CN116555475A - 一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记及其应用，属于分子遗传学领域。所述Indel分子标记包括Indel‑1和Indel‑2，所述Indel‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述Indel‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明还提供了一种扩增上述Indel分子标记的引物组合，包括如SEQ ID NO.1‑2所示的引物对和如SEQ ID NO.3‑4所示的引物对。本发明提供的Indel分子标记在干旱条件与正常浇水下均与玉米材料的根尖数显著相关，可用于玉米分子辅助育种和优质种质资源鉴定，加速玉米耐旱材料的创制和新品种选育进程。

Description

一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记及其应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物，对我国粮食安全和经济发展有重要的影响。玉米在生长过程中易遭受干旱、盐害、化学毒性等各种非生物胁迫，导致减产甚至绝收。提高玉米对非生物胁迫的耐受性，可以增加玉米产量。分子标记、基因型鉴定等技术手段有助于筛选优异玉米种质资源。Indels(插入/缺失)是一种重要的分子遗传标记，具有分布广，检测方便的优点，对于玉米分子育种有重要的意义。

Prolyloligopeptidase(POP)POP10是一个类脯氨酰寡肽酶，属于α/β水解酶超家族蛋白(α/βHydrolasesuperfamilyproteins,ABH)。在各种生物体中的生物学功能范围广泛，包括生物合成、代谢、信号转导和基因调控。POP具有水解酶活性，可以水解脯氨酸残基羧基端的肽键。目前对该酶的报道主要集中在动物方面，在植物中的研究较少，其具体的生理作用和生理底物尚不清楚。IbMas，一个植物中新发现的α/β水解酶基因，其过表达可以显着增强转基因甘薯植物的耐盐性。对异源表达鹰嘴豆metallothionein1(MT1)基因的拟南芥进行干旱处理，发现α/β水解酶超家族蛋白大量上调以应答干旱。在玉米中，对ZmPOP10基因进行相关研究，探究其关键位点变异与玉米耐逆性的关系，有助于筛选玉米优异种质。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记，所述Indel分子标记包括Indel-1分子标记和Indel-2分子标记，所述Indel-1分子标记的核苷酸序列为CCTTAGT，所述Indel-2分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明发现在玉米基因ZmPOP10的内含子区域存在两个Indel标记，Indel-1分子标记位于第6号染色体的161845470位置，等位基因为7bp的插入/缺失；Indel-2分子标记位于第6号染色体的161845610位置，等位基因为15bp的插入/缺失。

本发明还提供一种扩增所述Indel分子标记的引物组合，包括如SEQ ID NO.1-2所示的引物对和如SEQ ID NO.3-4所示的引物对；其中，如SEQ ID NO.1-2所示的引物对用于扩增Indel-1分子标记，如SEQ ID NO.3-4所示的引物对用于扩增Indel-2分子标记。

本发明还提供一种所述的Indel分子标记或所述的引物组合在检测玉米基因ZmPOP10中的应用。

本发明还提供一种用于检测玉米单倍型或根尖数性状的试剂盒，包括所述的引物组合。

本发明还提供一种检测玉米单倍型的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测玉米样本的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用所述的引物组合进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，若只出现与Indel-1分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_1；若未出现与Indel-1分子标记相同且未出现与Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_2；若同时出现与Indel-1分子标记和Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_3；若只出现与Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_4。

本发明还提供一种所述的Indel分子标记或所述的引物组合在检测玉米根尖数性状中的应用。

本发明还提供一种检测玉米根尖数性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测玉米样本的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用所述的引物组合进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，若未出现与Indel-1分子标记相同且未出现与Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本为根尖数多的性状；若同时出现Indel-1分子标记和Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本为根尖数少的性状。

本发明还提供所述的Indel分子标记、所述的引物组合或所述的试剂盒在玉米分子辅助育种中的应用。

本发明还提供所述的Indel分子标记、所述的引物组合或所述的试剂盒在玉米种质资源鉴定中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的Indel分子标记在干旱条件与正常浇水下均与玉米材料的根尖数显著相关，7bp的Indel-1缺失和15bp的Indel-2插入共同影响了玉米根尖数量的性状，使玉米根尖数量减少，该Indel分子标记可用于筛选在正常浇水和干旱条件下根尖数均具有显著差异的材料。本发明的Indel分子标记可用于玉米分子辅助育种和优质种质资源鉴定，加速玉米耐旱材料的创制和新品种选育进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为以不同玉米材料DNA为模板PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图2为ZmPOP10基因下游内含子区域的测序结果比对；其中Indel-1为P2材料中的7bp缺失序列，Indel-2为P2中15bp的插入序列；

