CN117265176B - 与大豆籽粒油分含量相关的snp位点、分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP位点、分子标记及应用。该SNP位点位于18号染色体的57242007位，多态性为T/C。本发明还提供一种含有该SNP位点的分子标记、分子标记的扩增引物、包含扩增引物的试剂盒及其在鉴定大豆油分含量中的应用。本发明发掘的与大豆油分含量显著关联的SNP标记，可应用于大豆油分含量改良的分子标记辅助选择，及油分含量相关基因的精细定位和图位克隆中，从而加速大豆优异性状的改良进程。
Description
技术领域
本发明属于大豆分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP位点、分子标记及应用。
背景技术
大豆是世界上最常见的豆科植物，不仅属于粮食作物，更是重要的经济作物。因其籽粒富含优质油分，对人类消费和工业应用具有很大贡献。从遗传角度来看，大豆油分含量是由多基因控制的复杂数量性状，使用常规育种手段提高大豆油分含量效率较低。随着分子生物学技术的飞速发展，基因精细调控技术能够实现优异等位基因的聚合和高效利用，是选育突破性大品种的关键技术之一，也是未来提升大豆品种育种能力的必要手段。优异等位基因积累及其对应的分子标记的开发，是实现基因的精细调控与聚合的先决条件。
目前，选育高油大豆新品种已成为育种者和生产者的关键问题。因此，发掘大豆油分含量优异等位基因的分子标记，不但能够为高油大豆的优异等位基因的聚合提供技术储备，也可为基因精细调控改良大豆品质提供明确指导。
近年，伴随测序技术的发展，研究者对大豆基因组有了较全面的认识。全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）是当前研究生物基因组的先进方法，通过对群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记（如SNP或CNV等）分型，从而寻找与生物表型相关基因型的研究方法。现有技术通过全基因组测序技术在570份野生大豆中检测到近30000个单核苷酸多态性（SNP），并对这些野生大豆种子测定了蛋白质含量、籽粒油脂含量和5种脂肪酸组分，结果表明有29个SNP与野生大豆种子的7种组成性状显著相关。目前，关联分析已广泛应用于植物研究，如大豆籽粒蛋白质含量、水稻氨基酸组分、黑小麦铝毒抗性等。近年利用GWAS开发目标性状功能标记，已成为分子生物学研究的热点之一。分子标记辅助选择可显著加快大豆高油品种遗传改良进程。
目前国内外已有影响大豆籽粒油分含量相关位点的报道，但是其中很多都采用相对较落后的SSR、AFLP、RFLP和RAPD等低密度分子标记构建遗传图谱，位点不够精确；其次当前功能位点涉及到的分子标记多数来源于重组自交系或单一父母本构建的遗传群体，可以在不同环境或不同遗传背景中被重复检测到的QTL较少。这些标记应用到杂交品种和地方品种等自然群体时，往往不能够作为分子标记辅助育种使用，也无法解释位点的遗传贡献率。
因此，有必要寻找一种标记能够更精准定位区间及广泛应用于不同栽培大豆群体的杂交亲本筛选籽粒油分含量相关的SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸的多态性）分子标记，进而应用到大豆品质遗传改良中。
发明内容
鉴于以上技术问题，本发明提供一种与大豆油分含量显著关联的精确标记基因位置的SNP位点。该SNP位点位于大豆18号染色体的57242007位(参考基因组为G. maxWm82.a2.v1)，该SNP位点属于共显性的标记，可靠且使用方便，这为大豆高产及品质改良育种工作提供了极大的便利。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种与大豆籽粒油分含量相关的SNP位点，所述SNP位点位于18号染色体的57242007位，多态性为T/C。
本发明第二方面，提供一种含有所述SNP位点的分子标记。
本发明第三方面，提供一种扩增所述分子标记的引物对，所述引物对包括正向引物及反向引物，所述正向引物为：5’- GATTGCCTGCTCTCTCTGATG -3’，所述反向引物为：5’-ACCTGCAGCAGAAAAAGGAA -3’。
本发明第四方面，提供一种试剂盒，其包括所述引物对。
本发明第五方面，提供一种所述SNP位点、所述分子标记、所述引物对或所述试剂盒在鉴定大豆油分含量高低中的用途。
优选地，鉴定大豆油分含量高低是按照以下步骤进行：
提取待测材料基因组DNA；
以所述大豆基因组DNA为模版，利用所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行测序分析，根据所述测序分析的结果判断大豆油分含量的高低。
优选地，PCR扩增体系为：总体积为20μL，包括10~50ng基因组模板DNA 3μL，10μLQuick Taq HS DyeMix，10 pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
优选地，PCR扩增条件为：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
优选地，当扩增产物自5’端第105位为T，判定为高油分含量大豆品种；当扩增产物自5’端第105位为C，判定为低油分含量大豆品种。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的18号染色体的57242±50kb的区间都是调控大豆油分含量的理想标记区间，其中57242007位SNP的油分含量遗传贡献率为 13.09~16.22%，加性效应为0.86~0.87%。2020年有75.45 %在该位点为T的品系的油分含量高于在该位点为C的品系中油分含量，2022年有73.65%在该位点为T的品系的油分含量高于在该位点为C的品系中油分含量，精确度可达73.65%，大大减少了选择成本，提高了品质改良的效率。
附图说明
图1为基于SNP并通过admixture软件得到的关联群体的群体结构图；
图2为334份关联群体2年(E1:2020年，E2：2022年) 油分含量(Oil)，横坐标表示大豆籽粒油分含量，纵坐标表示样品个体数；
