CN107058496A - 一种适于大豆磷效率筛选的ssr引物序列及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物种质资源评价利用领域，具体涉及一种适于磷高效大豆基因型筛选的特异性SSR分子标记及应用。包括一种适于大豆磷效率筛选的SSR引物序列及大豆磷高效基因型的评价方法。本发明提供的方法，可以用于高效、准确地筛选磷高效大豆品种。

Description

一种适于大豆磷效率筛选的SSR引物序列及其使用方法

技术领域

本发明涉及农作物种质资源评价利用领域，具体涉及一种适于磷高效大豆基因型筛选的特异性SSR分子标记及应用。

背景技术

培育和推广磷高效的大豆品种具有重要的生态和经济意义。栽培大豆〔Glycine max(L.)Merrill 〕是重要的经济作物，是食用油和种子蛋白的主要来源之一，其生长在广泛的土壤环境中。磷是作物养分三要素之一。对于生长在土壤中的植物，磷是有限的矿质营养。它的可利用能力依赖于土壤特性和不稳定的磷含量。据估计，在世界2/3的栽培土壤中，有效磷总体上偏低，存在不同程度的缺磷现象。在缺磷时，蛋白质合成受阻，新的细胞质和细胞核形成较少，影响细胞分裂，生长缓慢，分枝或分蘖减少，植株矮小，开花期和成熟期都延迟，产量降低，抗性减弱。中国华南热带、亚热带地区，土壤有效磷含量低、利用率不高，严重影响大豆的产量和品质。传统的种植中通过在农业生产上大量使用磷肥，提高产量，此方法已造成磷资源的危机，环境污染问题也日益突出。为改变这一现状，现已转变策略，期望通过对大豆磷营养效率的遗传改良，使之能够更好地适应特定的生态条件。因此，开展大豆磷高效的种质资源筛选，培育磷高效的大豆新品种，提高大豆活化和利用土壤磷库的能力，使土壤磷库成为磷矿的替代资源，具有重大的生态和经济意义。

由于缺乏特异性评价指标，目前生产上常用的大豆磷高效种质资源筛选方法效率较低。植物对磷的吸收和利用能力的相对大小以磷效率（phosphorus efficiency）来表示。大豆不同品种（基因型）对磷缺乏有不同的适应机制。评价不同大豆品种磷缺乏条件下的适应性通常采用种质筛选法，即采用缺磷土壤（大田或土壤盆栽）或在水培条件下对大豆种质资源进行种植评价。这些方法都需要占用较大的空间，并且一般需要完成一个生长周期，耗费时间较长，受土壤、养分、水分、气候等因素会影响到试验结果的准确性。磷高效品种筛选，确定大豆磷效率的指数是非常重要的。大豆生长磷效率的评价指标有很多，如生长发育测定指标，包括根形态构型、生物量、叶面积、叶龄相对值、光合特性、生理生化指标、分蘖数（水稻）等。实践证明，并不是所有的参数指标对于磷高效大豆的评价和育种都是有效的。仅仅是一些容易测量到的和与磷效率相关的参数被用在大豆育种中。统计学上的评价方法包括单一参数、多样参数以及主要部分分析方法等。单一参数的评价直接显示了不同基因型在磷缺乏时比较根上部生物量、磷吸收和磷效率的比例。这些参数在磷可利用性土壤中是敏感的。与单一参数显示方法相比，多样参数评价如簇分析方法更优越，因为他综合分析了磷效率多样参数。然而，簇分析方法不能说明不同参数对磷效率的贡献，在磷效率评价中，其结果可能不准确。在此基础上，有人提出了一个折中方案，即主要部分分析方法，通过综合计算主要部分在低磷条件（-P）及低磷（-P）和高磷（+P）相对值参数的百分比的标准值得到的，保留超过1的特征值。种植介质无论是土壤还是水培，整个筛选过程工序多、耗费时间长、易受环境条件影响，且在水培条件下成熟难，易破坏原材料。尽管统计学方法上有所改善，但由于缺乏有效的特异性评价指标，造成成本高、效率低下，准确性欠佳。

