CN107881252B - 鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用，鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，通过遗传分离群体验证，其与枯萎病基因的遗传距离更紧密，可以准确进行抗枯萎基因定位；采用几丁质酶基因扩增序列区域之间的序列差异，选择表型性状完全符合的SNP位点，获得鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，能有效弥补以往不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷，最大限度解决了遗传背景差异带来的吻合度局限。

Description

鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用
技术领域
本发明属于基因定位与分子标记开发领域，特别地，涉及一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用。
背景技术
我国西瓜(Citrullus lanatus)产量居世界第一，占世界总产的70％。西瓜产业在我国农业种植结构调整、农民增收以及提高人民生活水平等方面发挥着重要作用。可是，枯萎病严重制约西瓜产业的可持续发展，特别是近年来对西瓜高品质(高糖、产量等)的盲目追求导致市场大部分主栽西瓜品种对枯萎病丧失抗性。因此，在尖胞镰刀菌西瓜专化型1号生理小种是我国大部分地区的优势小种的大背景下，利用抗枯萎病种质资源，充分挖掘1号生理小种的西瓜抗病基因(Fon-1)、选育抗病品种对西瓜产业发展具有重要意义。
为了能快速高效利用西瓜抗枯萎病基因，科研工作者先后开展了西瓜枯萎病抗病基因的定位及分子标记开发研究。2013年张屹等利用西瓜基因组测序信息开发了与抗病基因Fon-1精密连锁的4个CAPS/dCAPS标记：459624_fon(7716_fon)、458344_fon(7419_fon)、208089_fon(4451_fon)和502124_fon；2015年李娜等基于全基因组重测序信息开发了西瓜抗枯萎病基因精密连锁的Indel标记：Indel1_fon1；上述标记中，502124_fon的连锁性最高。但是随着自然群体扩大的有效验证，发现502124_fon的验证结果与实际抗性还是存在偏差，特别是在野生材料上不能得到有效验证。
由于栽培西瓜的遗传背景比较单一，野生西瓜的抗性资源逐渐成为了育种家们所关注的重点，但上述所开发的分子标记只能针对栽培西瓜抗源的转育，导致如今的有些杂交品种和自然种质资源实际的抗性吻合度不够。
发明内容
本发明提供了一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用，以解决现有技术中抗枯萎病基因的分子标记与抗枯萎病基因的遗传距离较远，不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷的技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO∶1～3的核苷酸碱基序列，SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列中，SEQ ID NO∶1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物，引物Rsa2-FR为：
上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′，
下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，包括以下步骤：
(1)供试材料选取，其中包括抗病材料和感病材料；
(2)对步骤(1)中供试材料分别进行基因组DNA提取，得到供试材料的全基因组序列；将几丁质酶基因保守序列在供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息；
(3)对步骤(2)中在供试材料上获取的候选几丁质酶基因分别设计引物进行全长扩增并测序；
(4)对步骤(3)中获取的测序结果进行基因组序列比对，获取与供试材料表型性状完全符合的候选SNP位点，即为与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的候选SNP位点；
(5)对步骤(4)中获取的候选SNP位点分别设计dCAPS标记，在验证材料中验证候选SNP位点，获得与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的dCAPS标记，即为鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记。
进一步地，还包括在步骤(2)之前，选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌并进行几丁质酶酶活测定的步骤。
进一步地，对步骤(3)中全长扩增的产物分别进行验证，将产物中扩增出的片段与目的片段大小一致的全长扩增产物进行测序。
进一步地，步骤(4)中候选SNP位点为FW-3基因3kb区间下游500bp内第38个SNP位点。
进一步地，候选SNP位点的碱基突变为：由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”。
进一步地，步骤(5)中对抗病材料的候选SNP位点分别设计dCAPS标记包括：对抗病材料的候选SNP位点分别设计引物，对其中的栽培西瓜抗病材料，将正向引物序列3′末端倒数第3个碱基“A”修饰变为“G”，与抗病材料的突变碱基“C”组成1个Rsa I酶切位点，Rsa I酶切位点为GTAC；对其中的野生西瓜抗病材料，引物序列不需要修饰；酶切后获取的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID NO∶4、SEQ ID NO∶5、SEQ ID NO∶6的核苷酸碱基序列。
进一步地，步骤(1)中供试材料包括：父本Calhoun Gray、Sugarlee、PI296341-FR、PI482276，为典型的高抗枯萎病生理小种1西瓜材料；母本Black Diamond、Sugar Baby、W1402、PI595203，为典型的高感枯萎病生理小种1西瓜材料；
