CN101921758A - 大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，属于分子遗传学领域。利用大豆耐低磷基因GmAPt在大豆耐低磷材料中与不耐低磷材料中在第一内含子存在10bp的缺失，设计合成了标记Indel_S170，由于这个标记为基因本身的标记，因此和耐低磷基因GmAPt及其等位基因表现为共分离。利用该标记能够准确快速的鉴定大豆种质资源的耐低磷性，大大提高大豆耐低磷材料的选择效率和分型鉴定效率，加速大豆耐低磷分子标记辅助选择育种进程。

Description

大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法

一、技术领域

本发明提供了大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，属于分子遗传学领域，可用于大豆耐低磷分子标记辅助选择育种和种质的分型鉴定。

二、背景技术

大豆是我国重要的粮食作物和油料作物。然而，三分之二的耕地缺磷是限制我国大豆生产的主要因素。因此，发掘大豆自身潜力，高效利用土壤潜在磷素资源是解决大豆缺磷的有效途径。

尽管大豆磷效率的研究也已取得了一些进展，但在磷高效基因型的筛选上存在很大的困难，主要是因为筛选指标和筛选时期的难以确定。为了加快大豆耐低磷胁迫育种进程，十分关键的问题是大豆种质耐低磷特性的准确鉴定，育种学家通常通过田间筛选的方法来鉴定大豆种质的耐低磷特性，然而，这些方法在对大的群体进行选择时，尤其对于磷效率这样数量性状具有一定的局限性。例如，数量性状受环境的影响很大，一两次的鉴定结果难以准确可靠，多年多点鉴定又费时费力。因此，如何准确、快速、简单地对耐低磷性进行鉴定一直是大豆耐低磷育种的难题之一。

近年来，随着分子标记技术的发展，许多的研究者利用与磷效率QTL连锁的标记对耐低磷种质进行辅助选择，这种方法在一定的程度上提高了选择的速度，且操作简单，但是这些标记都是大豆磷效率基因的连锁标记，因此准确性一般较低。

基于大豆耐低磷基因本身开发的功能分子标记可以克服以上缺点，Zhang等利用连锁分析和关联分析相结合的方法对控制磷效率基因进行精细定位，发现并图位克隆了存在于第八染色体上的一个控制磷效率的主效基因(GmAPt)，将该基因在184分大豆材料中进行测序分析，发现在GmAPt基因第一内含子存在等位基因，即与不耐低磷的材料相比，耐低磷材料在第一内含子存在着10bp的缺失。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述的情况，利用大豆GmAPt基因不同材料间在第一内含子上存在着10bp的差异，获得了GmAPt基因的一个基因标记Indel_S170，利用这个标记进行大豆耐低磷种质的分型鉴定可以保证92.9％以上的准确率。

技术方案：

鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的基因标记引物为，

InDel_S170正向引物序列：CTTGAGATCACTACAACACACC

InDel_S170反向引物序列：GATAGAAGAAC AACACAAAAAC

上述引物用于鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的基因标记方法为：

1、大豆材料基因组DNA的提取；

2、对大豆基因组DNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系为：EXTaq×Master PCR Mix 5μL，Primer(3pmol/L)2.0μL，模板DNA(约15ng/μL)2μL，灭菌双蒸水1μL；反应总量10μL.PCR反应在MJResearch PTC-200热循环仪上进行，反应程序包括：94℃预变性5min，每个循环95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸7min，12℃保存。

3、反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。电泳结果如果有302bp的单条谱带，则为耐低磷材料；如果有312bp单条谱带，则为不耐低磷大豆材料。

有益效果：本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得一个大豆耐低磷基因GmAPt的功能分子标记Inde1_S170，该标记的优点具体归纳如下：

(1)分型和鉴定新的大豆耐低磷材料，不仅可以进一步研究耐低磷的分子和遗传机制，同时也可以拓宽耐低磷育种的遗传背景，选育出高产、稳产、耐逆性强的优质大豆品种。而传统的鉴定方法不仅工作量大而且花费的周期长，利用本发明的标记可以简单快速的鉴定大豆材料的耐低磷特性。

(2)本发明所获得的基因标记是依据GmAPt基因内部产生的碱基缺失，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。

