来看，大豆油分含量性状是由多基因控制的复杂数量性状，但使用常规育种手段提高大豆油分含量的效率较低。随着分子生物学技术的飞速发展，基因精细调控技术能够实现优异等位基因的聚合和高效利用，是选育突破性大品种的关键技术之一，也是未来提升大豆品种育种能力的必要手段。而发掘大豆油分含量优异等位基因的分子标记，不但能够为高油大豆的优异等位基因的聚合提供技术储备，也可为基因精细调控技术改良大豆品质提供明确指导。
近年，伴随测序技术的发展，研究者对大豆基因组有了较全面的认识。全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）是当前研究生物基因组的先进方法，通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记（如SNP或CNV等）分型，从而寻找与生物表型相关的基因型的研究方法。现有技术通过全基因组测序技术在570份野生大豆中检测到近30000个单核苷酸多态性（SNP），并对这些野生大豆种子测定了蛋白质含量、籽粒油脂含量和5种脂肪酸水平，结果表明有29个SNP与野生大豆种子的7种组成性状显著相关。目前，关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量、水稻氨基酸组分、黑小麦铝毒抗性等。近年利用GWAS开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著加快大豆高油品种遗传改良进程。
目前国内外已有影响大豆籽粒油分含量相关位点的报道，但是其中很多都采用相对较落后的SSR、AFLP、RFLP和RAPD等低密度分子标记构建遗传图谱，位点不够精确；其次当前功能位点涉及到的分子标记多数来源于重组自交系或单一父母本构建群体，可以在不同环境或不同遗传背景中被重复检测到的QTL较少。这些标记应用到杂交品种和地方品种等自然群体时，往往不能够作为分子标记辅助育种使用，也无法解释位点的遗传贡献率。
因此，有必要寻找一种标记能够更精准定位区间及广泛应用于不同栽培大豆群体的杂交亲本筛选籽粒油分含量相关的SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸的多态性）分子标记，进而应用到大豆品质遗传改良中。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP分子标记，该分子标记位于大豆20号染色体的897±50kp（参考基因组为G. max Wm82.a2.v1），该SNP位点属于共显性的标记，可靠且使用方便，为大豆高产及品质改良育种工作提供了极大的便利。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP分子标记，所述分子标记位于大豆20号染色体的897±50kp，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在第277位碱基为C或T。
本发明第二方面，提供一种检测所述分子标记的引物对，所述引物对包括正向引物及反向引物，所述正向引物的序列为：5’- CCATCTCATCTCATGCCAGA -3’，所述反向引物序列为：5’- TGGTCCGTCTACTTCAGCAA -3’。
本发明第三方面，提供一种试剂盒，其包括所述引物对。
本发明第四方面，提供一种所述引物对在大豆籽粒油分含量判断中的应用。
优选地，大豆籽粒油分含量判断的方法包括以下步骤：
提取待鉴定材料的基因组DNA；
利用所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物进行测序分析，根据分析结果判断大豆籽粒油分含量。
优选地，PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10-50ng基因组模板DNA 3μL，10μLQuick Taq HS DyeMix，10 pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
优选地，PCR扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
优选地，扩增产物自5’端第277位为C的大豆品系中籽粒油分含量高于扩增产物自5’端第277位为T的大豆品系中籽粒油分含量。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供一种与大豆油分含量显著关联的精确标记基因位置的SNP分子标记，该分子标记在大豆20号染色体的第897062位的碱基为C或T（参考基因组为G. maxWm82.a2.v1）。
2、本发明发现，20号染色体的897±50kp的区间都是调控大豆油分含量的理想标记区间，其中897062位SNP的油分含量遗传贡献率为18.21~18.60%，加性效应为0.62%。经过试验验证，2021年在该位点为C的74.85 %品系油分含量高于20.06%，2022年在该位点为C的63.17%品系油分含量高于20.57%，精确度可达63.17%。表明该标记用于辅助选择是切实有效的，该标记的发现大大减少了选择成本，提高了大豆品质改良的效率。
3、本发明从334份不同的大豆栽培群体中开发得到与调控大豆油分含量相关的SNP分子标记qOil20-1，该分子标记能够广泛应用于不同栽培大豆群体的遗传育种中。
附图说明
图1为基于SNP并通过admixture软件，得到的关联群体的群体结构图；
图2为334份关联群体2年(E1:2021年，E2：2022年) 油分含量频数分布图；
图3为334份自然群体2年(E1:2021年，E2：2022年) 大豆油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图；
图4为334份自然群体2年(E1:2021年，E2：2022年) 大豆油分含量的分子标记对应的大豆油分含量差异Box图。
实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本研究中收集测定我国40°N以北的大豆种质资源3000份，均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
大豆种子油分含量关联群体的构建及性状测定
