CN104711254B - 玉米低磷响应基因ZmARF31的INDEL分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了玉米低磷响应基因ZmARF31基因内的InDel分子标记，该SNP标记位于玉米第10号染色体148637125 bp位置，等位基因为38 bp的插入/缺失，所述38 bp的序列如SEQ ID NO.4所示，该等位基因的侧翼序列如SEQ ID NO.1所示，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物扩增得到。该InDeL分子标记在正常磷水平和低磷胁迫下与玉米根尖数显著相关，位点基因型为38 bp插入的玉米自交系在正常磷水平和低磷胁迫下根尖数均高于位点基因型为缺失的自交系。本发明的分子标记可用于玉米辅助育种，加速玉米磷高效特异材料创制与新品种选育进程。

Description

玉米低磷响应基因ZmARF31的INDEL分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与玉米耐低磷性状相关的分子标记，具体地，涉及玉米10号染色体上ZmARF31基因内的一个与总干重显著关联的SNP标记、扩增其的引物对以及该分子标记的应用。

背景技术

玉米是集粮、经、饲为一体的多元作物，同时也是重要的工业原料和能源作物，在世界范围内广泛分布。20世纪末，随着全球玉米需求的快速增长，其种植面积逐渐超过水稻和小麦，成为总产量位居世界第一的粮食作物。预计到2050年粮食增产的50％将来自玉米。磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，在糖分代谢、能量代谢、酶促反应及光合作用等过程中起着至关重要的作用，很大程度上决定了作物的产量和品质。然而，由于土壤对磷强烈的吸附导致土壤中可被植物吸收的有效无机磷浓度低至2μmol/L左右，土壤有效磷缺乏成为限制作物产量的重要非生物胁迫因素之一。因此，加强培育和推广磷高效品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。

研究和生产实践表明，磷的吸收利用效率在玉米自交系间存在显著的基因型差异。磷对植物根系发育的影响是复杂的，不仅表现为品种特异性和基因型依赖性，还涉及多种激素信号通路的交叉调节。磷缺乏时主要通过抑制细胞分裂和静止中心的丢失而严重制约初生根的生长，同时有效磷通过调控侧生根根原基的初始化，初生根和侧生根的生长以及侧生根的生长角度，根毛的密度和伸长等改变根系的适应性形态。

玉米耐低磷相关性状作为一种复杂的数量性状，利用连锁作图进行QTL定位以解析相关性状的遗传基础已有大量报道。但QTL定位费时费力，且大部分QTL区间宽泛，目前玉米种质改良和分子辅助育种中尚未有耐低磷主效位点分子标记开发与利用的报道。

关联分析是一种在自然群体中基于连锁不平衡(LD)鉴定表型性状与遗传标记或候选基因间关系的分析方法，主要包括基于全基因组扫描(GWAS)和基于候选基因的关联分析。其中，基于候选基因的关联分析是发掘与表型变异密切相关的功能等位变异的有效手段。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供玉米低磷响应基因ZmARF31中与根尖数显著关联的InDel(插入/缺失)标记。

本发明的第二个目的是提供扩增上述InDel标记的引物对。

本发明的第三个目的是提供上述InDel标记的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

基于以上目的，申请人收集了中国、美国、墨西哥等地的温带、热带、亚热带玉米自交系331份，作为本研究的关联群体，利用同源克隆方法获得其低磷响应基因ZmARF31(GRMZM2G023813)序列，通过多序列比对，发掘该基因在331份玉米自交系中的变异位点。本申请结合正常磷水平和低磷胁迫处理下玉米自交系苗期根系性状的表型数据，运用TASSEL软件的一般线性模型和混合线性模型两种方法进行候选基因关联分析，并同时检测到一个(基因组版本和位置为Maize B73 AGP_v3:Chr10:148637125)与玉米根尖数显著关联的InDel位点。该位点的等位基因为38bp的插入/缺失，在供试自交系中有缺失和插入两种纯合基因型，其侧翼序列如SEQ ID NO.1所示，其中38bp的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

TTTGTGCTGTTGCCTCCATCTATCTGCTTGCTGAAAAATTCAGCGCTAGATATACATATATGTTTATCATATTGATTTGGTATTTCTTTGTTGTAGCTATAACTTTTGTCGTGTTCTTGTATTACAACTGCATGCAGATCGACTGGGATGTTGCCT(SEQ ID NO.1)

上述SEQ ID NO.1中，下划线的碱基序列为InDel分子标记的缺失或插入的38个碱基。

该InDel分子标记在正常磷水平和低磷胁迫下与玉米根尖数显著相关，位点基因型为38bp插入的玉米自交系在正常磷水平和低磷胁迫下根尖数均高于位点基因型为缺失的自交系。

进一步，本发明提供了上述InDel分子标记在提高玉米根尖数中的应用。InDel分子标记的位点基因型插入为优异基因型。

本发明还提供了上述InDel分子标记在玉米育种中的应用。

筛选到该显著关联的InDel位点后，基于该位点侧翼序列，申请人设计了包含上述InDel位点的检测玉米低磷响应基因ZmARF31的特异性引物对。引物对序列如下所示：

