CN116555474B - 油菜千粒重关联的parms分子标记或标记组合的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一油菜千粒重关联的PARMS分子标记或标记组合的应用，申请人筛选到两个千粒重关联位点qSW.A9‑2和qSW.A9‑3的峰值SNP标记Bn‑A09‑p4509627和Bn‑A09‑p7329993分别位于油菜A09染色体的第4,419,828和5,542,361位碱基处，平均可解释9.2%和7.0%的表型方差，平均效应为0.21和0.39克。利用这两个SNP开发的PARMS标记对油菜关联群体进行检测，发现其操作简便且分型清晰，而且两种纯合基因型千粒重的差值分别为0.24和0.40克，两者联合则高达0.53克，有良好的选择效果。
Description
技术领域
本发明属于生物育种技术领域，具体涉及油菜千粒重关联的PARMS分子标记或标记组合的应用。
背景技术
在同一种植密度条件下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量直接决定于全株角果数、每角粒数和粒重三个构成因子。虽然油菜产量的三个构成因子之间呈现一定程度的负相关，但其系数往往不大，因此可以通过提高产量构成因子(如粒重)来增加产量。2005-2013年国家冬油菜登记品种产量特征数据显示，油菜产量从2005年的2490.99千克/公顷到2013年的2861.25千克/公顷，增长了14.9％；千粒重从3.46克增加为3.85克，增幅为11.2％，每角粒数从20.08粒到21.13粒，增幅为5.2％；而全株角果数则呈现显著减少趋势(从平均每株387.45角降到280.52角)，下降了27.6％(Hu et al.,2017)。因此，从育种实践上看，油菜单产的增加确实能通过提高粒重等构成因子来实现。目前，油菜品种的千粒重一般都低于4g，而油菜种质资源中千粒重的最大值可以超过8克(陈苇等，2011)，说明油菜粒重仍有很大提升空间。
随着现代生物技术的飞快发展，分子标记技术也在不断更新迭代，由最初的RFLP、RA PD/AFLP、SSR逐渐发展为目前的SNP标记。目前SNP检测方法主要分为两大类：一大类是以单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法；另一大类是以直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。这两类方法各有优缺点，目前已有将两者结合起来的检测方法如KASP(Lister et.,2013)和PARMS(Lu et al.,2020)等，不但操作简便、成本低廉而且能实现高通量的检测。
粒重是一个典型的由多基因控制的复杂数量性状，表型连续分布而且容易受环境条件的影响。粒重的遗传以加性效应为主，显性和上位性较弱，因而其杂种优势很弱，具体表现为杂种F1的粒重一般都介于双亲之间(李娜，2015)。数量遗传学和分子标记技术的结合，可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前，利用连锁作图(linkage ma pping)和关联作图(association mapping)的方法，在油菜种已定位到一百多个千粒重QTL(Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；Radoev et al.,2008；Shi etal.,2009；王峰等，2010；Basunanda et al.,2010；Fan et al.,2010；Zhang et al.,2011；赵卫国等，2017)，但在不同群体和环境中都起作用的QTL数目有限，难以满足实际的育种需求。
本发明利用油菜自然群体十个环境的千粒重数据进行全基因组关联分析，旨在找到对油菜千粒重具有改良效应的新的稳定位点，并据此开发高通量低成本的实用性分子标记用于辅助选择，为后续全基因组选择育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是在于提供了油菜A09染色体上和粒重显著关联的位点qSW.9-2的SNP分子标记Bn-A09-p4509627，该SNP为油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基。
本发明的另一个目的在于提供了与油菜千粒重关联的分子标记组合，该组合为分子标记Bn-A09-p4509627和Bn-A09-p7329993的组合，Bn-A09-p4509627为油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基，Bn-A09-p7329993为油菜DarmorV4.1参考基因组第5,542,361位碱基。
本发明还有一个目的是提供了针对上述分子标记或分子标记组合的PARMS标记引物。
本发明的最后一个目的在于提供了PARMS标记引物在油菜千粒重选择育种中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
与油菜千粒重相关的SNP位点的获得：
(1)提取油菜关联群体331份品系的总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析(Li et al.,2020)。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的缺失率(missing rate)、杂合率(heterozygous rate)、次要等位基因频率(minor allele frequency)。