图3为334份自然群体2年(E1:2020年，E2：2022年) 大豆油分含量的MLM关联分析结果曼哈顿图；
图4为334份自然群体2年(E1:2020年，E2：2022年)大豆油分含量的分子标记对应的大豆油分含量差异Box图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中收集测定我国40°N以北的大豆种质资源3000份，均由吉林省农业科学院大豆研究所栽培大豆种质资源研究团队组收集、评价，并保存于吉林省农业科学院种质资源库。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
大豆种子油分含量关联群体的构建及性状测定
使用大豆种质资源库内3000份种质资源，其来源地涵盖我国高纬度大豆主产区的大部分，包括黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古、新疆等。田间种植3000份资源，待种子完全成熟后，收获种子，每个品种随机选取20粒有代表性的种子进行测量。3000份资源的油分含量在群体内符合正态分布，遗传多样指数为1.95。从中抽取334份资源，油分含量遗传多样指数仍为1.95，将334资源作为关联群体。其操作步骤如下：
根据群体油分含量平均值（X）和标准差（δ）分为10类群，1类<X-2δ，10类≥X+2δ，中间每类相差0.5δ。各性状的遗传多样性采用Shannon's信息指数（H'）进行评价，H'=-ΣPilnPi，Pi表示第i种变异出现的频率，通过计算3000份资源油分含量的遗传多样性为1.95。
在每个类群随机抽取33~34份资源，共抽取334份资源，计算遗传多样指数H'，当等于1.95时，即确定这334资源为关联群体，该群体的油分含量呈正态分布，参见图1。
实施例2
大豆油分含量全基因组关联分析
（1）用CTAB法提取关联群体的334份资源单株叶片DNA，用Thermo nanodrop 2000检测DNA浓度并用1%琼脂糖电泳检测DNA纯度及完整性。
（2）利用安诺优达基因有限公司的全基因组重测序技术对334份资源进行群基因组测序，具体操作如下：
酶切方案：利用酶切预测软件对已公布大豆参考基因组进行酶切预测，选择内切酶 RsaI 和 HaeIII对检测合格的各样品基因组进行酶切，选择基因组片段范围在 364-414bp的SLAF片段。
测序流程：对得到的SLAF片段用Klenow Fragment(3′→ 5′exo–)(NEB) 和 dATP在 37℃下进行 3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR 扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用 IlluminaHiSeqTM 进行测序。为评估建库实验的准确性，选用大豆（‘Williams 82’: G. max Wm82.a2.v1）作为对照进行相同的处理参与建库和测序。
其中，PCR 扩增引物为：
F：5’- AATGATACGGCGACCACCGA -3’ ，如SEQ ID NO:5所示；
R：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’ ，如SEQ ID NO:6所示。
根据测序 Reads 在参考基因组上的定位结果，GATK 进行局部重比对、GATK 变异检测，samtools 变异检测，取 GATK 和 samtools 两种方法得到的交集变异位点等步骤，以保证检测得到的 SNP 的准确性。以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，共得到3,306,713个群体SNP。
（3）系统发育树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于SNP，通过MEGA5软件并结合neighbor-joining算法，构建样品的群体进化树。
（4）群体遗传结构分析能够提供个体的血统来源及其组成信息，是一种重要的遗传关系分析工具。基于SNP，通过admixture软件，分析样品的群体结构，分别假设样品的分群数（K值）为1~12，进行聚类。并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为8。
（5）基于SNP，通过TASSEL5软件，进行主成分分析，得到样品的主成分聚类情况。通过PCA分析，能够得知哪些样品相对比较接近，哪些样品相对比较疏远，可以辅助进化分析。
（6）使用plink软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(relative kinship)进行估计。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值，因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时，则直接定义为0。
（7）检测 334份关联群体2年(E1:2020年，E2：2022年) 的蛋白质含量。横坐标表示大豆籽粒油分含量，纵坐标表示样品个体数。
图2表明，大豆种子油分含量呈正态分布，属于数量性状。
基于关联群体SNP分子标记数据、遗传结构数据、Kinship矩阵数据以及油分含量数据，利用GAPIT数据包的混合线性模型进行全基因组关联分析。X为基因型，Y为表型，最终每个SNP位点都能得到一个关联结果，如图3所示。图3中纵坐标为p-value的负对数(−log10(p))，横坐标为染色体，一个点代表一个SNP位点；虚线为1/SNP数目的负对数，高于虚线的点，表明对应的SNP标记与油分含量显著相关，其中18号染色体红线上的最高点对应的是57242007位SNP。以−log10(p)≥6.58为筛选标准，在18号染色体的57242007位得到与油分含量显著关联的SNP标记，多态性为T/C，详细信息如表1所示。
表1 大豆籽粒油分含量显著关联SNP信息
实施例3
大豆油分含量显著关联SNP标记的应用
与大豆油分含量紧密连锁的SNP标记为18号染色体的57242007位，多态性为T/C，命名为qOil18-1，其是以待鉴定材料的基因组 DNA 作为模板，以qOil18-1引物进行PCR扩增所得的片段.
