CN114231654B - 一种与油菜千粒重关联的parms分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜千粒重关联的两个位点及其PARMS检测标记在油菜育种的应用。其中一个位点qSW.A1‑1的峰值SNP标记Bn‑A01‑p17494364位于油菜A01染色体的第14,943,779位碱基处，平均可解释6.8%的表型方差，平均加性效应为0.147克。另一个位点qSW.A4‑5的峰值SNP标记Bn‑A04‑p18089854位于A4染色体的第18,176,833碱基处，平均可解释10.3%的表型方差，平均加性效应为0.138克。利用这两个SNP开发的PARMS标记对油菜关联群体进行检测，发现其操作简便且分型清晰，而且无论是单独还是两者联合使用对油菜粒重都有良好的选择效果。

Description

一种与油菜千粒重关联的PARMS分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与油菜千粒重关联的分子标记及应用。
背景技术
菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占比为我国植物油生产总量的55％以上(王汉中，2018)。然而我国国产植物油自给率不足35％，严重威胁其供给安全。为了保障我国国产植物油的有效供给，在种植面积增长乏力的情况下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是唯一出路。近年来，我国油菜高油分育种取得突破(傅廷栋，2014)而单产仍然低于世界平均水平(http://apps.fas.usda.gov/psdonline/)且增加十分缓慢，这严重影响了油菜种植效益和油菜产业的国际竞争力。因此，我国油菜单产亟待提高(殷艳和王汉中，2012)。
在同一种植密度条件下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量直接决定于全株角果数、每角粒数和粒重三个构成因子。虽然油菜产量的三个构成因子之间呈现一定程度的负相关，但其系数往往不大，因此可以通过提高产量构成因子(如粒重)来增加产量。2005-2013年国家冬油菜登记品种产量特征数据显示，油菜产量从2005年的2490.99千克/公顷到2013年的2861.25千克/公顷，增长了14.9％；千粒重从3.46克增加为3.85克，增幅为11.2％，每角粒数从20.08粒到21.13粒，增幅为5.2％；而全株角果数则呈现显著减少趋势(从平均每株387.45角降到280.52角)，下降了27.6％(Hu et al.,2017)。因此，从育种实践上看，油菜单产的增加确实能通过提高粒重等构成因子来实现。目前，油菜品种的千粒重一般都低于4g，而油菜种质资源中千粒重的最大值可以超过8克(陈苇等，2011)，说明油菜粒重仍有很大提升空间。
随着分子标记技术的不断发展，其在作物中的应用越来越广泛。Grodzicker等(1974)创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记技术。RFLP是第一代分子标记，具有数量丰富、稳定遗传、专一性、重复性好、共显性等特点。但是，该标记需要的DNA量比较大；且操作程序繁琐、耗时费力、周期长；还需要使用放射性同位素对探针进行标记，这些因素都局限了RFLP标记的广泛使用。AFLP标记结合了PCR和RFLP标记技术，在作物遗传多样性研究、细胞学研究、品种纯度鉴定和抗病等研究中得到广泛的应用(宋顺华等，2006；袁素霞，2009；王雪，2004)。但AFLP标记也存在一些缺点：成本较高，过程复杂，技术难度大；标记大多为显性标记；对DNA质量和限制性内切酶质量要求较高。SSR标记，也叫微卫星DNA标记(microsatellite DNA)，已经被广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、DNA指纹图谱、品种纯度鉴定、种质资源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中(陈烨丽，2010；缪体云，2007；荆赞革，2010；王冬梅，2011)。SSR标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，但难以实现高通量批量化的检测。近十年来，随着测序技术的持续进步，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能，如SNP标记和InDel标记(Hyten et al.，2010)。目前，全基因组选择育种芯片还只在水稻中开始尝试(Yu et al.,2014)，油菜等其他作物仍以分子标记辅助选择为主。目前SNP检测方法主要分为两大类：一大类是以单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，另一大类是以直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。这两类方法各有优缺点，目前已有将两者结合起来的检测方法如KASP(Lister et.,2013)和PARMS(Luet al.,2020)等，不但操作简便、成本低廉而且能实现高通量的检测。