(3)将关联群体331份品系分别在10个环境种植，成熟期挑选每个小区中长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各品系平均值。
(4)利用关联群体的高密度SNP基因型数据、10个环境的千粒重表型数据、群体结构和亲缘关系，利用TASSEL 5.0软件(Bradbury et al.,2007)进行全基因组关联分析。最终获得与粒重显著关联的位点qSW.A9-2和qSW.A9-3，其峰值SNP标记Bn-A09-p4509627和Bn-A09-p7329993位于油菜DarmorV4.1参考基因组A9染色体第4,419,828和5,542,361位碱基处，分别可以在六个和三个环境中被重复检测到。
(5)提取油菜A09染色体第4,419,828位碱基上下游各100bp的序列，按照PARMS引物设计原则获得引物序列：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC；qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA；qSW.A9-2Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG。
提取油菜A09染色体第5,542,361位碱基上下游各100bp的序列，按照PARMS引物设计原则获得引物序列：qSW.A9-3F：GGCATGTATTTTTATAGGACAACTC；qSW.A9-3Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGA；qSW.A9-3Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGG。
本发明的保护内容包括：
检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基的系统在油菜千粒重选择育种中的应用，所述的系统为试剂、试剂盒或仪器。
油菜千粒重选择育种的装置，其特征在于：所述的装置包括数据接收模块和数据处理模块，所述的数据接收模块被配置为接收待测油菜DarmorV4.1参考基因组中第4,419,828位碱基的基因型；所述的数据处理模块用于将来自于接受模块的基因型转换为待测油菜的判定结果。
油菜千粒重选择育种的计算机可读存储介质，其特征在于：所述计算机可读存储介质使计算机运行如下步骤：检测待测油菜DarmorV4.1参考基因组中第4,419,828位碱基的基因型，将所述基因型转换成判定待测油菜的判定结果。
以上所述的应用中，所述的试剂为检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基的引物。
以上所述应用中，所述的引物为：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC；qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA；qSW.A9-2Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG。
以上所述的应用中，所述的试剂盒为PARMS检测试剂盒。
以上所述的应用中，当待测油菜的基因型为AA时，判定为千粒重重量较低的植株，当待测油菜的基因型为GG时，判定为千粒重重量较高的植株。
本发明的保护范围还包括：
检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基和第5,542,361位碱基的系统在油菜千粒重选择育种中的应用，所述的系统为试剂、试剂盒或仪器。
油菜千粒重选择育种的装置，其特征在于：所述的装置包括数据接收模块和数据处理模块，所述的数据接收模块被配置为接收待测油菜DarmorV4.1参考基因组中第4,419,828位碱基和第5,542,361位碱基的基因型；所述的数据处理模块用于将来自于接受模块的基因型转换为待测油菜的判定结果。
油菜千粒重选择育种的计算机可读存储介质，其特征在于：所述计算机可读存储介质使计算机运行如下步骤：检测待测油菜DarmorV4.1参考基因组中第4,419,828位碱基和第5,542,361位碱基的基因型，将所述基因型转换成判定待测油菜的判定结果。
以上所述的应用中，所述的试剂为检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基的引物。
以上所述应用中，所述的引物为：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC、qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA和qSW.A9-2Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG；
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以上所述的应用中，所述的试剂盒为PARMS检测试剂盒。
以上所述的应用中，当待测油菜的第4,419,828位碱基的基因型为AA且第5,542,361位碱基的基因型为GG，判定为千粒重重量较低的植株；当待测油菜的第4,419,828位碱基的基因型为GG且第5,542,361位碱基的基因型为AA，判定为千粒重重量较高的植株。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的位点qSW.A9-2，且在多个环境中均可重复检测，平均可解释9.2％的表型方差，平均效应为0.21克，可有效应用于油菜粒重的遗传改良。
