CN116024376A - 玉米根毛相关的InDel标记鉴定引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了玉米根毛相关的InDel标记鉴定引物及其应用。所述的引物序列为：F：5’‑CAATTTCCACCGCTCATTCT‑3’；R：5’‑TGGTTGTGGAAACACACTCC‑3’。本发明人发现，在玉米5号染色体980401bp位置的基因型，其与玉米自交系根毛长度高度相关，其中InDel基因型为单一带型A型时根毛长度为低，InDel基因型为杂合带型H型时根毛长度为高，该位置的基因型可以作为检测玉米根毛长度高低的InDel标记。利用该InDel标记，可用于培育根毛增强和抗旱玉米新品种提供理论依据和科学指导。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米根毛相关的InDel标记鉴定引物及其应用。
背景技术
玉米是我国最重要的粮食、饲料和工业原料作物之一。玉米根系对保证玉米正常生长极为重要，发达的根系是其产量形成的基础。根毛是根系的重要组成部分，由根尖表皮细胞特异分化形成的特殊管状细胞，能够极大的提高根系表面积，是根系水分及营养元素的吸收主要结构。根毛的发育分为三个主要阶段：根毛细胞的命运决定，根毛的尖端起始和顶端伸长过程。根毛命运决定阶段是根毛发育的关键阶段，且不同植物间具有特异性。因此，探索鉴定玉米根毛特异表达基因和根毛长度自然变异的遗传基础，不但有助于理解根毛生长过程的分子机制，而且可以为培育根毛增强和抗旱玉米新品种提供理论依据和科学指导。
发明内容
本发明人研究发现，位于玉米5号染色体980401bp位置的基因型与玉米根毛长度高度相关，当玉米5号染色体980401bp位置的基因型为单一带型A型时，玉米根毛长度为低；当玉米5号染色体980401bp位置的基因型为杂合带型H型时，玉米根毛长度为高。
因此，本发明的第一个目的是提供一种鉴定玉米根毛相关的InDel标记引物，所述的引物序列为：
F：5’-CAATTTCCACCGCTCATTCT-3’(SEQ ID NO.1)；
R：5’-TGGTTGTGGAAACACACTCC-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定玉米根毛长度的试剂盒，其包含上述的引物。
优选的，所述的试剂盒还包含提取待检测玉米基因组DNA的试剂。
本发明的第三个目的是提供上述的引物或试剂盒在玉米种质改良中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述的引物或试剂盒在鉴定玉米根毛长度高低的玉米自交系中的应用。
优选的，所述的应用中，使用引物进行PCR扩增，当扩增产物的基因型为单一带型A型时，玉米根毛长度为低；当扩增产物的基因型为杂合带型H型时，玉米根毛长度为高。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定玉米根毛长度的方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测玉米的基因组DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用上述的引物进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果，鉴定玉米根毛长度高低。
优选的，所述的方法中，当扩增产物的基因型为单一带型A型时，玉米根毛长度为低；当扩增产物的基因型为杂合带型H型时，玉米根毛长度为高。
本发明的第六个目的是提供上述的方法在玉米种质改良中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的方法在鉴定玉米根毛长度高低的玉米自交系中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明人发现，在玉米5号染色体980401bp位置的基因型，其与玉米自交系根毛长度高度相关，其中InDel基因型为单一带型A型时根毛长度为低，InDel基因型为杂合带型H型时根毛长度为高，该位置的基因型可以作为检测玉米根毛长度高低的InDel标记。利用该InDel标记，可用于培育根毛增强和抗旱玉米新品种提供理论依据和科学指导。
附图说明
图1为玉米幼苗根毛长度指标测定示意图。
图2为GWAS分析结果曼哈顿图。箭头所指为5号染色体980401bp位置的SNP。
图3为引物Chr5lrh5F在自然群体样本中的扩增结果。泳道一条带是根毛长度为低的不同样本，泳道两条带是根毛长度为高的不同样本。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1
1、研究方法
(1)表型测定