进一步地，步骤(5)中验证材料包括：以上述抗、感材料中Calhoun Gray、PI296341-FR、Black Diamond、W1402为亲本杂交获取的F1代群体；F1代群体自交获得Calhoun Gray×W1402264株F2代分离群体以及PI296341-FR×Black Diamond 113株F2代分离群体。
根据本发明的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记或上述获取方法获得的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记在西瓜抗枯萎病分子辅助育种中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，通过遗传分离群体及自然群体验证，与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈紧密连锁关系，其连锁距离为0.2cm，较502124_fon标记与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1的连锁距离2.2cm更加紧密；更为重要的是该dCAPS标记能有效弥补以往不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷，能够用于分子辅助育种，最大限度解决了遗传背景差异带来的吻合度局限，大大缩短了传统育种周期。
2、本发明的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，利用几丁质酶基因扩增序列区域之间的序列差异，选择与表型性状完全符合的SNP差异位点，获得鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，验证了几丁质酶含量的增加与植株的抗病性的关联性，筛选的西瓜枯萎病的dCAPS标记与西瓜抗枯萎病基因连锁距离更接近。利用鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，对目标性质基因进行间接选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果可靠，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。
本发明的西瓜枯萎病的dCAPS标记，除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的接种枯萎病菌后不同西瓜根系组织内几丁质酶活的变化示意图；
图2是本发明优选实施例的目标基因FW-3区间序列比对获取候选SNP位点示意图；
图3是本发明优选实施例的引物Rsa2-FR标记对分离群体的电泳图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术内容，但所述领域的技术人员应能知晓，所述实施例并不以任何方式限定本发明专利的保护范围。本领域技术人员在此基础上作出的修饰或等同替代，均应包括在本专利保护范围之内。
以下实施例中，典型的高抗枯萎病生理小种1西瓜材料Calhoun Gray和PI296341-FR、典型的高感枯萎病生理小种1西瓜材料Black Diamond均来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心惠赠；典型的感枯萎病生理小种1西瓜材料W1402来源于湖南省农业科学院。F1代及F2代分离群体均来源于湖南省农业科学城高桥基地繁种。
枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveurn)生理小种1号，来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心。
几丁质酶测定试剂盒采购于苏州科铭生物技术有限公司；PCR所需的Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；Taq I、Rsa I限制性内切酶购自NEB公司。
本发明提供了一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列，SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列中，SEQIDNO∶1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列。
上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，通过遗传分离群体及自然群体验证，与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈紧密连锁关系，其连锁距离为0.2cm，较502124_fon标记与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1的连锁距离2.2cm更加紧密；更为重要的是该dCAPS标记能有效弥补以往不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷，能够用于分子辅助育种，最大限度解决了遗传背景差异带来的吻合度局限，大大缩短了传统育种周期。
本发明还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物，引物Rsa2-FR为：
上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′，
下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。
本发明还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，包括以下步骤：
(1)供试材料选取，其中包括抗病材料和感病材料；
(2)对步骤(1)中供试材料分别进行基因组DNA提取，得到供试材料的全基因组序列；将几丁质酶基因保守序列在供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息；
(3)对步骤(2)中在供试材料上获取的候选几丁质酶基因分别设计引物进行全长扩增并测序；