图3为Indel标记对部分玉米368自然群体检测的电泳条带图，其中第一排的L1-L12、R1-R12为不同材料中Indel-1的鉴定结果，有Indel-1的缺失材料扩增到的条带大小为205bp,无Indel-1的材料扩增到的条带大小为212bp；第二排的L1-L12、R1-R12为不同材料中Indel-2的鉴定结果,有Indel-12插入的材料扩增到的条带大小为176bp,无插入的条带大小为161bp。各泳道及其对应的自交系材料名称，单倍型如下所示：L1,2L1:ZB648，hap_1；L2,2L2:LY042,hap_1；L3,2L3:FCD0602,hap_1；L4,2L4:LY,hap_1；L5,2L5:CML51,hap_3；L6,2L6:CIMBL28；L7,2L7:DH3732,,hap_1；L8,2L8:Liao5263,hap_1；L9,2L9:By4839,hap_2；L10，2L10：Sy1128，hap_3；L11,2L11:975-12，hap_1；L12,2L12:JY01,hap_1；R1，2R1：CIMBL119，hap_2；R2，2R2：CML115，hap_2；R3，2R3：CML114，hap_1；R4，2R4：CIMBL34，hap_2；R5，2R5：Gy923，hap_2；R6，2R6：Gy1007，hap_2；R7，2R7：CIMBL113，hap_3；R8，2R8：Gy1032，hap_2；R9，2R9：Ry684，hap_2；R10，2R10：U8112，hap_2；R11，2R11：HYS，hap_2；R12，2R12：CML169，hap_3；图中第一排中标注“-”的泳道代表无Indel-1的材料，未标注的泳道代表有Indel-1的材料；第二排中标注“+”的泳道代表有Indel-2的材料，未标注的泳道代表无Indel-2的材料；

图4为ZmPOP10基因下游内含子的InDel位点(A)和玉米自然群体中4种单倍型的占比(B)，在图A中，两个InDel类型可以分为四种单倍型，标尺：500bp；

图5为不同单倍型材料中根尖数的差异，其中A为不同单倍型玉米材料中根尖数的统计图，B为不同单倍型玉米材料的根系图片；

图6为ZmPOP10基因含不同Indel的单倍型对根尖数的影响，其中，A为试验用的不同自交系中ZmPOP10基因的InDel位点标示图和其单倍型结果，标尺为500bp；B为卷纸水培试验中WW(水分充足)和WS(水分胁迫)条件下单倍型为Hap_2和Hap_3玉米的根系图片，标尺为5cm；C为WW(水分充足)和WS(水分胁迫)条件单倍型Hap_2与单倍型Hap_3玉米根尖数的统计图；D为同一份材料沙培试验中不同水分条件盆栽实验示意图，左边为WW(水分充足)条件下的两盆盆栽，右边为WS(水分胁迫)条件下的两盆盆栽；E为沙培试验中WW(水分充足)和WS(水分胁迫)条件下单倍型Hap_2和Hap_3玉米的根尖数统计图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实施例中用到的玉米耐旱自交系P1(AC7643)、玉米干旱敏感自交系P2(AC7729/TZSRW)，由国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)提供，四川农业大学保存；玉米自交系B73由四川农业大学保存；玉米368份自交系组成的自然群体，由华中农业大学提供，由四川农业大学保存。

实施例1玉米基因ZmPOP10中两个Indel的扩增

1.实验材料

玉米耐旱自交系P1(AC7643)、干旱敏感自交系P2(AC7729/TZSRW)和玉米自交系B73。

2.Indel的扩增

提取玉米耐旱自交系P1(AC7643)、干旱敏感自交系P2(AC7729/TZSRW)和玉米自交系B73的DNA，分别以其为模板，用诺唯赞的2×RapidTaqMasterMix进行PCR，扩增ZmPOP10基因的两个Indel，包括Indel-1和Indel-2。

