CN103146691B - 西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记 - Google Patents
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- CN103146691B CN103146691B CN201310052303.3A CN201310052303A CN103146691B CN 103146691 B CN103146691 B CN 103146691B CN 201310052303 A CN201310052303 A CN 201310052303A CN 103146691 B CN103146691 B CN 103146691B
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Abstract
本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记及其获得方法。所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记，具有序列表中的SEQ ID NO:1~8的核苷酸碱基序列。该获取方法包括如下步骤：A、供试材料选取，B、所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1的初步定位，C、候选SNP的获取，D、获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的SNP位点，并对所述的候选SNP位点进行验证。本发明利用系列标记对F2代分离群体及自然群体表型鉴定及分子检测，确认所述系列SNP位点与目的性状的紧密连锁程度；利用上述SNP位点分别设计标记，可以利用上述标记对品种进行初期筛选，达到分子辅助育种的目的，大大缩短育种周期，具有重要的科研意义。
Description
技术领域
本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记及其获得方法。
背景技术
西瓜属葫芦科黄瓜属（Citrullus lanatus），是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国西瓜已有千年的种植历史和很高的经济价值，是当今增加农民收入的重要经济作物之一，已成为我国具有国际竞争力和较大经济增长空间的重要园艺作物。据联合国粮农组织统计，我国西瓜年产量占世界的67%，也是全球西瓜人均消费量最大的国家。
西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.niveurn)寄生引起的一种世界性真菌土传病害，是世界范围内西瓜生产中导致西瓜产量和品质降低的最严重障碍，引起了世界各国的广泛重视。目前，已有文献报道的尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种有4个，0、1、2和3，生理小种3能引起兼抗生理小种0、1和2的野生种质PI296431-FR感病，但在我国尚未有报道，且尚需进一步证实。生理小种1是我国致病力最强、存在范围最广的重要生理小种，尽管国内外国西瓜育种工作者选育了一批抗生理小种1的抗病品种，但传统抗病育种选育效率低问题尚未解决。迄今为止没有一种化学农药可以有效控制枯萎病的发生，生产上主要靠采用的嫁接栽培措施能有效防治。但容易降低西瓜品质，选育抗枯萎病品种是有效控制西瓜枯萎病最安全、经济的途径。因此，开发西瓜抗枯萎病基因连锁标记，将有利于高效改良西瓜的枯萎病抗性，为西瓜抗病分子育种提供技术支撑。
传统育种方式费时费力，需要非常大的群体对枯萎病菌的抗性进行严格筛选。利用与抗病性状紧密连锁的分子标记进行品种初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期。序列比对是基于DNA测序基础上，对已知的基因组序列进行比较，可迅速获得目的性状特有的候选SNP位点。并将结合遗传分离群体分析及自然群体分析，可迅速找到与目的性状紧密连锁的标记用于辅助育种，大大缩短了传统基因定位的时间。
就现有技术而言，获取西瓜枯萎病生理小种1抗性基因紧密连锁SNP位点及标记需要克服的主要缺陷是西瓜枯萎病苗期表型鉴定，西瓜苗期枯萎病表型很难确定，很大程度上受环境以及其它病虫害的影响，表型鉴定结果准确度直接影响着Fon-1基因的定位以及与其紧密连锁分子标记的获取；另外迅速找到与目的性状紧密连锁的标记需要以西瓜基因组信息为依托，需要对枯萎病确定的抗、感性状重测序进行序列比对才能更快速地获得与表型符合的候选SNP位点，最终开发与西瓜枯萎病生理小种1抗性基因Fon-1的紧密连锁标记。
发明内容
本发明的目的是提供西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记及其获得方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记，具有序列表中的SEQ ID NO:1~8的核苷酸碱基序列。
序列表中SEQ ID NO:1为引物208089_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:2为引物208089_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:3为引物458344_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:4为引物458344_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:5为引物459624_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:6为引物459624_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:7为引物502124_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:8为引物502124_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，该获取方法包括如下步骤：
A、供试材料选取：选取供试材料；
B、所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1的初步定位：
对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料；利用集团混合分析法，提取其基因组DNA，构建抗、感DNA池，