(4)对步骤(3)中获取的测序结果进行基因组序列比对，获取与供试材料表型性状完全符合的候选SNP位点，即为与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的候选SNP位点；
(5)对步骤(4)中获取的候选SNP位点分别设计dCAPS标记，在验证材料中验证候选SNP位点，获得与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的dCAPS标记，即为鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记。
上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，利用几丁质酶基因扩增序列区域之间的序列差异，选择与表型性状完全符合的SNP差异位点，获得鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，验证了几丁质酶含量的增加与植株的抗病性的关联性，筛选的西瓜枯萎病的dCAPS标记与西瓜抗枯萎病基因连锁距离更接近。利用鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，对目标性质基因进行间接选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果可靠，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。
优选的，步骤(1)中供试材料包括：父本Calhoun Gray、Sugarlee、PI296341-FR、PI482276，为典型的高抗枯萎病生理小种1西瓜材料；母本Black Diamond、Sugar Baby、W1402、PI595203，为典型的高感枯萎病生理小种1西瓜材料。步骤(5)中验证材料包括：以上述抗、感材料中Calhoun Gray、PI296341-FR、Black Diamond、W1402为亲本杂交获取的F1代群体；F1代群体自交获得Calhoun Gray×W1402 264株F2代分离群体以及PI296341-FR×Black Diamond 113株F2代分离群体。
优选的，还包括在步骤(2)之前，选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌并进行几丁质酶酶活测定的步骤。
上述进行几丁质酶酶活测定所选用的西瓜材料为：Calhoun Gray、PI296341-FR为典型的高抗枯萎病生理小种1；Black Diamond为典型的高感枯萎病生理小种1；枯萎病病原菌为：尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种1号。
上述选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌的步骤：
(1)枯萎病菌的制备：在无菌条件下，从菌株保存试管中挑取约0.2cm×0.2cm菌块条件，置于马铃薯固体培养基上活化培养6～8d后，取菌块接种于马铃薯液体培养基中，28℃、200rmp/min条件下培养7d，双层纱布过滤，经血球计数板计算孢子浓度，备用。
(2)带菌土的制备：将消毒后的育苗基质补水(保证基质含水量为30％左右)，称取质量，加入枯萎病菌的孢子悬浮液，按照质量比配成浓度为4×105个/g的带菌基质，置于育苗盆中培养2天。
(3)枯萎病抗性接种鉴定：通过1.5％次氯酸钠对种子表面消毒20min后，清水洗净后继续浸种浸种1.5h，将消毒后的西瓜种子用湿毛巾包好在30℃恒温箱中催芽24～36h，待90％以上的种子出芽时播种于所述带菌土室内育苗，12d后开始参照耿丽华等的分级标准调查西瓜枯萎病苗期病情。室内育苗具体参数设置为：温度28℃16h、光照3000lx；22℃8h、光照3000lx。
上述几丁质酶酶活的测定步骤为：选取抗、感西瓜材料PI296341-FR、CalhounGray和W1402进行苗期浸根接种，其中清水为空白对照。根据发病进程分别于0d、2d、4d、6d、8d、10d取样6株根样(分2个重复，每个重复3株)，储存在事先标记好的铝箔纸袋中，液氮速冻-80℃保存。按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液)进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测，测定步骤参见表1。
表1酶活性测定试剂用量
Figure BDA0001486299000000061
酶活性定义为37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
上述几丁质酶酶活的测定的结果为：接种尖孢镰刀菌西瓜专化型后，抗病品种CalhounGray和PI296341-FR根组织中的几丁质酶含量分别在接种后4d和6d已显著高于对照；而感病品种W1402根组织中8d后开始呈现升高趋势。几丁质酶作为真菌细胞壁主要成分几丁质的水解酶，在西瓜体内的提高必然增强植株的抗病性，因此，本发明通过挖掘几丁质酶基因序列差异位点来开发西瓜抗枯萎病基因的紧密连锁dCAPS标记，上述结果参照图1所示。
上述获取dCAPS标记的步骤中，步骤(2)中基因组DNA提取方法为：采取改良后的CTAB法提取西瓜叶片基因组DNA，采集1.5g左右新鲜的嫩叶，装入1.5ml离心管中，倒入液氮速冻样品，用灭菌过的磨尖玻璃棒将叶片研磨完全，每管加入600μL 65℃预热过的CTAB缓冲液(含1％巯基乙醇)，混匀充分后于65℃水浴，1h的水浴过程中每15min摇晃混匀一次；水浴完成后置于冰上冰浴或4冰箱冷却至15左右，加入600μL氯仿：异戊醇(24：1)，用力晃动离心管，以保证有机相和水相的充分乳化，冰浴保存15min、12000rpm离心20min；取上清液400μL，加入预先装有400μL异丙醇的1.5ml离心管中，轻轻晃动混匀，-20℃条件下沉析30分钟后，12000rpm离心20min；轻轻倒掉上清液，加1ml乙醇(75％)清洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，弃掉乙醇液，超级工作台上吹干DNA沉淀，挥发尽乙醇；加入100灭菌后的ddH2O(含1μL1mg/mL的Rnase)，水浴30min去除RNA，4℃保存。