用于扩增Indel-1的引物对如下：

Indel-1F:5’-TCTAGCCTTTCTTTACTTGAT-3’(SEQ ID NO.1)；

Indel-1R:5’-GTGTCCTGGCTTGGAAAGAG-3’(SEQ ID NO.2)。

用于扩增Indel-2的引物对如下：

Indel-2F:5’-CTAATCAATTAGCACAGG-3’(SEQ ID NO.3)；

Indel-2R:5’-GCACAACCACCAAAACAACGC-3’(SEQ ID NO.4)。

PCR反应体系如表1所示。

表1PCR扩增反应体系

PCR扩增程序如表2所示。

表2PCR扩增程序

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1，可以看出P2材料的扩增产物凝胶电泳条带的迁移率发生了变化，将分别以P1、P2和B73三种材料DNA为模板的PCR产物送往成都生工生物技术有限公司进行测序，测序结果如下：

以B73材料DNA为模板扩增产物测序序列(SEQ ID NO.5)：

TCTAGCCTTTCTTTACTTGATTAATAATACGTCATTTTTTTCATGTTAATCTTATTATGAGTCTGATTCAATGGACTATCCCTTAGTTTTCTAATCAATTAGCACAGGGTCATCAAACAAATGCATGCGTCTGATCTGGTGTCAATCTTGAAACTGTCAAAAACTAAACTATAGGCTCGGTGTTTCTGCTCACTCTTTCCAAGCCAGGACACATGGCAATGCGATTGTAAAGAGGATCATGCATCGCGTTGTTTTGGTGGTTGTGC。

以P1材料DNA为模板扩增产物测序序列(与B73参考基因组相同)(SEQ ID NO.6)：

TCTAGCCTTTCTTTACTTGATTAATAATACGTCATTTTTTTCATGTTAATCTTATTATGAGTCTGATTCAATGGACTATCCCTTAGTTTTCTAATCAATTAGCACAGGGTCATCAAACAAATGCATGCGTCTGATCTGGTGTCAATCTTGAAACTGTCAAAAACTAAACTATAGGCTCGGTGTTTCTGCTCACTCTTTCCAAGCCAGGACACATGGCAATGCGATTGTAAAGAGGATCATGCATCGCGTTGTTTTGGTGGTTGTGC。

以P2材料DNA为模板扩增产物测序序列(含有两个Indel的突变)(SEQ ID NO.7)：

TCTAGCCTTTCTTTACTTGATTAATAATACGTCATTTTTTTCATGTTAATCTTATTATGAGTCTGATTCAATGGACTATCTTTCTAATCAATTAGCACAGGGTCATCAAACAAATGCATGCGTCTGATCTGGTGTCAATCTTGAAACTGTCAAAAACTAAACTATAGGCTCGGTGTTTCTGCTCACTCTTTCCAAGCCAGGACACATGGCAATGCAATGCAGTGGAGAGCGATTGTAAAGAGGATCATGCATCGCGTTGTTTTGGTGGTTGTGC。

测序结果与玉米自交系B73参考基因组中ZmPOP10基因(NCBIGene(Entrez Gene):100283073)序列进行比对分析，如图2所示，发现两处Indel，其中Indel-1为7bp的缺失，Indel-2为15bp的插入序列。

Indel-1的核苷酸序列为：CCTTAGT。

Indel-2的核苷酸序列为：GCAATGCAGTGGAGA(SEQ ID NO.8)。

由此可知，玉米ZmPOP10基因的内含子区域存在两个Indel标记，Indel-1分子标记位于第6号染色体的161845470位置，等位基因为7bp的插入/缺失；Indel-2分子标记位于第6号染色体的161845610位置，等位基因为15bp的插入/缺失(基因组版本为MaizeB73AGP_v3)。

实施例2两个Indels在玉米368自然群体中分型的应用

以玉米368群体的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物对Indel-1进行PCR扩增，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物对Indel-2进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：2×RapidtaqMasterPCRmix10μL，上下游引物均为0.4μL，DNA模板为1μL，加8.2μL双蒸水补齐至20μL。扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共39个循环；72℃温浴5min；对扩增后的PCR产物用3％的琼脂糖凝胶进行电泳(图3)。

