CN109022432B - 鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组。本发明提供了KASP5D16引物组，由序列1所示引物5D16A、序列2所示引物5D16B和序列3所示引物5D16C组成。本发明还保护鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦。本发明还保护鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法：(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物组进行KASP；(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；(3)CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦。本发明提供的方法可以用于筛选分蘖角度性状不同的小麦，从而用于紧凑型植株育种。

Description

鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组
技术领域
本发明涉及一种鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组。
背景技术
小麦是世界三大粮食作物之一，在全球人口不断增加、耕地面积持续减少、自然灾害频繁发生的背景下，培育高产稳产小麦品种对于解决全球粮食安全问题具有重大意义。
株型通过影响群体光合效率和植株抗逆性，最终影响产量和适应性，植株分蘖角度是其重要评价指标。分蘖角度遗传位点的挖掘和利用对于培育小麦高产稳产品种非常重要。
KASP标记已广泛应用于检测小麦、水稻和玉米等作物的SNP位点，无需电泳，可实现高通量基因分型。进行全基因组关联分析和QTL定位，将关联SNP转化为KASP标记，可直接应用于分子标记辅助选择育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组。
本发明提供了一种特异引物组，命名为KASP5D16引物组，由引物5D16A、引物5D16B和引物5D16C组成；
引物5D16A为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
引物5D16B为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物5D16C为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护KASP5D16引物组的应用，为如下(d1)至(d10)中的至少一种：
(d1)鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型；
(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的株型性状；
(d3)鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状；
(d4)筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d5)筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d6)制备用于鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型的产品；
(d7)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的株型性状的产品；
(d8)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状的产品；
(d9)制备用于筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(d10)制备用于筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
所述KASP5D16位点为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
本发明还保护一种试剂盒，包括KASP5D16引物组。
所述试剂盒还包括特异引物组。所述特异探针组由荧光探针A、淬灭探针A、荧光探针B和淬灭探针B；荧光探针A如序列表的序列5所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针B如序列表的序列6所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针A和荧光探针B中的荧光基团不同；淬灭探针A如序列表的序列7所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针B如序列表的序列8所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针A具体连接FAM荧光基团。荧光探针B具体连接HEX荧光基团。淬灭探针A具体连接连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B具体连接淬灭基团BHQ。
所述试剂盒还包括KASP 2×Master Mix。
本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(d1)至(d5)中的至少一种：
(d1)鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型；
(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的株型性状；
(d3)鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状；
(d4)筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d5)筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
所述KASP5D16位点为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
本发明还保护一种鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦。
本发明还保护一种小麦育种方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型，选择CC基因型的小麦进行育种。
所述育种的目的为选育分蘖角度小的小麦。
所述育种的目的为选育株型紧凑的小麦。
本发明还保护一种鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP5D16引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦。
本发明还保护一种小麦育种方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用KASP5D16引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)选择CC基因型的小麦进行育种。
所述育种的目的为选育分蘖角度小的小麦。
所述育种的目的为选育株型紧凑的小麦。
以上任一所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用酶标仪的FAM VIC ROM光束扫描，用Kluster Caller分型软件对扫描数据进行分型检测，显示为蓝色的样本的基因型为CC纯合型，显示为红色的样本的基因型为GG纯合型。