对西瓜高密度遗传图谱中的SSR/Indel标记以及根据父母本基因组重测序信息中的差异位点自行设计dCAPS标记进行筛选，获取与目标性状连锁的标记；再对所述的与目标性状连锁标记进行遗传连锁分析，并结合西瓜高密度遗传图谱信息，初步定位目标基因Fon-1区间；
C、候选SNP的获取：利用西瓜全基因重测序结果，对西瓜重测序材料在初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点；
D、获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的SNP位点，并对所述的候选SNP位点进行验证：针对所述的候选SNP位点分别设计CAPS/dCAPS标记，在验证材料中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的系列标记。
本发明的有益效果为：
本发明采用BSA法，筛选与目标性状连锁的标记；结合西瓜高密度遗传图谱信息，将西瓜枯萎病生理小种1抗性基因Fon-1进行初步定位；利用西瓜全基因重测序信息，对初步定位基因区间进行基因组序列比对，获取与11份西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点；并将结合遗传分离群体验证分析及自然群体验证分析，迅速获取与目的性状紧密连锁的标记，可应用于枯萎病分子辅助育种，为西瓜抗病分子育种提供技术支撑，同时大大缩短了传统基因定位的时间。
本发明利用系列标记对F2代分离群体及自然群体表型鉴定及分子检测，确认所述系列SNP位点与目的性状的紧密连锁程度；利用上述SNP位点分别设计标记，可以利用上述标记对品种进行初期筛选，达到分子辅助育种的目的，大大缩短育种周期，具有重要的科研意义。
附图说明
图1为实施例1中西瓜Fon-1抗性基因初步定位结果图。
图2为实施例1中初步定位基因区间序列比对获选候选SNP位点图。
图3为实施例1中引物208089_fon对F2群体的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图4为实施例1中引物458344_fon对F2群体的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图5为实施例1中引物459624_fon对F2群体的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图6为实施例1中引物502124_fon对F2群体的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图7为实施例1中引物208089_fon对西瓜种质资源的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图8为实施例1中引物458344_fon对西瓜种质资源的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图9为实施例1中引物459624_fon对西瓜种质资源的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
图10为实施例1中引物502124_fon对西瓜种质资源的扩增并利用TaqI限制性酶酶切后的结果图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例为西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记及其获得方法。
所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记，具有序列表中的SEQ ID NO:1~8的核苷酸碱基序列。
序列表中SEQ ID NO:1为引物208089_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:2为引物208089_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:3为引物458344_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:4为引物458344_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:5为引物459624_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:6为引物459624_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:7为引物502124_fon对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:8为引物502124_fon对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
该获取方法包括以下步骤：
A、供试材料选取：
所述的供试材料包括：
父本Calhoun Gray，为典型的高抗枯萎病生理小种1美洲类型西瓜材料；
母本Black Diamond，为典型的高感枯萎病生理小种1美洲类型西瓜材料；
以上述二者为亲本进行杂交获取的F1代群体；
以所述的F1代自交获得231株F2代分离群体；
164份西瓜自然资源群体，包含56份抗病材料和108份感病材料；
所述供试材料均来源于北京农林科学院蔬菜研究中心。
B、所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1的初步定位：
对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料；利用集团混合分析法（Bulked Segregating Analysis,BSA），提取其基因组DNA，构建抗、感DNA池，对西瓜高密度遗传图谱中的SSR/Indel标记以及根据父母本基因组重测序信息中的差异位点自行设计dCAPS标记进行筛选，获取与目标性状连锁的标记；再利用Joinmap4.软件对所述的与目标性状连锁标记进行遗传连锁分析，并结合西瓜高密度遗传图谱信息，初步定位目标基因Fon-1区间；
具体步骤如下：
a.将所述的供试材料进行苗期抗病接种鉴定；
（a）、将上述供试材料于2011年秋在海南培育、采种，于2012年4月在大棚中催芽直播；其中：上述父本、母本、F1代群体各取20粒种子播种，F2代分离群体取240粒种子播种，定植于北京市农林科学院蔬菜技术研究中心日光温室，其中父本、母本、F1代群体各接种定植20株，F2代分离群体接种定植231株；
（b）、枯萎病接种菌源制备：