(3)育种中一些耐低磷相关性状的调查必须将植株收获或对植株造成伤害才能进行(例如，测定生物量、磷含量、酶活性等)，而利用本发明的标记可在任何时期通过SSR标记判断其耐低磷性，为有效选育耐低磷大豆品种提供了技术。

四、附图说明

图1大豆耐低磷基因GmAPt在不同磷效率特性材料中第一内含子的序列比对图2Indel_S170对供试14份材料的电泳检测图

五、具体实施方式

(1)供试材料

试验材料包括14份材料(表1，均由国家大豆改良中心对外提供)来自不同文献报道过的大豆耐低磷特性种质(刘莹等，2007；崔世友等，2007；丁玉川等，2006)，包括6份耐低磷种质，7份不耐低磷种质和1份中等耐性种质。

表1  14份不同耐低磷相关材料

(2)Indel S170标记的获得

根据GmAPt基因序列内部一个的10bp缺失位点，设计了一对Indel标记引物，上游引物为5’-CTTGAGATCACTACAACACACC-3’，下游引物为5’-GATAGAAGAAC AACACAAAAAC-3’

(3)DNA的提取

以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：

1)取大豆嫩叶3-5克左右，在液氮中研成粉末，倒入保温的CTAB提取缓

冲液中，65℃水浴30-60min，其间轻摇3-5次；

2)加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)溶液，并充分摇匀，放在摇床上轻摇1h；

3)经5000rpm离心15min，将上清夜转入一个新的离心管中；

4)加入10ml冰冻的异丙醇，上下摇匀；

5)离心倒掉液体，加入1.5-3mlHS-TE缓冲液，待完全溶解后，等体积氯仿：异戊醇再抽提一次；

6)经8000rpm离心5min，吸取上清液转到另一个新的离心管中；

7)用三倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下静置20min以沉淀DNA；

8)10000rpm离心5min，弃去上清夜；

9)70％乙醇清洗两次，真空干燥机上吹干；

10)将DNA溶于TE中，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。置于-20℃待用。

(4)PCR反应及电泳检测

PCR扩增反应体系为：EXTaq×Master PCR Mix 5μL，Primer(3pmol/L)2.0μL，模板DNA(约15ng/μL)2μL，灭菌双蒸水1μL；反应总量10μL.PCR反应在MJResearch PTC-200热循环仪上进行，反应程序包括：94℃预变性5min，每个循环95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸7min，12℃保存。反应产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。

(5)电泳结果分析

利用Indel_S170对14份供试材料进行基因型检测。第一内含子缺失的耐低磷材料能扩增出302bp的DNA条带，而第一内含子不缺失的不耐低磷材料能扩增出312bp的DNA条带，在供试材料中中等耐性的一个材料扩出312bp的DNA条带(图2)。图2中泳道编号与表2材料编号对应。

从结果可以得出，Indel_S170标记可用于分型和鉴定新的大豆耐低磷材料，并且用于对前人通过常规方法筛选的不同磷效率特性的大豆种质进行验证，正确率达到了92.9％。这较之常规的筛选方法省时，省力，节省成本，并具有很高的可靠性。这为以后大豆磷高效基因型种质鉴定和大豆磷高效育种分子标记辅助选择提供了新的材料和技术。

Claims (2)

1.大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记引物，其序列为，

Indel-SSR正向引物序列：CTTGAGATCACTACAACACACC

Indel-SSR正向引物序列：GATAGAAGAACAACACAAAAAC；

2.权利要求1所述引物用于鉴定大豆耐低磷基因GmAPt的分子标记方法，包括：

(1)大豆材料基因组DNA的提取；

(2)对大豆基因组DNA进行PCR扩增；

PCR扩增反应体系为：EXTaq×Master PCR Mix 5μL，3pmol/L Primer2.0μL，15ng/μL模板DNA2μL，灭菌双蒸水1μL；反应总量10μL.PCR反应在MJ ResearchPTC-200热循环仪上进行，反应程序包括：94℃预变性5min，每个循环95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸7min，12℃保存；

(3)反应产物在质量比8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色，电泳结果如果有302bp的单条谱带，则为含大豆耐低磷基因GmAPt的耐低磷材料；如果有312bp单条谱带，则为不含大豆耐低磷基因GmAPt的大豆材料。

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