以上任一所述方法中，确定待测小麦基于特异SNP的基因型的方法为：采用酶标仪的FAM VIC ROM光束扫描，用Kluster Caller分型软件对扫描数据进行分型检测，显示为蓝色的样本的基因型为CC纯合型，显示为红色的样本的基因型为GG纯合型，显示为绿色的样本的基因型为CG杂合型。
以上任一所述方法中，KASP的反应体系中，引物5D16A的浓度为12μM/μl、引物5D16B的浓度为12μM/μl、引物5D16C的浓度为30μM/μl。
以上任一所述方法中，KASP的反应程序：94℃15min；94℃20s、63-55℃(每个循环降1℃)1min，10个循环；94℃20s、55℃60s，32个循环。
以上任一所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。所述特异SNP为C/G多态。
本发明还保护一种特异DNA分子，如序列表的序列4所示。
本发明还保护所述特异DNA分子在鉴定或辅助鉴定小麦分蘖角度性状中的应用。所述应用中，所述特异DNA分子作为检测靶标。
以上任一所述分蘖角度为植株开花后第15天的分蘖角度。
本发明发现了一个新的小麦分蘖角度QTL及其连锁分子标记，该QTL被命名为QPA.caas-5DL，位于5DL染色体上，在被检测的八个环境条件下，可解释表型变异的16.7-30.0％。QPA.caas-5DL紧密连锁的的KASP标记为Kasp5D16。本发明提供的方法可以用于筛选分蘖角度性状不同的小麦，从而用于紧凑型植株育种。
附图说明
图1为128个家系5D染色体遗传连锁图。
图2为群体中定位的QPA.caas-5DL曲线图。
图3为采用KASP5D16引物组进行KASP检测RIL群体的部分基因分型结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。对于小麦来说，直立型植株分蘖角度最小、植株株型最紧凑，分蘖角度越大、植株株型越松散。
实施例1、中麦895中一个新分蘖角度QTL的发现及其KASP标记的获得
一、构建重组近交系(RIL)群体
中麦895分别于2012和2013年通过国家和陕西省审定，适宜在黄淮冬麦区南片的河南中北部、安徽北部、江苏北部、陕西关中地区高中水肥地块早中茬种植。中麦895和中麦871为姊妹系，基因组背景相似。与中麦871相比，中麦895植株分蘖角度小，株型紧凑。
利用中麦895和中麦871构建包括266个家系的重组近交系群体(RIL群体)。
二、表型的获得
RIL群体于2015-2016年度种植于河南安阳、商丘、周口和陕西咸阳试验点，2016-2017年度种植于河南安阳和周口试验点，2017-2018年度种植于河南安阳和商丘试验点，进行分蘖角度鉴定。
三、构建遗传连锁图
依据田间调查数据选用128个家系，提取幼叶基因组DNA，用NanoDrop2000c分光光度计测定DNA浓度，并将DNA样品调至标准浓度50ng/μl，然后用0.8％的琼脂糖凝胶检测DNA质量，质量合格DNA进行利用中国农业科学院作物科学研究所和Affymetrix Axiom公司合作完成的660K SNP芯片进行SNP分析。
660K SNP芯片共包含630517个标记，亲本间有差异的标记为89637个。去除亲本间杂合、缺失率大于10％的标记后剩余37388个。利用IciMapping 4.1 bin功能去除冗余标记后剩余8296个。将这8296个标记数据导入在线工具MSTMap，选择SingleGL参数，构建一个大的连锁群；然后根据标记间的遗传距离和染色体位置信息分群，大于50个标记的连锁群有34个，共包含6593个标记。其中5D染色体被分为两段。采用IciMapping 4.1 ICIM-ADD方法进行QTL分析，LOD值选取3.0，在5DL染色体定位到1个稳定的QTL，定位于5D-2连锁群。128个家系5D染色体遗传连锁图见图1。
四、QTL分析
利用QTL区间内的SNP标记，设计4个引物组(KASP5D9引物组、KASP5D13引物组、KASP5D16引物组和KASP5D17引物组)。提取266个家系中各单株的基因组DNA，通过KASP进行分型。用IciMapping4.1和JoinMap4.0对其数据进行处理，获得一个在多环境条件下稳定存在的主效QTL，位于5DL染色体，可解释表型变异的16.7-30.0％，暂定名为QPA.caas-5DL，4个标记与QPA.caas-5DL连锁，其中紧密连锁的标记为KASP5D16。群体中定位的QPA.caas-5DL曲线图见图2。
KASP5D16引物组如下：
5D16A：
Figure BDA0001788139050000051
5D16B：
Figure BDA0001788139050000052
5D16C：TTAGAACTCTTTTTAGGGTAGGAGC。
KASP5D9引物组如下：
5D9A：
Figure BDA0001788139050000053
5D9B：
Figure BDA0001788139050000054
5D9C：CACTAGGTTCCGGTTGAGGG。
KASP5D13引物组如下：
5D13A：
Figure BDA0001788139050000055
5D13B：
Figure BDA0001788139050000056
5D13C：ACGATGCCAACGTAGGTCAA。
KASP5D17引物组如下：
5D17A：
Figure BDA0001788139050000057
5D17B：
Figure BDA0001788139050000058
5D17C：TGGTTGAGTTGCTCTTATTCACT。
复合区间作图法检测中麦871×中麦895的RIL群体的QPA.caas-5DL见表1。
表1
Figure BDA0001788139050000059
Figure BDA0001788139050000061
AY2016代表2015-2016年度种植于安阳。SQ2016代表2015-2016年度种植于商丘。ZK2016代表2015-2016年度种植于周口。XY2016代表2015-2016年度种植于咸阳。AY2017代表2016-2017年度种植于安阳。ZK2017代表2016-2017年度种植于周口。AY2018代表2017-2018年度种植于安阳。SQ2018代表2017-2018年度种植于商丘。
KASP5D16引物组用于鉴定特异SNP。特异SNP为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸，为C/G多态。经测序验证，基于特异SNP，中麦895的基因型为CC纯合型，中麦871的基因型为GG纯合型。采用KASP5D16引物组进行KASP检测RIL群体的部分基因分型结果见图3。
实施例2、KASP5D16引物组的应用
待测小麦为88个现有小麦品种，具体见表2。
一、表型检测
将待测小麦种植于北京，每个材料单行、1m行长，常规管理，于植株开花后第15天进行分蘖角度分级。以周麦16为参照，周麦16的分蘖角度等级为4，如果某品种的株型比周麦16还松散、其分蘖角度等级为5，如果某品种的株型比周麦16稍紧凑、其分蘖角度等级为3，如果某品种的株型比周麦16显著紧凑、其分蘖角度等级为2，如果某品种的株型为直立型、其分蘖角度等级为1。
各个待测小麦的分蘖角度等级见表2。
二、基因型检测
1、提取待测小麦的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用KASP5D16引物组进行KASP。
KASP5D16引物组由引物5D16A、引物5D16B和引物5D16C组成。
5D16A(序列1)：
Figure BDA0001788139050000062
5D16B(序列2)：
Figure BDA0001788139050000063