所述的枯萎病病原菌为：尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveurn）生理小种1号，来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心；
在无菌条件下，从菌株试管中挑取一块约0.2×0.2cm大小的菌块，置于PDA培养基试管中下部的培养基表面，待菌丝基本布满培养基表面时（约5-7d），即可转入PL培养基中培养，在25-28℃、125rpm下培养悬浮培养5-8d即可使用；
利用血球计数板计数，调整孢子浓度为5×106个/ml，即稀释至血球计数板每个小格1.25个孢子（10×10显微镜下观察），得到枯萎病接种孢子液；
（c）、苗期抗病接种鉴定：父本、母本、枯萎病鉴别寄主（该枯萎病鉴别寄主共6个材料：Calhoun Gray表现抗病、Black Diamond表现感病、Charleston Gray表现中高抗病、Crimson Sweet表现中抗病、PI296341-FR表现抗病、Sugar Baby表现感病）、F1代群体，各取20粒种子，F2代分离群体取240粒种子。将上述的种子浸种、消毒后置于28℃恒温培养箱中催芽18小时，随后播种于装有灭菌营养土穴盘中；待子叶展平后，将苗取出，洗净根部，在所述的枯萎病接种孢子液中浸泡15min；浸根完成后，定植到营养钵的基质中，将蛭石覆盖营养钵表面，并利用清水稍微冲洗叶面。感病的寄主在将在接种后约5-10d发病。记录寄主的生长和发病状况，接种后10-20d，调查上述父本、母本、F1代群体、F2代分离群体的抗病接种病情等级，得到抗、感池材料；
苗期抗病接种鉴定的分级标准，共分以下6个等级；0级：无症状；1级：晴天中午子叶萎蔫或部分子叶、真叶轻微萎蔫，夜间能恢复；2级：1片真叶萎蔫或子叶较重萎蔫；3级：子叶及60%以上真叶萎蔫，阻碍发育；4级：整株萎蔫，心叶成活；5级：整株严重萎蔫并枯死。其中，2级以下为抗病，3级以上为感病类型。感病寄主在接种后约5-10d发病，待寄主的发病后，调查并记录病情等级；
b.利用集团混合分析法（Bulked Segregating Analysis,BSA）提取所述的抗、感池材料的基因组DNA，构建所述抗、感DNA池；对西瓜高密度遗传图谱中的SSR/Indel标记以及根据父母本基因组重测序信息中的差异位点自行设计dCAPS标记进行筛选，获取与目标性状连锁的标记；
具体操作如下：
（a）、所述的抗、感池材料的基因组DNA提取：
所述的DNA提取参照Murry等（1980）的方法（Murray M, Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.）的基础上改进而成；具体步骤如下：
ⅰ.取所述的抗、感池材料的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml2%CTAB提取液（2%CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTApH8.0，1%PVP-40，0.2%β-巯基乙醇），混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；
ⅱ.将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀，冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提两次，得到上清液A；
ⅲ.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液（76%乙醇，10mM乙酸铵）洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4）溶解，得到溶液A；
ⅳ.向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提一次，得到上清液B；
ⅴ.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；
ⅵ.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA，得到所述的抗、感池材料基因组DNA；
再用紫外分光光度计（Shimadzu UV-1201，日本）以OD260值测定所述的供试材料基因组DNA的浓度，再用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所述的抗、感池材料基因组DNA的提取质量；
（b）、所述抗、感DNA池的构建：
所述抗、感DNA池是指在231个F2分离群体单株中，取5株抗枯萎病极端表型单株DNA混合成抗病DNA池，取5株感枯萎病极端表型单株DNA混合成感病DNA池；
（c）、筛选与枯萎病生理小种1抗性基因Fon-1连锁的标记：
所述的SSR/Indel/dCAPS标记：
所述SSR引物WMG00291如下：
上游引物序列：5’-GAAAGTTGACAAGCGATCTCAAAA-3’,
下游引物序列：5’-CCAGACCTTCAATTTTATGTCCAA-3’；
所述dCAPS引物197728_fon如下：
上游引物序列：5’-TTCTCAATTCTCATCTCATCCCATC-3’,
下游引物序列：5’-AAAAAAAAACTGAAACCCAAGAAAG-3’；
所述SSR/Indel/dCAPS标记选用的引物由上海生工公司北京合成部合成；
（d）、利用SSR/Indel/dCAPS标记对所述抗、感DNA池进行全基因筛选扩增/酶切反应：
反应体系（25μL）中含有：2.5μL含15mM MgCl2的10×Buffer；2.5μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2μL浓度为10mM PCR上、下游混合引物；50ng模板DNA；ddH2O补足到25μL；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃20s，51℃20s，72℃30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持。其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler；
所述dCAPS标记进行PCR扩增产物后进行酶切反应，得到酶切产物；
酶切反应体系15μL中含有：1.5μL10×Buffer，0.5μLAluI限制内切酶，5μLPCR产物,8μL H2O；AluI限制内切酶购自Fermentas公司；
所述dCAPS标记酶切位点为：AGCT；
所述的酶切反应程序为：
阶段1：37℃酶切12~16h；阶段2：65℃变性20min；阶段3：4℃保持。
扩增产物/酶切产物的检测：取扩增产物/酶切产物15μL，加入3μl6×LoadingBuffer，移液器混匀后取3μL点入8.0%的聚丙烯酰胺凝胶中，140V/500mA电泳，时间为90min即可，电泳结果如图1-b所示；