本实施例中使用大豆种质资源库内3000份种质资源，其来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古、新疆等。田间种植3000份资源，待种子完全成熟后，收获种子，每个品种随机选取20粒有代表性的种子进行测量。3000份资源的油分含量在群体内符合正态分布，遗传多样指数为5.81。从中抽取334份资源，油分含量遗传多样指数仍为5.81，将334资源作为关联群体。其操作步骤如下：
（1）根据群体油分含量平均值（X）和标准差（δ）分为10类群，1类<X-2δ，10类≥X+2δ，中间每类相差0.5δ。各性状的遗传多样性采用Shannon's信息指数（H'）进行评价，H'=-ΣP ilnP i，P i表示第i种变异出现的频率，通过计算3000份资源油分含量的遗传多样性为5.81。
（2）在每个类群随机抽取33~34份资源，共抽取334份资源，计算遗传多样指数H'，当等于5.81时，即确定这334资源为关联群体，该群体的油分含量呈正态分布，参照图1。
实施例
大豆油分含量全基因组关联分析
1、基因组DNA提取
用CTAB法（TaKaRa试剂盒Code No.9768）提取关联群体的334份资源单株叶片DNA，用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度并用1%琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性。要求无降解，无蛋白质、多糖等杂质污染，浓度达100ng/uL以上。
2、基因组测序
利用安诺优达基因有限公司的全基因组重测序技术对334份资源进行群基因组测序，具体操作如下：
酶切
利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶 RsaI 和HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，选择基因组片段范围在 364~414bp的SLAF片段。
测序
对得到的SLAF片段用Klenow Fragment(3′→ 5′exo–)(NEB) 和 dATP 依次进行如下处理：在 37℃下进行 3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR 扩增、纯化(Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter, High Wycombe,UK))、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用 IlluminaHiSeqTM 进行测序。为评估建库实验的准确性，选用大豆（‘Williams 82’: G. max Wm82.a2.v1）作为对照（Control）进行相同的处理参与建库和测序。共获得112G reads数据，测序平均Q30为92.20%。
其中，PCR 扩增引物为：
F：5’- AATGATACGGCGACCACCGA -3’，如SEQ ID NO：4所示；
R ：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’，如SEQ ID NO：5所示。
（3）SNP开发
根据测序 Reads 在参考基因组上的定位结果，GATK 进行局部重比对、GATK 变异检测及samtools 变异检测，取 GATK 和 samtools 两种方法得到的交集变异位点，以保证检测得到的 SNP 的准确性。以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，共得到3,306,713个群体SNP。
3、群体进化树构建
系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于SNP，通过MEGA5软件，neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。
4、聚类分析
群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于SNP，通过admixture软件，分析样品的群体结构，分别假设样品的分群数（K值）为1~12，进行聚类。并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为8，参照图1。
5、主成分分析
基于SNP，通过TASSEL5软件，进行主成分分析（Principal components analysis，PCA），得到样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。
6、亲缘关系估计
使用plink软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(relative kinship)进行估计。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。
大豆籽粒油分含量测定
检测 334份关联群体2年(E1:2021年，E2：2022年) 的油分含量(Oil)。以横坐标表示大豆籽粒油分含量，纵坐标表示样品个体数，得到大豆籽粒油分含量频数分布图，并参考大豆油分含量分析样品个体数变化的趋势线。
结果表明大豆种子油分含量呈正态分布，属于数量性状，参照图2。
8、SNP标记确定
基于关联群体SNP分子标记数据、遗传结构数据、Kinship矩阵数据以及油分含量数据，利用GAPIT数据包的混合线性模型（(Mixed linear model，MLM）进行全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）。X为基因型，Y为表型，最终每个SNP位点都能得到一个关联结果，参照图3。图中纵坐标为p-value的负对数(−log10(p))，横坐标为染色体，一个点代表一个SNP位点；虚线为1/SNP数目的负对数，高于虚线的点，表明对应的SNP标记与油分含量显著相关，其中20号染色体虚线上的最高点对应的是897062位SNP。
以−log10(p)≥6.58为筛选标准，在20号染色体的897062位得到与油分含量显著关联的SNP标记（C/T），详细信息如表1所示。
表1大豆籽粒油分含量(Oil)显著关联SNP信息
由表1可知，20号染色体的897±50kp的区间都是调控大豆油分含量的理想标记区间，其中897062位SNP的油分含量遗传贡献率为 18.21~18.60%，加性效应为0.62%。