PCR的结果表明，在玉米368自然群体中这两个InDels可以分为四种单倍型(Hap_1-4)：Hap_1：只有Indel-1的突变，Hap_2:无InDel突变(与B73一致)，Hap_3：同时有InDel-1和InDel-2的突变(与P2材料一致)，Hap_4：只有Indel-2的突变(图4的A)。在玉米368自然群体中检测Hap_1和Hap_2单倍型占比较多，分别占比为26.37％和42.68％；Hap_3和Hap_4的占比较少，分别为21.98％和8.79％(图4的B)。

我们进一步对自然群体中不同单倍型结果与课题组前期做的苗期根系表型数据进行相关性分析。我们发现单倍型为Hap_2材料的根尖数显著多于单倍型为Hap_3材料(p＝0.0412，p＝0.0469，t-test)，成株期也能明显的观测到该结果(图5)。

实施例3两个Indel标记鉴定到的Hap_3单倍型对玉米根尖数性状的影响

为进一步确认Hap_3单倍型对玉米根尖数的影响，我们选择了以AC7643和AC7729/TZSRW两份亲本构建的自交系进行验证。挑选Hap_2和Hap_3单倍型的两种材料各选四份(图6的A)，进行不同水分条件的水培和土培。水培具体的处理步骤如下：将玉米种子在28℃条件下催芽，所有种子均长出胚根后将其转移至发芽纸上卷纸，用橡皮筋捆绑发芽纸后插入霍格兰营养液中培养。每隔三天换一次营养液，自催芽后生长15天，一部分材料仍在正常营养液中生长作为对照，一部分材料进行20％PEG模拟干旱胁迫处理24h后取样。土培的具体处理步骤如下:设置正常处理组和干旱组两种水分条件，每种条件三个重复。苗期干旱实验育苗基质选用过筛的河沙和堆积发酵的有机肥，按照4：1比例混匀，用28×30cm的营养钵装7.00±0.01kg的基质放于塑料托盘内，每盘播种10粒露白后的种子，待幼苗长至1叶1心时开始间苗，每盆保留6株长势一致性较好的正常植株，间苗后干旱组不浇水，对照正常浇水，根据天气情况每2～5天浇水一次，保持基质水分含水量为25±2％。地上部分出现萎蔫表型7天后开始进行根系表型鉴定。对根系使用WinRHIZO软件进行扫描分析，结果显示单倍型为Hap_2的玉米材料根尖数在干旱前后均高于单倍型为Hap_3的玉米材料(图6的B-E)，表明7bp的Indel-1缺失和15bp的Indel-2插入共同影响了玉米根尖数量的性状，使玉米根尖数量减少。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种玉米基因ZmPOP10的Indel分子标记，其特征在于，所述Indel分子标记包括Indel-1分子标记和Indel-2分子标记，所述Indel-1分子标记的核苷酸序列为CCTTAGT，所述Indel-2分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种扩增权利要求1所述Indel分子标记的引物组合，其特征在于，包括如SEQ IDNO.1-2所示的引物对和如SEQ ID NO.3-4所示的引物对；其中，如SEQ ID NO.1-2所示的引物对用于扩增Indel-1分子标记，如SEQ ID NO.3-4所示的引物对用于扩增Indel-2分子标记。

3.一种如权利要求1所述的Indel分子标记或如权利要求2所述的引物组合在检测玉米基因ZmPOP10中的应用。

4.一种用于检测玉米单倍型或根尖数性状的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组合。

5.一种检测玉米单倍型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测玉米样本的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物组合进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，若只出现与权利要求1中所述Indel-1分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_1；若未出现与权利要求1中所述Indel-1分子标记相同且未出现与所述Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_2；若同时出现与权利要求1中所述Indel-1分子标记和所述Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_3；若只出现与权利要求1中所述Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本的单倍型记为Hap_4。

6.一种如权利要求1所述的Indel分子标记或如权利要求2所述的引物组合在检测玉米根尖数性状中的应用。

7.一种检测玉米根尖数性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测玉米样本的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物组合进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，若未出现与权利要求1中所述Indel-1分子标记相同且未出现与所述Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本为根尖数多的性状；若同时出现与权利要求1中所述Indel-1分子标记和所述Indel-2分子标记相同的电泳条带，则所述待测玉米样本为根尖数少的性状。

8.如权利要求1所述的Indel分子标记、权利要求2所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在玉米分子辅助育种中的应用。

9.如权利要求1所述的Indel分子标记、权利要求2所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在玉米种质资源鉴定中的应用。