根系性状是评价大豆磷效率的关键指标。有研究结果表明，植物摄取磷的能力具有很大的基因型差异，不同的植物高效吸收磷的机制有所不同，但主要涉及的器官是根。根是大部分作物从土壤中吸收养分的唯一途径。根系的发育状况与作物营养吸收密切相关。根系性状受遗传因子的控制，还与根际环境条件如磷养分状况有关。换言之，作物通过根系从介质土壤中获取养分，养分促进了作物地上部和地下部的生长发育，进而影响到作物干物质的积累和产量的形成。根吸收磷元素是靠根系接土壤的方式为主要来源。植物对土壤中磷的吸收主要依靠根系吸收周围接触到的有效磷，长期生长在低磷胁迫环境条件下，高等植物会形成一些对土壤磷吸收的适应机制，包括根形态特征的演变（如根毛形成）、诱导酸性磷酸酶、特异根系分泌物的形成和分泌、根构型的形成等，从而影响磷效率。已有很多的研究证明，根系性状与大豆磷养分高效吸收密切相关。在低磷条件下，磷高效大豆能够增加根部到根上部干重比例、增加根长、增多侧根、增加根毛数量、改变根构型。在磷缺乏条件下，磷高效基因型更容易累积生物量，增长根长，增加磷吸收和根上部磷利用率。本专利申请人团队提出应用磷效率相关的根系性状进行大豆磷高效基因型筛选（尹元萍等，利用根系形态构型筛选磷高效大豆基因型，分子植物育种，2015，5（13）:999-1008），应用根生物量、根磷含量、根构型等根系性状指标具有较好的筛选效果，但根系挖掘和分析的工作量较大，大豆根系挖掘也会导致植株的损害。

应用磷效率相关根系性状分子标记能够高效和无损地进行大豆磷效率的评价。关于不同磷营养条件下植物根系性状QTL定位分析的报道最早见于20世纪90年代初。简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）是广泛存在于真核基因组中的一类DNA碱基序列，它们均由1-6个碱基组成的基本序列串联单元，不同等位基因间的重复数存在丰富的差异。SSR已成为应用最广、最重要的分子标记。大豆基因组的大小约在1129×10⁶~1181×l0⁶ bp之间，其中40%-60%的是重复序列，25%是中度重复序列，20%是少数重复序列。对大豆的物理作图和分子连锁图谱的比较表明，大豆中每个cM大致相当于550 kb的基因组，因此大豆基因组遗传距离全长约3500cM。由于SSR标记是在基因组中仅存在一个拷贝的共显性标记，因此在图谱构建上，SSR标记一般作为图谱的锚定标记，有利于图谱连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合。梁泉等（Liang et al., QTL analysis of root traits as relatedto phosphorus efficiency in soybean，Annals of Botany，2010，106: 223-234）的研究结果，发现B1、C1、D1a、D2等连锁群上有7个位点与大豆磷效率相关。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种适于大豆磷效率筛选的SSR引物序列和大豆磷高效基因型评价方法，可以用于高效、准确地筛选磷高效大豆品种。其技术方案为：

一种适于大豆磷效率筛选的SSR引物序列，其特征在于，该SSR引物序列包括21对SSR引物序列，该21个特异SSR标记是，Sat_128、Sat_149、Satt519、Satt298、Sat_348、BARCSOYSSR_11_0588、BARCSOYSSR_11_0574、BARCSOYSSR_11_0688、Sat_296、Sct_192、Satt458、Satt135、Sat_277、BARCSOYSSR_17_0291、BARCSOYSSR_17_0360、Sat_343、Satt507、Sct_010、Satt076、Sat404、Satt042。

一种大豆磷高效基因型评价方法，其特征在于包括如下步骤：（1）设置对照组，以BX10（巴西10号）、3个F10代重组自系RIL71、RIL97、RIL130为磷高效品种，BD2（本地2号）、4个野生大豆YN01、YN02、YN03、YN04，3个F10代重组自交系RIL32、RIL144、RIL171磷低效品种；

（2）从大豆叶片中分离提取DNA；

（3）以DNA为模板，用上述特异SSR分子标记为引物，通过聚合酶链式反应扩增出特异片段；

（4）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，扩增条带进行0、1矩阵统计，构建SSR标记数据矩阵；

（5）根据扩增条带计算遗传相似系数和遗传聚类分析，即可判断磷高效大豆品种。

下表为用于大豆磷高效筛选的21对SSR引物序列。

用于大豆磷效率筛选的21对SSR（simple sequence repeat，简单序列重复）引物序列

根据背景技术所介绍，发明人在B1、C1、D1a、D2和F连锁群上发现有7个与大豆根系性状、磷效率、生物量、产量等性状紧密连锁的位点。因此，发明人在上述7个位点左右两侧区段增加标记，共选择了100对SSR 引物，并对来自国内广东、广西、四川、辽宁、江苏、浙江等省和国外巴西等具有代表性的94份大豆种质资源进行遗传多态性检测，最终得到21 对扩增多态性好的SSR引物（附图3），分别是Sat_128、Sat_149、Satt519、Satt298、Sat_348、B1-5、B1-11、B1-18、Sat_296、Sct_192、Satt458、Satt135、Sat_277、D2-2、D2-9、Sat_343、Satt507、Sct_010、Satt076、Sat404、Satt04。通过与水培条件的磷效率筛选结果比较，结果几乎完全一致。94个大豆种质资源中，仅出现1个样品的错误，特异性SSR标记进行大豆磷高效品种筛选的错误率仅为1.06%。