粒重是一个典型的由多基因控制的复杂数量性状，表型连续分布而且容易受环境条件的影响。粒重的遗传以加性效应为主，显性和上位性较弱，因而其杂种优势很弱，具体表现为杂种的粒重一般都介于双亲之间(李娜，2015)。数量遗传学和分子标记技术的结合，可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前，利用连锁作图(linkage mapp ing)和关联作图(association mapping)的方法，在油菜种已定位到一百多个千粒重QTL(Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；Radoev et al.,2008；Shi etal.,2009；王峰等，2010；Basunanda et al.,2010；Fan et al.,2010；Zhang et al.,2011；赵卫国等，2017)，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本发明通过对油菜千粒重性状进行十个环境下的全基因组关联分析，旨在找到对油菜千粒重具有改良效应的稳定位点，并据此开发实用的高通量低成本的分子标记，用于油菜高产育种的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的是在于提供了油菜A01染色体上和粒重显著关联的稳定位点qSW.A1-1，该位点位于甘蓝型油菜A01染色体第14,943,779位碱基处。
本发明的另一个目的在于提供与油菜粒重显著关联的稳定位点组合，为qSW.A1-1和qS W.A4-5，所述的qSW.A4-5位点位于甘蓝型油菜A04染色体第18,176,833位碱基处。
本发明还有一个目的在于提供了上述两种位点的PARMS标记检测引物。
本发明的最后一个目的在于提供上述PARMS标记在油菜千粒重选择育种中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与油菜千粒重相关的SNP位点的获得：
(1)收集331份油菜总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。
(3)将关联群体的331份品系分别在10个环境种植，成熟期挑选关联群体的各个品系中长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各品系平均值。
(4)结合关联群体的千粒重表型数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行关联分析。最终在A01染色体上获得与粒重显著关联的位点qSW.A1-1，其峰值SNP标记Bn-A01-p17494364位于油菜DarmorV4.1参考基因组第14,943,779位碱基处(碱基为A/T或G/C)，可以在W14、W15、W16和Z14四个环境中被重复检测到。同时在A04染色体上获得与粒重显著关联的位点qSW.A4-5，其峰值SNP标记Bn-A04-p18089854位于第18,176,833碱基(A/T或G/C)，可以在W12、W14、W15、W16和N16五个环境中被重复检测到。
(5)提取油菜A01染色体第14,943,779位碱基上下游各100bp的序列，按照PARMS引物设计原则获得引物序列：qSW.A1-1F：AGAGAGATTCGTGATTTCAAGATAAG；qSW.A1-1Ra：GAAGG TGACCAAGTTCATGCTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAA；qSW.A1-1Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGA TTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAG。提取油菜A04染色体第18,176,833位碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则获得引物序列：qSW.A4-5F：TTTTCCTTTATCGTATTCTGTTGC；qSW.A4-5Ra：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATCACTTTGGGAGGATAATAGGA；qSW.A4-5Rg：GAAGGTGACCAAGTTC ATGCTTGATCACTTTAGGAGGATAATAGGG。
本发明的保护内容包括：检测上述任一一个分子标记的试剂在甘蓝型油菜千粒重选择育种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的两个位点qSW.A1-1和qSW.A4-5，且在多个环境中均可重复检测，平均可解释6.8％和10.3％的表型方差，平均加性效应为0.147克和0.138克，可有效应用于油菜粒重的遗传改良。
(2)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的PARMS标记，其检测方法操作简便、成本低廉且通量高，可对千粒重显著关联的基因组单倍型区域进行选择，提高选择效率和准确性。
附图说明
图1为油菜关联群体331份材料在10个环境中的千粒重表型分布示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明中使用的甘蓝型油菜基因组的版本号是Darmor-bzh(Version 4.1)https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/。
实施例1：
油菜千粒重显著关联SNP标记的获得