实施例
大豆油分含量显著关联SNP标记的应用
与大豆油分含量紧密连锁的SNP标记为20号染色体的897062位（C/T），命名为qOil20-1，其是以待鉴定材料的基因组 DNA 作为模板，以qOil20-1引物进行PCR扩增所得的片段；qOil20-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示：
ACTCTTTTTC CACATATGAA GAAGGAAGGC CTCTTACTGT GAAATCGACT GAAAAAAACCTTGTTTGCAA GAGCCTCAAA TTCATGATAT TTGTGAACAA ATATATAATT AGATTGTTTT TTTATTCTTGAAACCATCAA TCACTGTTAA ATGTTTCTAC AATTGACAGG GTGTAAATGA CCAACGGTGG CACCTTAGTTGTGTAATTAA GTTAATCATG CAGTGGAGAA GACTTTCATA ACCTACTTCG ACAATTTCTA TACCTCAAAAAGAATTCTGT CTCAAACTAT CAGTTGGAGA TATCTTTGAT TAAAAAAAAA TAATCATCCA GTATATTTGTAGACCAAATT TATTTCAGCC CAAACGCTTT GTATAGAAGA GGCAGGTTTC AGTACTTTAT TATTAGAAAAAAAAGGATAA ATGATCAAAT TAGTCCCCAA AAGTGTATAT AATTTTTAGT TGTTAGTCCC CGAAATAAAATAAATTCAAA ACGTTCTTAA AAGTAGCTTC CATCATTCAC ATTTGTTCTG TGGATGATAG TTAAGTAACT
其中，qOil20-1引物为：
qOil20-1-F：5’- CCATCTCATCTCATGCCAGA -3’，如SEQ ID NO. 2所示；
qOil20-1-R：5’- TGGTCCGTCTACTTCAGCAA -3’，如SEQ ID NO. 3所示。
利用上述SNP分子标记qOil20-1辅助判断品种后代油分含量的具体步骤如下：
S1、利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA；
S11、取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。
S12、加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。
S13、向所得上清液中加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5~10次，10000rpm离心15min。
S14、取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用24：1（V/V）的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL RNase（10mg/mL）室温下放置 30min。
S15、加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。
S16、所得沉淀用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。
S17、用0.8％的琼脂糖检测 DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。
S2、利用SNP标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物。
PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10~50ng基因组模板DNA 3μL，10μL Quick TaqHS DyeMix，10 pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
PCR扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
S3、根据序列比对结果判断种子油分含量
将扩增产物进行测序分析，扩增产物自5’端第277位为C的品系亚群油分含量均值显著高于该位点为T的品系亚群均值。如图4所示，该位点为C的品系亚群油分含量均值为20.57%（2021年）和20.78%（2022年），显著高于该位点为T的品系亚群的19.33%（2021年）和19.54% (2022年)。且2021年在该位点为C的74.85 %品系油分含量高于20.06%，2022年在该位点为C的63.17%品系油分含量高于20.57%，精确度可达63.17%。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.一种SNP分子标记的扩增引物对在大豆籽粒油分含量判断中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列的第277位碱基为T或C；所述引物对包括正向引物及反向引物，所述正向引物的序列为：5’-CCATCTCATCTCATGCCAGA -3’，所述反向引物序列为：R: 5’- TGGTCCGTCTACTTCAGCAA -3’；
大豆籽粒油分含量判断的方法包括以下步骤：
提取待鉴定材料的基因组DNA；
利用所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物进行测序分析，根据分析结果判断大豆籽粒油分含量：
SEQ ID NO：1所示序列自5’端第277位为C的大豆品系中籽粒油分含量高于该位点为T的大豆品系中籽粒油分含量。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10~50ng基因组模板DNA 3μL，10μL Quick Taq HS DyeMix，10 pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，PCR扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
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