附图说明

图1 特异性SSR分子标记鉴定磷高效大豆基因型的操作流程；

图2 引物satt519扩增的1-94号大豆种质资源，其中，1-4号为野生种；5-10号为6个RIL；35号为BD2；92号为BX10；

图3 3个特异性高的SSR引物在1-94号大豆品种中的扩增结果；

图4 94个大豆品种的UPMAG聚类图。

具体实施方式

本发明的适于磷高效大豆基因型筛选的特异性SSR分子标记鉴定方法，包括：

1）设置对照组，设立已经试验证实的磷高效、磷低效品种为对照，以BX10（巴西10号）、3个F10代重组自系RIL71、RIL97、RIL130为磷高效品种，BD2（本地2号）、4个野生大豆YN01、YN02、YN03、YN04，3个F10代重组自交系RIL32、RIL144、RIL171磷低效品种。这些品种（系）磷效率特性已由相关研究证实，磷效率高端株系（RIL71、RIL97、RIL130）和磷效率低端株系（RIL32、RIL144、RIL171）（梁泉，大豆磷效率相关根系性状的QTL分析，华南农业大学博士学位论文，2007）、BD2（磷低效品种）和BX10（磷高效品种）（徐青萍等，大豆科学，2003，22:108-114）。

2）采用CTAB法或商品试剂盒提取大豆叶片总DNA。

3）选择下述SSR分子标记Sat_128、Sat_149、Satt519、Satt298、Sat_348、B1-5、B1-11、B1-18、Sat_296、Sct_192、Satt458、Satt135、Sat_277、D2-2、D2-9、Sat_343、Satt507、Sct_010、Satt076、Sat404、Satt042，并合成引物，所合成的引物根据OD值和分子量大小，将引物稀释为50µM，置于-20℃冰箱保存。

4）PCR扩增特异区段，采用20 µl的PCR反应体系，组成如下：

10×PCR Buffer（含Mg²⁺） 2.0 µl

dNTP（10 mmol/L） 0.3 µl

上、下游引物（50µmol/L）各 0.06 µl

Taq酶（5U/µl） 0.2 µl

模板DNA 1 µl （约20 ng）

补双蒸水至20 µl

混匀后，置于PCR仪上进行扩增，扩增反应程序最终选定的参数为：

根据每对引物不同的Tm值，适当调整反应程序中的退火温度，一般用52℃可得到较好的扩增结果。

5）PCR扩增产物用7.2%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，0.5×TBE缓冲液，在PCR产物中每孔加入5µL的上样指示剂，振动混匀后用微量进样器取2.0 µl样品至点样孔中，电泳槽恒流80 mA，根据产物大小，一般二甲苯菁下移至凝胶的2/3时即可停止，电泳电泳结束，取出凝胶经染色和漂洗后，进行读带并记录带型数据。

6）每对SSR引物检测1个位点，视每条多态性带为1个等位基因，其中有多态性带记为（1）和无的记为（0），根据扩增条带构建SSR标记数据矩阵。

7）利用NTsys 2.10e软件计算遗传相似系数和构建UPGMA遗传聚类图。

8）根据聚类结果，参考对照组的结果，即可判断磷高效或磷低效的大豆品种。

与传统的缺磷土壤或在水培条件鉴定磷高效种质资源方法相比，本发明鉴定在实验室进行，仅需要少量大豆新鲜叶片，取材容易，药品、试剂的成本较低，所需实验仪器和设备不多，耗费时间短，21对特异性SSR分子标记多态好、分辨率高，具有很好的一致性和准确性，且对种子无损，容易进行推广。

Claims (2)

1.一种适于大豆磷效率筛选的SSR引物序列，其特征在于，该SSR引物序列包括21对SSR引物序列，该21个特异SSR标记是，Sat_128、Sat_149、Satt519、Satt298、Sat_348、BARCSOYSSR_11_0588、BARCSOYSSR_11_0574、BARCSOYSSR_11_0688、Sat_296、Sct_192、Satt458、Satt135、Sat_277、BARCSOYSSR_17_0291、BARCSOYSSR_17_0360、Sat_343、Satt507、Sct_010、Satt076、Sat404、Satt042。

2.一种大豆磷高效基因型评价方法，其特征在于包括如下步骤：（1）设置对照组，以BX10（巴西10号）、3个F10代重组自系RIL71、RIL97、RIL130为磷高效品种，BD2（本地2号）、4个野生大豆YN01、YN02、YN03、YN04，3个F10代重组自交系RIL32、RIL144、RIL171磷低效品种；

（2）从大豆叶片中分离提取DNA；

（3）以DNA为模板，用上述特异SSR分子标记为引物，通过聚合酶链式反应扩增出特异片段；

（4）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，扩增条带进行0、1矩阵统计，构建SSR标记数据矩阵；

（5）根据扩增条带计算遗传相似系数和遗传聚类分析，即可判断磷高效大豆品种。