本研究使用189份自交系组成的自然群体，于2020年下半年种植于广东省韶关市翁源县。种植材料自交授粉，成熟后选取自然群体中不同自交系的籽粒，将玉米优良自交系进行卷纸发芽，选取同一发育阶段8株具有代表性植株测定根毛长度，并重复两次实验，取平均值作为表型数据输入。并利用体式显微镜对萌发四天的幼苗根顶端15mm进行拍照，采用6个指标评鉴自交系根毛长度(图1)。分别得到lrh5、lrh10、lrh15、lrh5-10、lrh5-15和lrh10-15。
(2)全基因组关联分析(GWAS)
使用测定的玉米根毛长度相关表型数据，结合覆盖玉米全基因组的12284796个SNPs，使用混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析。选择关联分析显著性p-value≤1/2439024，即P≤1×10-6，该值作为GWAS结果的显著性相关阈值。
(3)基因型鉴定
把上述的根毛长度分离群体材料作为开发玉米根毛长度分子标记的供试群体，同时将前期GWAS定位实验使用的自然群体中根毛长度性状差异明显的极端材料作为反向验证分子标记有效性的实验材料。根据前阶段的GWAS定位实验结果，选择显著性较强的SNP位点以及显著性位点较集中的SNP区域，同时根据Mo17在B73v4参考基因组上报告的InDel位置，设计InDel分子标记在自然群体中进行筛选验证。
2、研究结果
(1)玉米关联群体根毛长度表型分布
本发明的研究共测定189份玉米自交系根毛长度，获得根毛长度指标，对测定的根毛长度数据进行描述性统计分析显示见表1。
表1玉米群体根毛长度lrh5性状描述统计
(2)全基因组关联分析
结合已得到的上千万个SNP标记以及根毛长度表型数据，采用全基因组关联分析方法，本发明人鉴定到位于玉米5号染色体980401bp位置的SNP标记与玉米自交系根毛长度显著关联(图2)。选择与该位点连锁的多态性位点chr5:980401bp，设计引物Chr5lrh5F：5’-CAATTTCCACCGCTCATTCT-3’(SEQ ID NO.1)，R：5’-TGGTTGTGGAAACACACTCC-3’(SEQ IDNO.2)扩增该位点，检测此多态性位点与根毛长度的相关性。从自然群体中挑选出的根毛长度性状的籽粒，以这些样本的基因组DNA为模板进行PCR扩增，验证该标记在自然群体中的扩增产物是否具有多态性。PCR扩增条件：PCR反应条件参数设置为94℃预变性30s，98℃变性10s，退火温度为55℃、时间为30s，72℃延伸30s，共35个循环次数，72℃最终延伸2min。PCR反应体系为2×Pro Taq Mix 5μL，引物-F(10μM)0.5μL，引物-R(10μM)0.5μL，DNA模板(50ng/μL)1μL，ddH2O 3μL，总体系10μL。
扩增产物的电泳结果显示在30份根毛长度为低的材料的扩增结果中，基因带型为单一带型A型(一条带)；在31份根毛长度为高的材料的扩增结果中，基因带型为杂合带型H型(两条带)(图3)。在置信水平为0.01情况下，对电泳结果数据统计并进行方差分析(表2)，结果显示2组数据存在显著差异。因此，认为该引物基于玉米自然群体来鉴别根毛长度高低仍然具有有效性，能够为指导培育根毛增强和抗旱玉米新品种提供理论依据和科学指导。
表2自然群体2组数据方差分析
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种鉴定玉米根毛相关的InDel标记引物，其特征在于，所述的引物序列为：
F：5’-CAATTTCCACCGCTCATTCT-3’；
R：5’-TGGTTGTGGAAACACACTCC-3’。
2.一种鉴定玉米根毛长度的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含提取待检测玉米基因组DNA的试剂。
4.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在玉米种质改良中的应用。
5.权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定玉米根毛长度高低的玉米自交系中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用引物进行PCR扩增，当扩增产物的基因型为单一带型A型时，玉米根毛长度为低；当扩增产物的基因型为杂合带型H型时，玉米根毛长度为高。
7.一种鉴定玉米根毛长度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测玉米的基因组DNA；
(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果，鉴定玉米根毛长度高低。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当扩增产物的基因型为单一带型A型时，玉米根毛长度为低；当扩增产物的基因型为杂合带型H型时，玉米根毛长度为高。
9.权利要求7所述的方法在玉米种质改良中的应用。
10.权利要求7所述的方法在鉴定玉米根毛长度高低的玉米自交系中的应用。
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