(1)收集331份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析(Li et al.,2020)。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得24,508个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。利用SPAGeDi软件计算331份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(3)将关联群体的331个株系分别于2012年(W12)、2013年(Z13、W13和N13)、2014年(Z14、W14和N14)、2015年(W15)、2016年(W16)和2017年(W17)在河南省农业科学院原阳基地、中国农业科学院油料作物研究所阳逻基地和江西红壤研究所进贤基地种植，合计10个环境。成熟期挑选关联群体各个株系长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各株系平均值。通过对关联群体各个环境中的千粒重数据进行分析，结果表明所有10个环境中的千粒重数据表现很大的变异幅度(4倍)而且均呈正态分布(图1)，可以直接用于后续的全基因组关联分析。
(4)结合关联群体的基因型数据和千粒重表型数据，利用TASSEL 5.0软件(Bradburyet al.2007)的四个模型(GLM-PCA，GLM-Q，MIM-PCA+K，MLM-Q+K)进行全基因组关联分析。通过对不同环境和模型中检测到的显著性关联SNP标记进行整合，在A01染色体获得与千粒重关联的位点qSW.A1-1，可以在W14、W15、W16和Z14四个环境中被重复检测到，其峰值SNP标记Bn-A01-p17494364位于第14,943,779碱基(A/T或C/G)，最高显著性水平P＝2.09E-07，平均可解释6.8％的表型方差，平均加性效应为0.147克，因此理论上两种纯合基因型之间的千粒重差异有0.294克。
另外，在A04染色体上获得与千粒重关联的位点qSW.A4-5，可在N14、W12、W14、W15、W16五个环境中被重复检测到，其峰值SNP标记Bn-A04-p18089854位于第18,176,833碱基(A/T或G/C)，最高显著性水平P＝1.77E-11，平均可解释10.3％的表型方差，平均加性效应为0.138克，因此理论上两种纯合基因型之间的千粒重差异为0.276克。
表一、两个粒重关联位点qSW.A1-1和qSW.A4-5的信息
Figure BDA0003430143280000051
实施例2：一种与千粒重显著关联PARMS标记的开发
实施例1中所获得的关联标记为来源于SNP芯片，只有用于分子杂交的探针序列信息。油菜SNP芯片一次可以检测数以万计的位点，但其操作比较繁琐而且需要用到特殊设备。另外，若用油菜SNP芯片对大量的育种中间材料进行检测则成本昂贵，因此需要将其转化为操作简单而且成本低廉的基于PCR扩增的检测方法，如PARMS(Penta-primerAmplifica tion Refractory Mutation System，五引物扩增受阻突变系统)标记。该标记系统包括一对荧光通用引物(FAM和HEX作为报告荧光)、一对SNP等位基因特异引物及一条反向共用引物，可快速简单地进行SNP等位基因型检测。
(1)针对与qSW.A1-1关联的峰值SNP标记Bn-A01-p17494364，提取油菜A01染色体第14,943,779位碱基上下游各100bp序列。按照PARMS引物设计原则获得引物序列为：
qSW.A1-1F：agagagattcgtgatttcaagataag
qSW.A1-1Ra：gaaggtgaccaagttcatgctctagttactttaatacattgcgaaataaa
qSW.A1-1Rg：gaaggtcggagtcaacggattctagttactttaatacattgcgaaataag
(2)针对与qSW.A4-5关联的峰值SNP标记Bn-A04-p18089854，提取油菜A04染色体第18,176,833个碱基上下游各100bp序列，按照PARMS引物设计原则获得引物序列为：qSW.A4-5F：ttttcctttatcgtattctgttgc
qSW.A4-5Ra：gaaggtcggagtcaacggattgatcactttgggaggataatagga
qSW.A4-5Rg：gaaggtgaccaagttcatgcttgatcactttaggaggataataggg
(3)以油菜关联群体的基因组DNA为模板，利用上述引物进行荧光定量PCR扩增，采用TecanF200扫描FAM、HEX和ROX信号并输出结果，最后转换成基因型。
实施例3：两个PARMS标记在油菜千粒重筛选中的应用
(1)在关联群体331份材料中，PARMS标记qSW.A1-1检测出基因型为AA的材料有215份，基因型为GG的为87份(表二)。两种基因型的千粒重在七个环境中达到显著性水平，GG和AA两种基因型的千粒重均值差异从0.25到0.33，平均0.29克。
表二、PARMS标记qSW.A1-1两种基因型在关联群体十环境千粒重的比较
基因型 N13 N14 W12 W13 W14 W15 W16 W17 Z13 Z14
AA(n＝215) 4.73 4.04 4.07 3.67 3.79 4.01 3.46 3.71 3.60 4.03
GG(n＝87) 4.79 4.28 4.35 3.96 4.08 4.31 3.79 3.79 3.86 4.18
GG-AA 0.07 0.25* 0.28** 0.29** 0.29** 0.31*** 0.33*** 0.09 0.26* 0.16