步骤(2)提取供试材料的基因组DNA得到供试材料的全基因组序列，将几丁质酶基因保守序列在供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息。
依托供试材料全基因组序列信息，利用(http://www.softberry.com)网站提供的FGENESH软件和GENSCAN网站软件进行基因结构预测与分析。通过与核苷酸结合位点–几丁质酶基因蛋白保守序列进行比对，发现包括10个具有较高同源性的基因，参见表2，并初步对此类基因进行全长扩增(上、下游1000bp)。
表2基因功能注释结果
Figure BDA0001486299000000071
优选的，对步骤(3)中全长扩增的产物分别进行验证，将产物中扩增出的片段与目的片段大小一致的全长扩增产物进行测序。其中，目的片段是指供试材料中的几丁质酶基因片段。
上述对全长扩增的产物的验证方法如下：利用EasyPure Quick Gel ExtractionKit试剂盒纯化回收上述扩增得到的长距离PCR产物，然后连接到pEASY-T1载体上，将重组质粒DNA用Trans-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell培养在LB/Amp+固体培养基过夜，之后进行蓝白斑筛选，挑取白斑并用菌液PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段相一致，若与目的片段大小一致则送样测序。其中，载体为全式金生物技术有限公司的pEASY-T1Cloning Vector，感受态细胞是Trans1-T1Phage ResistantChemicallyCompetent Cell。测序公司在北京诺赛基因组研究中心有限公司。
优选的，步骤(4)中候选SNP位点为FW-3基因3kb区间下游500bp内第38个SNP位点。更为优选的，候选SNP位点的碱基突变为：由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”。
利用DNAMAN软件对测序结果拼接并进行多重序列比对，FW-3基因3kb区间内存在45个SNP差异位点，其中下游500bp内第38在个SNP位点在抗、感材料上均吻合，该位点由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”。
优选的，步骤(5)中对抗病材料的候选SNP位点分别设计dCAPS标记包括：对抗病材料的候选SNP位点分别设计引物，对其中的栽培西瓜抗病材料，将正向引物序列3′末端倒数第3个碱基“A”修饰变为“G”，与抗病材料的突变碱基“C”组成1个Rsa I酶切位点，Rsa I酶切位点为GTAC；对其中的野生西瓜抗病材料，引物序列不需要修饰；酶切后获取的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID NO∶4、SEQ ID NO∶5、SEQ ID NO∶6的核苷酸碱基序列。其中，SEQID NO∶4为野生西瓜抗病材料与栽培西瓜抗病材料酶切后的部分核苷酸序列；SEQ ID NO∶5为野生西瓜抗病材料酶切后的部分核苷酸序列；SEQ ID NO∶6为栽培西瓜抗病材料酶切后的部分核苷酸序列。
根据SNP位点开发dCAPS标记，dCAPS标记引物如下：
上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′,
下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。
上述步骤(5)中，dCAPS标记的PCR扩增反应体系：包括2.5μL 10×Buffer(15mmol·L-1MgCl2)；2.5mmol·L-1dNTPs 2μL；5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.4μL；10μmol·μL-1上、下游混合引物2μL；30ng·μL-1模板DNA 2μL；ddH2O 16.1μL，组成25μL体系，Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
标记PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃20s，54℃20s，72℃30s，共34个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列。
通过其正向引物序列3’末端倒数第3个碱基原来为“A”，经修饰变为“G”，与栽培抗病基因的突变碱基“C”组成1个Rsa I酶切位点(GTAC)，被限制性酶Rsa I酶切成两个小片段产物，酶切位点为：GTAC。
dCAPS标记产物的酶切反应体系：包括1.5μL 10×Buffer，0.5μL限制内切酶，5μLPCR产物，8μL H2O，限制内切酶购自Fermentas公司。
dCAPS标记产物酶切程反应程序：37℃酶切12～16h，65℃变性20min，4℃保存，其中酶切温度和变性温度随限制酶变化而改变。
电泳检测：待dCAPS扩增/酶切反应完成后，取3μL上样缓冲液(6×LoadingBuffer)加入15μL扩增/酶切PCR产物中，用移液器混匀并吸取3μL垂直点入8％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳检测；140V/500mA电泳1.5h即可，银染染色。附图3为引物Rsa2-FR标记对分离群体电泳图，从图3中检测到的目标条带的大小，能够得出准确的基因型，进而与表型进行验证。其中，CG表示抗病材料Calhoun Gray，W表示感病材料W1402，F1表示Calhoun Gray×W1402F1。
栽培抗病基因的酶切后的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO∶4和SEQ ID NO∶5的核苷酸碱基序列；野生抗病基因的酶切后的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO∶4和SEQID NO∶6的核苷酸碱基序列。