(2)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的位点qSW.A9-3，且在多个环境中均可重复检测，平均可解释7.0％的表型方差，平均效应为0.39克，可有效应用于油菜粒重的遗传改良。
(3)本发明获得了与油菜千粒重显著关联的PARMS标记，其检测方法操作简便、成本低廉且通量高，可对千粒重显著关联的基因组单倍型区域进行选择，提高选择效率和准确性。
附图说明
图1为油菜关联群体331份材料在10个环境中的千粒重表型频率分布示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明中使用的甘蓝型油菜基因组的版本号是Darmor-bzh(Version 4.1)https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/。
实施例1：
油菜千粒重显著关联SNP标记的获得
(1)采集油菜关联群体331份核心株系的叶片，用CTAB法提取总DNA，利用油菜60KSNP芯片对每个样本进行基因型分析(Li et al.,2020)。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minor allele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得24,508个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。利用Structure2.3软件对331份核心株系进行群体结构分析(Pritchard et al.,2000)，利用SPAGeDi软件计算331份核心株系间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(3)将关联群体的331个株系分别于2012年(W12)、2013年(Z13、W13和N13)、2014年(Z14、W14和N14)、2015年(W15)、2016年(W16)和2017年(W17)在河南省农业科学院原阳基地(Z)、中国农业科学院油料作物研究所阳逻基地(W)和江西省红壤研究所进贤基地(N)种植，合计10个环境。成熟期挑选每个小区中长势均匀的10个单株进行收获，按单株分别脱粒后将种子晒干进行千粒重的考察，计算各株系平均值。通过对关联群体各个环境中的千粒重数据进行分析，结果表明所有10个环境中的千粒重数据均呈正态分布而且表现很大的变异幅度(图1)，可以用于后续的全基因组关联分析。
(4)结合关联群体的基因型数据和千粒重表型数据，利用TASSEL 5.0软件(Bradburyet al.2007)的四个模型(GLM-PCA，GLM-Q，MIM-PCA+K，MLM-Q+K)进行全基因组关联分析。通过对不同环境和模型中检测到的显著性关联SNP标记进行整合，在A09染色体获得与千粒重关联的位点qSW.A9-2和qSW.A9-3，分别可以在六和三个环境中被重复检测到，其峰值SNP标记Bn-A09-p4509627和Bn-A09-p7329993位于第4,419,828和5,542,361碱基，最高显著性水平P＝6.44E-09和7.67E-06，平均可解释9.2％和7.0％的表型方差，平均效应为0.21和0.39克。
表一、粒重关联位点qSW.A9-2和qSW.A9-3的信息
实施例2：一种与千粒重显著关联PARMS标记的开发
实施例1中所获得的关联标记为来源于SNP芯片，只有用于分子杂交的探针序列信息。油菜SNP芯片一次可以检测数以万计的位点，但其操作比较繁琐而且需要用到特殊设备。另外，若用油菜SNP芯片对大量的育种中间材料进行检测则成本昂贵，因此需要将其转化为操作简单而且成本低廉的基于PCR扩增的检测方法，如PARMS(Penta-primerAmplifica tion Refractory Mutation System，五引物扩增受阻突变系统)标记。该标记系统包括一对荧光通用引物(FAM和HEX作为报告荧光)、一对SNP等位基因特异引物及一条反向共用引物，可快速简单地进行SNP等位基因型检测。
(1)针对与qSW.A9-2关联的峰值SNP标记Bn-A09-p4509627，提取油菜A09染色体第4,419,828位碱基上下游各60bp序列。按照PARMS引物设计原则获得引物序列为：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC；qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA；qSW.A9-2Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG。
针对与qSW.A9-3关联的峰值SNP标记Bn-A09-p7329993，提取油菜A09染色体第5,542,361位碱基上下游各60bp序列。按照PARMS引物设计原则获得引物序列为：qSW.A9-3F：GGCATGTATTTTTATAGGACAACTC；qSW.A9-3Ra:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGA；qSW.A9-3Rg：GAAGGTCGGAGTCAACG GATTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGG。