上游(F)：TTTGTGCTGTTGCCTCCATC(SEQ ID NO.2)

下游(R)：AGGCAACATCCCAGTCGATC(SEQ ID NO.3)

本发明提供了上述引物对在玉米种质改良中的应用。

本发明还提供了上述引物对在选育抗逆玉米中的应用。

含有上述引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。

本发明提供一种检测玉米低磷响应基因ZmARF31的方法，用上述引物对进行PCR扩增，待检测玉米基因组DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO.1所示的片段，则说明该待检玉米存在低磷响应基因ZmARF31。

PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s、55℃退火20s，72℃延伸20s，共35个循环,72℃延伸5min。

本发明提供了上述方法在玉米育种中的应用。

为进一步验证所开发标记的有效性，发明人在关联群体中随机挑选16份玉米自交系，以DNA为模板，采用TaKaRa Taq^TM Hot Start Version进行基于PCR扩增的标记检测，结果显示该InDel位点成功地对16份玉米自交系进行长度多态性检测(见图1)。

同时，发明人利用前期构建的玉米耐低磷RIL群体(P178×9782)中的198个家系的DNA为模板，对该位点进行标记验证(图2)。结果发现在该RIL群体中，InDel位点与正常磷水平和低磷胁迫下根尖数存在显著相关性(图3)，与ZmARF31基因在331份玉米自交系中的关联分析结果基本一致。

本发明还提供了一种检测玉米低磷响应基因ZmARF31的试剂盒，其含有SEQ IDNO.2～3所示的引物对。本发明结合ZmARF31在自然群体中的序列多样性，利用候选基因关联分析策略揭示该基因与低磷胁迫下玉米根系性状之间的内在联系，发掘其中显著的功能位点，并作为遗传标记应用于玉米分子育种，对提高玉米抗逆性具有重要意义。

本发明的有益效果在于：运用候选基因关联分析方法，能够快速、精确地检测与特定性状显著关联的SNP或InDel位点。玉米10号染色体148637125bp位置的InDel位点(MaizeB73AGP_v3：Chr10:148637125)与正常磷水平下玉米苗期根尖数显著相关，解释表型变异为2.74％。该InDel位点能够作为遗传标记，用于抗逆玉米育种，提高玉米耐低磷能力，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为16份玉米自交系中基于PCR扩增的标记检测。其中上带和下带分别表示基因型在玉米第10号染色体148637125bp位置38bp“插入”和“缺失”。Marker为DL2000。

图2为RIL群体中72个家系基于PCR扩增的标记验证。其中上带和下带分别表示基因型在玉米第10号染色体148637125bp位置38bp“插入”和“缺失”。Marker为DL2000。

图3为RIL群体插入和缺失基因型个体的根尖数比较。CK和T分别表示正常磷水平对照组和低磷胁迫处理组；*表示0.01≤P≤0.05，**表示P<0.01。RIL群体中具有插入基因型和缺失基因型的家系分别为96和99个。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米低磷响应基因ZmARF31与根尖数显著相关的一个InDel分子标记的获得及其检测引物的确定

本发明玉米低磷响应基因ZmARF31与根尖数显著相关的一个InDel分子标记是通过以下方法获得的：

1)收集获得331份来自中国、美国、墨西哥的玉米自交系，构建了作图所用的关联群体。该群体有着丰富的遗传多样性，包含131个温带玉米自交系和200个热带/亚热带玉米自交系。

2)关联群体苗期根系表型鉴定。分别于2010年在四川农业大学多营农场基地和2012年在四川农业大学雅安教学实验大棚对获得的331份玉米自交系进行以新鲜河沙为基质的盆栽试验。待玉米生长至两叶一芯期后，定期浇灌改良的霍格兰营养液。其中对照组施浇正常的全素营养液(磷含量为1mmol/L)，低磷胁迫组施浇低磷营养液(磷含量为1μmol/L)，培养至6叶期。每个自交系选取5株，运用Epson Expression 10000XL扫描仪和RegentWinrhizo Canada根系分析系统测定供试自交系的根系性状。正常磷水平条件下根尖数的平均值为881.55，低磷胁迫下根尖数的平均值为639.96。方差分析表明，根尖数在不同自交系和不同处理下差异达极显著水平(表1)。

表1根尖数在正常供磷水平和低磷胁迫处理的方差分析

括号中的数字表示自由度；***表示在0.001水平下显著；NS表示不显著。

3)基因ZmARF31的克隆和测序。本发明利用NCBI中AtARF19(At1g19220)的氨基酸序列在国际玉米基因组网站Maize Sequence(http://www.maizesequence.org)中进行序列比对，根据比对结果筛选候选基因ZmARF31(GRMZM2G023813)。设计特异性引物，上游引物序列为5’-ACCATCCCGTCGGTTTAGC-3’，下游引物序列为5’-GCCGATGATCCTATGGTTCAG-3’，以关联群体的331份玉米自交系基因组DNA为模板，采用KOD FX Neo高保真聚合酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司)进行PCR扩增，程序为：94℃预变性3min；98℃10s，56℃30s，68℃70s，35个循环；最后68℃延伸5min；4℃保存。将特异性的目标条带用胶回收试剂盒(OmegaBio-Tek)回收纯化，直接进行ABI 3730测序或连接平末端克隆载体pEASY-Blunt CloningVector(北京全式金生物技术有限公司)测序。对测序峰图有杂峰或套峰的样品重新扩增、测序验证。对测序结果进行拼接，多序列联配比对，并局部手动调整，最终得到基因序列的全长约2292bp，共包含30个InDel和14个InDel。