本发明还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记或上述获取方法获得的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记在西瓜抗枯萎病分子辅助育种中的应用。利用鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，对目标性质基因进行间接选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果可靠，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。
分别利用栽培和野生西瓜F2分离单株对上述多态性连锁标记进行验证，统计其基因型的分离情况，其标记带型统计按照与抗病父本的纯合抗病带型相同的记为“a”，与感病母本的纯合感病带型相同的记为“b”，与其F1的杂合带型相同记为“h”，模糊不清或丢失的带型记为“u”。栽培西瓜F2群体利用Joinmap 4.0软件进行Fon-1基因的连锁遗传分析，并构建连锁图谱；野生西瓜F2群体利用QTL ICImapping 4.0进行连锁图谱构建和QTL定位。
栽培西瓜F2群体基因型验证分析：通过502124_fon和本发明的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记分别对Calhoun Gray×W1402F2 264个单株进行PCR扩增，分别利用DNA限制内切酶Taq I和Rsa I进行酶切，其中Taq I内切酶针对502124_fon这个标记实施。其结果显示：引物502124_fon的PCR扩增中，62个感病单株中有57个单株基因型鉴定结果显示为感病单株，另外5个感病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该感病单株为交换株；202个抗病单株中有1个抗病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该抗病单株为交换株；因此，264个F2群体单株中共有6个交换单株。
本发明的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物PCR扩增中，62个感病单株中有61个单株基因型鉴定结果显示为感病单株，另外1个感病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该感病单株为交换株；202个抗病单株基因型鉴定结果为抗病单株，与表型符合；因此，264个F2群体单株中共有1个交换单株。
利用Joinmap4.0软件分析上述标记与目标性状的连锁关系，结果显示，标记502124_fon与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈连锁关系，其连锁距离为2.2cm；本发明的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈紧密连锁关系，其连锁距离分别为0.2cm。
野生西瓜F2群体基因型验证分析：通过PI296341-FR×Black Diamond F2 113个单株进行验证，其中引物502124_fon未能对该群体进行有效区分。
利用DNA限制内切酶Rsa I进行酶切，QTL IciMapping 4.0软件进行QTL分析。结果显示，鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记为主效抗病QTL位点，遗传图距分别为5.2cm。该抗病基因位点可解释38.9％的表型变异率，加性效应达到了-9.8175。
PCR扩增结果进一步证实了上述标记与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1的紧密连锁关系；鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记是西瓜枯萎病生理小种1抗性基因Fon-1的特异性标记；说明上述标记在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值，可以有效地运用于西瓜分子辅助育种。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南省农业生物技术研究中心
<120> 鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 1
aaatagagga agacaaaccg tacaaaaatg ggcccaaatt aaataaattg aaaaataaga 60
ctattctatt gatttgatta tcgcaattct ccaatttata ttaatcatta cattttacac 120
aaaattgaaa cttcgaacat tttcattaac at 152
<210> 2
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 2
aaatagagga agacaaacca tacaaacatt ggcccaactt aaataaattg aaaaataaga 60
ctattctatt gatttgatta tcgcaattct ccaatttata ttaatcatta cattttacac 120
aaaattgaaa cttcgaacat tttcattaac at 152
<210> 3
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 3
aaatagagga agacaaacca tataaacatt ggcccaactt aaataaattg aaaaataaga 60
ctattctatt gatttgatta tcgcaattct ccaatttata ttaatcatta cattttacac 120
aaaattgaaa cttcgaacat tttcattaac at 152
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 4
aaatagagga agacaaaccg t 21
<210> 5
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 5
acaaaaatgg gcccaaatta aataaattga aaaataagac tattctattg atttgattat 60
cgcaattctc caatttatat taatcattac attttacaca aaattgaaac ttcgaacatt 120