qOil18-1的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示：
其中，SEQ ID NO. 1：
TTCCTTTTTC TGCTGCAGGT CTGCCTATAA TTGCAAAAAG AATCTCAGTT ATACAGTATAACAAATAAAA TGATTATATT GAAGTCTCGA GTTTTCTAGT CAAA
GAAAA AAACACCTTG ACAGATTTGT TATTTGTCAA TATTGTTATA CATGAATGACAGTTTCAAGT ACAGAATGTT GGGATTTACC AGTTTTACCT CTAACTCAGA GATTGCCTGC TCTCTCTSEQID NO. 2：TTCCTTTTTC TGCTGCAGGT CTGCCTATAA TTGCAAAAAG AATCTCAGTT ATACAGTATAACAAATAAAA TGATTATATT GAAGTCTCGA GTTTTCTAGT CAAA
GAAAA AAACACCTTG ACAGATTTGT TATTTGTCAA TATTGTTATA CATGAATGACAGTTTCAAGT ACAGAATGTT GGGATTTACC AGTTTTACCT CTAACTCAGA GATTGCCTGC TCTCTCT
扩增引物为：
qOil18-1-F：5’- GATTGCCTGCTCTCTCTGATG -3’，如SEQ ID NO. 3所示；
qOil18-1-R：5’- ACCTGCAGCAGAAAAAGGAA -3’，如SEQ ID NO. 4所示。
利用上述SNP分子标记辅助判断品种后代油分含量的具体步骤如下：
1、利用CTAB法提取待鉴定材料基因组DNA。
1) 取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。
2) 加入0.6mL预热的CTAB提取液，颠倒混匀几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。
3) 加入0.6mL体积比为 24：1的氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀5~10次，10000rpm离心15min。
4) 取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用体积比为24:1的氯仿：异戊醇溶液重新抽提一次，然后加50μL浓度为10mg/mL RNase，室温下放置 30min。
5) 加等体积-20℃预冷的异丙醇，于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。
6) 用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，得到基因组模板DNA，将基因组模板DNA放入4℃冰箱保存备用。
7) 用0.8％的琼脂糖检测 DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。
2、利用SNP标记引物进行PCR扩增，得到扩增产物。
PCR扩增体系：总体积为20μL，包括10~50ng基因组模板DNA 3μL，10μL Quick TaqHS DyeMix，10 pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
PCR扩增条件：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min ；循环30次；72℃终延伸10min。
3、根据序列比对结果判断种子油分含量
将扩增产物进行测序分析，扩增产物自5’端第105位为T的品系亚群油分含量均值显著高于该位点为C的品系亚群均值。其中，2020年和2022年在该位点为C的品系中油分含量分别为20.63%和20.30%，且2020年有75.45 %在该位点为T的品系的油分含量高于在该位点为C的品系中油分含量，2022年有73.65%在该位点为T的品系的油分含量高于在该位点为C的品系中油分含量，精确度可达73.65%，见图4。这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。
本发明还提供一种SNP位点的检测试剂盒，该试剂盒包括上述所述的如SEQ IDNO. 3及SEQ ID NO. 4所示的引物。
此外，该SNP位点的检测试剂盒还包括Quick Taq HS DyeMix及水。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.一种SNP分子标记在鉴定大豆油分含量高低中的用途，其特征在于，鉴定大豆油分含量高低是按照以下步骤进行：
提取待测材料基因组DNA；
以所述大豆基因组DNA为模版，利用所述SNP分子标记的扩增引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行测序分析，根据所述测序分析的结果判断大豆油分含量的高低；当扩增产物自5’端第105位为T，判定为高油分含量大豆品种；当扩增产物自5’端第105位为C，判定为低油分含量大豆品种；
其中，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
所述SNP分子标记的扩增引物对为：
正向引物：5’-GATTGCCTGCTCTCTCTGATG-3’，反向引物为：5’-ACCTGCAGCAGAAAAAGGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，PCR扩增体系为：总体积为20μL，包括10～50ng基因组模板DNA 3μL，10μL Quick Taq HSDyeMix，10pmol的引物各2μL和ddH2O 3μL。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，PCR扩增条件为：94℃预变性30s，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min；循环30次；72℃终延伸10min。
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