4)候选基因ZmARF31的关联分析。运用MUSCLE软件对ZmARF31的测序结果进行多序列比对分析，并结合BioEdit软件对局部序列进行校正。结合步骤2中玉米自交系苗期根尖数的表型数据，分别利用TASSEL 3.0的一般线性模型(GLM)和控制群体结构的一般线性模型(GLM+Q)进行关联分析，等位基因频率阈值设为0.05。结果发现该基因中存在一个InDel位点，该InDel位点位于玉米第10号染色体148637125bp位置，等位基因为38bp的插入或缺失。其侧翼序列如SEQ ID NO.1所示，插入或缺失的38bp序列如SEQ ID NO.4所示与正常磷水平下根尖数显著相关，GLM和GLM+Q模型的检测P值分别为0.0050和0.0099，可解释的表型变异分别为2.74％和2.50％。两个不同模型的相互验证，避免了在0.01水平该位点关联结果的假阳性可能，进一步证实了结果的真实可靠性。

实施例2本发明的InDel标记玉米根尖数上的应用试验

1)本发明的InDel标记在关联群体中的PCR检测。

具体方法为：在关联群体中随机选取16份玉米自交系，以基因组DNA为模板，以该位点侧翼序列(SEQ ID NO.1)的特异性引物(SEQ ID NO.2和3)为引物。PCR扩增的反应体系为：TaKaRa Taq HS 0.5U,10×PCR Buffer 2μl，dNTP Mixture 0.25μmol/μl，上下游引物均为0.25pmol/μl、DNA模板为100ng、加双蒸水至20μl。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s、55℃退火20s，72℃延伸20s，共35个循环,72℃延伸5min。

PCR产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图1)显示该InDel位点的特异引物成功地对供试材料进行基因分型，16份自交系在该位点上被划分为8份缺失和8份插入两类基因型，进一步证明了本发明中关联分析检测结果及引物设计的准确性。

2)本发明的InDel标记在玉米遗传群体中的应用。

具体方法为：分别筛选和鉴定出玉米耐低磷自交系P178与低磷敏感自交系9782，并以P178和9782为亲本构建包含198个家系的RIL群体。以群体中各家系及两亲本基因组DNA为模板，以该InDel位点侧翼序列的特异性引物(SEQ ID NO.2和3)为引物。PCR扩增的反应体系和程序均同实施例2中步骤1)。在RIL群体的198个家系中有195个家系被成功分型，基因型插入和缺失的家系个数分别为96和99。

根据实施例1中步骤2的结果，在正常供磷水平下，带有插入基因型家系的平均根尖数为704.91，带有缺失基因型家系的平均根尖数为673.63，两者间差异显著(P＝5.17×10^-3)。在低磷胁迫下，基因型插入和缺失家系的平均根尖数分别为379.49和355.50，两者间差异显著(P＝0.027)。因此，等位基因38bp的插入被视作优异/增效等位基因(图3)。本发明进一步证实位于玉米第10号染色体148637125bp位置，等位基因为38bp插入或缺失的InDel位点能够作为有效的遗传标记应用于分子标记辅助选择，改良玉米的耐低磷特性，提高玉米抗逆育种效率。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.玉米低磷响应基因ZmARF31的InDeL分子标记在耐低磷玉米育种中的应用，该InDeL分子标记位于玉米第10号染色体148637125bp位置，等位基因为38bp的插入/缺失，所述38bp的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，InDeL分子标记位点侧翼序列如SEQ ID NO.1所示。

3.玉米低磷响应基因ZmARF31的InDeL分子标记在根尖数高的玉米育种中的应用，该InDeL分子标记位于玉米第10号染色体148637125bp位置，等位基因为38bp的插入/缺失，所述38bp的序列如SEQ ID NO.4所示；用于检测该InDeL分子标记的引物对的核苷酸序列为：上游引物序列，5’-TTTGTGCTGTTGCCTCCATC-3’；

下游引物序列，5’-AGGCAACATCCCAGTCGATC-3’。

4.检测玉米低磷响应基因ZmARF31的InDeL分子标记的引物对在耐低磷玉米育种中的应用，该InDeL分子标记位于玉米第10号染色体148637125bp位置，等位基因为38bp的插入/缺失，所述38bp的序列如SEQ ID NO.4所示；用于检测该InDeL分子标记的引物对的核苷酸序列为：上游引物序列，5’-TTTGTGCTGTTGCCTCCATC-3’；

下游引物序列，5’-AGGCAACATCCCAGTCGATC-3’。