ttcattaaca t 131
<210> 6
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial seqence)
<400> 6
acaaacattg gcccaactta aataaattga aaaataagac tattctattg atttgattat 60
cgcaattctc caatttatat taatcattac attttacaca aaattgaaac ttcgaacatt 120
ttcattaaca t 131

Claims (10)

1.一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，其特征在于，
所述dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列，所述SEQ ID NO∶1～3的核苷酸碱基序列中，SEQ ID NO∶1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO∶3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列；
根据SNP位点开发dCAPS标记，候选SNP位点为FW-3基因3kb区间下游500bp内第38个SNP位点，所述候选SNP位点的碱基突变为：由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”，Rsa I酶切位点为GTAC。
2.一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物，其特征在于，引物Rsa2-FR为：
上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′，
下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。
3.一种权利要求1所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试材料选取，其中包括抗病材料和感病材料；
(2)对所述步骤(1)中供试材料分别进行基因组DNA提取，得到所述供试材料的全基因组序列；将几丁质酶基因保守序列在所述供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取所述供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息；
(3)对所述步骤(2)中在所述供试材料上获取的候选几丁质酶基因分别设计引物进行全长扩增并测序；
(4)对所述步骤(3)中获取的测序结果进行基因组序列比对，获取与所述供试材料表型性状完全符合的候选SNP位点，即为与所述供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的候选SNP位点；
(5)对所述步骤(4)中获取的候选SNP位点分别设计dCAPS标记，在验证材料中验证所述候选SNP位点，获得与所述供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的dCAPS标记，即为所述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记。
4.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
还包括在所述步骤(2)之前，选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌并进行几丁质酶酶活测定的步骤。
5.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
对所述步骤(3)中全长扩增的产物分别进行验证，将所述产物中扩增出的片段与目的片段大小一致的全长扩增产物进行测序。
6.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
所述步骤(4)中候选SNP位点为FW-3基因3kb区间下游500bp内第38个SNP位点。
7.根据权利要求6所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
所述候选SNP位点的碱基突变为：由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”。
8.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
所述步骤(5)中对所述抗病材料的候选SNP位点分别设计dCAPS标记包括：对所述抗病材料上的所述候选SNP位点分别设计引物，对其中的栽培西瓜抗病材料，将正向引物序列3′末端倒数第3个碱基“A”修饰变为“G”，与所述抗病材料的突变碱基“C”组成1个Rsa I酶切位点，所述Rsa I酶切位点为GTAC；对其中的野生西瓜抗病材料，引物序列不需要修饰；酶切后获取的核苷酸序列分别为序列表中的SEQ ID NO∶4、SEQ ID NO∶5、SEQ ID NO∶6的核苷酸碱基序列。
9.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，
所述步骤(1)中供试材料包括：
父本Calhoun Gray、Sugarlee、PI296341-FR、PI482276，为典型的高抗枯萎病生理小种1西瓜材料；
母本Black Diamond、Sugar Baby、W1402、PI595203，为典型的高感枯萎病生理小种1西瓜材料；
所述步骤(5)中验证材料包括：
以上述抗、感材料中Calhoun Gray、PI296341-FR、Black Diamond、W1402为亲本杂交获取的F1代群体；
所述F1代群体自交获得Calhoun Gray×W1402 264株F2代分离群体以及PI296341-FR×Black Diamond 113株F2代分离群体。
10.权利要求3至9中任一项所述的获取方法获得的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记在西瓜抗枯萎病分子辅助育种中的应用。
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