(2)以油菜关联群体的基因组DNA为模板，利用上述引物进行荧光定量PCR扩增，采用TecanF200扫描FAM、HEX和ROX信号并输出结果，最后转换成基因型。
实施例3：PARMS标记在油菜千粒重筛选中的应用
在331份关联群体(Li et al.,2020)中，以实施例2提供的PARMS标记qSW.A9-2检测出基因型为AA的材料有60份，基因型为GG的为236份(表二)。两种基因型的千粒重差异在五个环境中达到显著性水平，GG和AA两种基因型的千粒重差值从0.17到0.37，平均0.24克。
表二、PARMS标记qSW.A9-2两种基因型在关联群体十环境千粒重的比较
| 基因型 | N13 | N14 | W12 | W13 | W14 | W15 | W16 | W17 | Z13 | Z14 |
| AA(n＝60) | 4.46 | 3.96 | 4.06 | 3.66 | 3.73 | 3.86 | 3.43 | 3.62 | 3.55 | 3.91 |
| GG(n＝236) | 4.83 | 4.11 | 4.15 | 3.77 | 3.90 | 4.15 | 3.55 | 3.73 | 3.73 | 4.09 |
| GG-AA | 0.37** | 0.14 | 0.09 | 0.11 | 0.17* | 0.29** | 0.12 | 0.11 | 0.18* | 0.18* |
*和**和*分别代表显著性水平P＝0.05和0.01。
在331份关联群体中，以实施例2提供PARMS标记qSW.A9-3检测出基因型为AA的材料有51份，基因型为GG的为225份(表三)。两种基因型的千粒重差异在九个环境中达到显著性水平，AA和GG两种基因型的千粒重差值从0.20到0.55，平均0.40克。
表三、PARMS标记qSW.A9-3两种基因型在关联群体十环境千粒重的比较
| 基因型 | N13 | N14 | W12 | W13 | W14 | W15 | W16 | W17 | Z13 | Z14 |
| AA(n＝51) | 4.91 | 4.36 | 4.55 | 4.14 | 4.34 | 4.57 | 3.98 | 4.00 | 4.01 | 4.24 |
| GG(n＝225) | 4.75 | 4.08 | 4.12 | 3.69 | 3.82 | 4.02 | 3.49 | 3.70 | 3.64 | 4.04 |
| AA-GG | 0.16 | 0.28** | 0.43*** | 0.44*** | 0.52*** | 0.55*** | 0.49*** | 0.30** | 0.37** | 0.20* |
*，**和***分别代表显著性水平P＝0.05，0.01和0.001。
在331份关联群体中，以实施例2提供PARMS标记qSW.A9-2和qSW.A9-3的引物进行联合检测，qSW.A9-2中基因型为AA且qSW.A9-3中基因型为GG的材料有47份，qSW.A9-2中基因型为GG且qSW.A9-3中基因型为AA的材料有39份，两种基因型的千粒重差异在所有10个环境中都达到显著性水平。其中，6个环境中的差异达到极显著水平，差值从0.41到0.74，平均0.53克。
表四、PARMS标记qSW.A9-2和qSW.A9-3两种基因型在关联群体十环境千粒重的比较
**和***分别代表显著性水平P＝0.01和0.001。
以上结果足以说明我们制备的PARMS标记qSW.A9-2和qSW.A9-3与油菜的千粒重是高度关联的，无论是单独还是联合使用均具有很好的选择效果。
Claims (2)
1.检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基的引物在油菜千粒重选择育种中的应用，所述的引物为：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC；qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAA GTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA；qSW.A9-2Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG。
2.检测油菜DarmorV4.1参考基因组第4,419,828位碱基和第5,542,361位碱基的引物在油菜千粒重选择育种中的应用，所述的引物为：qSW.A9-2F：GAAAGAACCAATCTGCGAGC、qSW.A9-2Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTA和qSW.A9-2Rg：GAAGGT CGGAGTCAACGGATTTGTTTTCTTGCTAAAAGATTATCTG；
qSW.A9-3F：GGCATGTATTTTTATAGGACAACTC、qSW.A9-3Ra：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGA和qSW.A9-3Rg：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATTCTCATGAAATAAATAGTATTATCGG。
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