5D16C(序列3)：5’-TTAGAACTCTTTTTAGGGTAGGAGC-3’。
反应体系(5μl)：引物5D16A、引物5D16B、引物5D16C、模板DNA(DNA含量约为110ng)、2.5μL KASP 2×Master Mix，余量为水。反应体系中，引物5D16A的浓度为12μM/μl、引物5D16B的浓度为12μM/μl、引物5D16C的浓度为30μM/μl。
KASP 2×Master Mix为LGC公司产品(货号KBS-1016-002)。KASP 2×Master Mix中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP、Mg2+等。荧光探针A的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接FAM荧光基团。荧光探针B的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接HEX荧光基团。淬灭探针A的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。淬灭探针B的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。
反应程序：94℃15min；94℃20s、63-55℃(每个循环降1℃)1min，10个循环；94℃20s、55℃60s，32个循环。
3、完成步骤2后，采用酶标仪(BiOTek,SYNERGY/H1microplate reader)的FAM VICROM光束扫描，用Kluster Caller分型软件对扫描数据进行分型检测。
显示为蓝色的样本的基因型为CC纯合型，显示为红色的样本的基因型为GG纯合型，显示为绿色的样本的基因型为CG杂合型。
各个待测小麦的基因型见表2。
将各个待测小麦的目标区段进行测序，与表2的结果均一致。
表2
Figure BDA0001788139050000071
Figure BDA0001788139050000081
Figure BDA0001788139050000091
88个小麦品种中：59个品种为GG基因型，分蘖角度等级平均值为4；29个品种为CC基因型，分蘖角度等级平均值为3。统计测验显示，QPA.caas-5DL的基因效应达到显著差异(P<0.05)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 鉴定小麦分蘖角度性状的方法及其专用引物组
<130> GNCYX181702
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tccaaagtga ccaaataaca gcaac 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tccaaagtga ccaaataaca gcaag 45
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ttagaactct ttttagggta ggagc 25
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)
<223> s =c or g
<400> 4
ccaaagtgac caaataacag caastgctcc taccctaaaa agagttctaa 50
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
agcatgaact tggtcacctt c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aatccgttga ctccgacctt c 21

Claims (10)

1.KASP5D16引物组，由引物5D16A、引物5D16B和引物5D16C组成；
引物5D16A为序列表的序列1所示的单链DNA分子；
引物5D16B为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
引物5D16C为序列表的序列3所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述KASP5D16引物组的应用，为如下(d1)至(d8)中的至少一种：
(d1)鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型；
(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状；
(d3)筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d4)筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d5)制备用于鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型的产品；
(d6)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状的产品；
(d7)制备用于筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(d8)制备用于筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
所述KASP5D16位点为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述KASP5D16引物组。
4.权利要求3所述试剂盒的应用，为如下(d1)至(d4)中的至少一种：
(d1)鉴定小麦基于KASP5D16位点的基因型；
(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的分蘖角度性状；
(d3)筛选或选育具有大分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
(d4)筛选或选育具有小分蘖角度性状的小麦单株或株系或品系或品种；
所述KASP5D16位点为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
5.一种鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦；所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
6.一种小麦育种方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型，选择CC基因型的小麦进行育种；所述特异SNP为小麦基因组中序列表的序列4所示DNA分子的第24位核苷酸。
7.一种鉴定待测小麦的分蘖角度性状的方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行判断：CC基因型小麦的分蘖角度小于GG基因型小麦。
8.一种小麦育种方法，包括如下步骤：
(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行KASP；
(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异SNP的基因型；
(3)选择CC基因型的小麦进行育种。
9.特异DNA分子，如序列表的序列4所示。
10.权利要求9所述特异DNA分子在鉴定或辅助鉴定小麦分蘖角度性状中的应用。
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