*，**和***分别代表显著性水平P＝0.05，0.01和0.001。
(2)在关联群体331份材料中，PARMS标记qSW.A4-5检测出基因型为AA的材料有52份，基因型为GG的材料有268份(表三)。两种基因型的千粒重在七个环境中达到显著性水平，GG和AA两种基因型的千粒重均值差异从0.22到0.35克，平均0.28克。
表三、PARMS标记qSW.A4-5两种基因型在关联群体十环境千粒重的比较
基因型 N13 N14 W12 W13 W14 W15 W16 W17 Z13 Z14
AA(n＝52) 4.69 3.86 3.91 3.58 3.60 3.85 3.33 3.65 3.52 3.98
GG-(n＝268) 4.78 4.16 4.23 3.80 3.95 4.16 3.59 3.76 3.75 4.11
GG-AA 0.09 0.30** 0.32** 0.22* 0.35*** 0.31** 0.26** 0.12 0.22* 0.13
*，**和***分别代表显著性水平P＝0.05，0.01和0.001。
(3)在关联群体331份材料中，PARMS标记qSW.A1-1和qSW.A4-5均为AA基因型的材料有37份，均为GG基因型的有71份(表四)。两种组合基因型的千粒重在七个环境中达到显著性水平，GG/GG和AA/AA两种基因型的千粒重均值差异从0.40到0.64克，平均0.54克。
表四、PARMS标记qSW.A1-1和qSW.A4-5联合对千粒重的筛选效果
qSW.A1-1/qSW.A4-5 N13 N14 W12 W13 W14 W15 W16 W17 Z13 Z14
AA/AA(n＝37) 4.68 3.77 3.81 3.49 3.51 3.74 3.25 3.63 3.54 3.90
GG/GG(n＝71) 4.88 4.31 4.37 4.00 4.13 4.37 3.79 3.83 3.94 4.19
GG/GG-AA/AA 0.20 0.54** 0.56** 0.51** 0.63*** 0.64*** 0.54** 0.20 0.40* 0.29
*，**和***分别代表显著性水平P＝0.05，0.01和0.001。
以上结果足以说明我们制备的PARMS标记qSW.A1-1和qSW.A4-5无论是单独还是联合使用都与油菜的千粒重是高度关联的，具有很好的选择效果。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜千粒重关联的PARMS分子标记及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagagattc gtgatttcaa gataag 26
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tctagttact ttaatacatt gcgaaataaa 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tctagttact ttaatacatt gcgaaataag 50
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttccttta tcgtattctg ttgc 24
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgatcacttt gggaggataa tagga 45
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc ttgatcactt taggaggata ataggg 46

Claims (2)

1.检测甘蓝型油菜A01染色体第14,943,779位碱基基因型的试剂在甘蓝型油菜千粒重育种中的应用，所述的试剂为引物，为：qSW.A1-1F：AGAGAGATTCGTGATTTCAAGATAAG；qSW.A1- 1Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAA；qSW.A1-1Rg：GAAGGTCGGA GTCAACGGATTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAG。
2.检测甘蓝型油菜A01染色体第14,943,779位碱基基因型和检测甘蓝型油菜A04染色体第18,176,833位碱基基因型的试剂甘蓝型油菜千粒重育种中的应用，所述的试剂为引物，为：qSW.A1-1F：AGAGAGATTCGTGATTTCAAGATAAG；qSW.A1-1Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAA；qSW.A1-1Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTAGTTACTTTAATACATTGCGAAATAAG；和qSW.A4-5F：TTTTCCTTTATCGTATTCTGTTGC；qSW.A4-5Ra：GAAGGTCGGAGTC AACGGATTGATCACTTTGGGAGGATAATAGGA；qSW.A4-5Rg：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATCACTTTAGGAGGATAATAGGG。
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