其中，8%聚丙烯酰胺胶配方为：
ddH2O：10mL；10×TBE：2mL；20%Acr-Bis：8mL；
Temed：20μL；10%APS：200μL。
缓冲液为：1×TBE电极缓冲液；电泳仪为：购自JY600电泳仪(JINGYI公司)；
银染显现扩增产物/酶切产物后，对电泳谱带进行分析。来自父本CalhounGray的纯合带型记为“a”，来自母本Black Diamond的纯合带型记为“b”，杂合带型记为“h”，模糊不清或者丢失的带记为“-”；
c、再利用Joinmap4.软件对所述的与目标性状连锁标记进行遗传连锁分析，并结合西瓜高密度遗传图谱信息，初步定位目标基因Fon-1区间；
C、候选SNP的获取：
利用西瓜基因组重测序结果，对11份西瓜重测序材料在初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与其表型性状完全符合的候选SNP位点；
上述西瓜全基因测序结果来源于西瓜基因组信息网站，网站为http://www.iwgi.org；
上述11份西瓜全基因组重测序材料是对枯萎病感、抗的生理小种1的表型确定的西瓜材料，包括7份感病材料97103、RZ-900、RZ-901、XHBFGM、JLF、JLM、Black Diamond，4份抗病材料sy-904304、Sugarlee、JX-2、Calhoun Gray；如下表：
| 材料名称 | 枯萎病表型性状 |
| 97103 | 感病 |
| RZ-900 | 感病 |
| RZ-901 | 感病 |
| Sugarlee | 抗病 |
| JX-2 | 抗病 |
| JLM | 感病 |
| JXF | 感病 |
| XHBFGM | 感病 |
| Calhoum Gray | 抗病 |
| Black Diamond | 感病 |
| sy-904304 | 抗病 |
以上西瓜全基因组重测序材料为北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜种质资源库保存的种质资源材料。
D、获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的SNP位点，并对所述的候选SNP位点进行验证：针对所述的候选SNP位点分别设计CAPS/dCAPS标记，在验证材料中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的系列标记。
所述的验证材料包括：11份西瓜全基因组重测序材料、自然资源群体、上述231个F2分离群体；
所述的自然资源群体为：
自然群体为164份优良西瓜种质资源，其中56份抗病种质资源，108份感病种质资源。部分种植资源材料为：京欣1号、京欣2号、京欣3号、黑籽京欣4号、京欣5号、京欣6号、京欣7号、国凤-1、国凤-2、改良早佳；以上自然资源群体材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜种质资源库保存的种质资源材料。
步骤如下：
a.以所述的验证材料基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
所述的验证材料基因组DNA的提取方法参见步骤B；
所述CAPS/dCAPS标记选用的引物由上海生工公司北京合成部合成；
dCAPS引物208089_fon如下：
上游引物序列：5’-AAATGGGTACTGGTGGTCGCTC-3’,
下游引物序列：5’-TTCCTCTTCTTCTGTTTCTCCACAA-3’；
CAPS引物458344_fon如下：
上游引物序列：5’-TTAAGTTTCTAACCTTTAAAATTGATCTCT-3’,
下游引物序列：5’-CCTACCTTGAAAAACTTGAGGGATA-3’；
CAPS引物459624_fon如下：
上游引物序列：5’-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3’,
下游引物序列：5’-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3’；
dCAPS引物502124_fon如下：
上游引物序列：5’-AACACCACCCACTTTGGAGCTTCG-3’,
下游引物序列：5’-TTTTAGGGTGAAAATGGGTATTGTA-3’；
所述CAPS/dCAPS引物进行PCR扩增反应体系（25μL）中含有：2.5μL含15mM MgCl2的10×Trans Start Buffer；2.5μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U TransStart Taq DNAPolymerase；2μL浓度为10mM PCR上、下游混合引物；50ng模板DNA；ddH2O补足到25μL；Trans Start Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，dNTPs购自TaKaRa公司；
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持；其中系列标记Tm值：208089_fon:57℃、458344_fon:55℃、459624_fon:55℃、502124_fon:54℃；其中PCR仪为Applied Biosystems公司的Veriti96well ThermalCycler；
b.将该PCR扩增产物进行酶切反应，得到酶切产物；
所述酶切反应的反应体系15μL中含有：1.5μL10×Buffer TaqI，0.5μL TaqI限制内切酶，5μL PCR产物,8μL H2O；TaqI限制内切酶购自Fermentas公司；
所述酶切反应程序为：
阶段1：65℃酶切12~16h；阶段2：80℃酶变性20min；阶段3：4℃保持；
所述系列标记酶切位点为：TCGA；
该酶切产物的电泳图为图3-图10所示。
本实施例中的验证结果与分析如下：
1、西瓜抗枯萎病基因Fon-1遗传规律分析
步骤B-a中，对抗病亲本Calhoun Gray（父本）、感病亲本Black Diamond（母本）、F1群体的单株、231个F2分离群体单株进行苗期抗病接种鉴定，按照西瓜枯萎病病情分级标准调查每个单株的发病级数。结果表明，Calhoun Gray、Black Diamond和F1的抗、感表型性状分别为抗病、感病和抗病，说明西瓜Calhoun Gray对枯萎病生理小种1的抗性是由显性基因控制。而Black Diamond×Calhoun Gray F2群体的抗病鉴定结果表明231个单株中有162个抗病单株和69个感病单株，卡平方检验χ2=2.67<α2 0.05,1=3.84，分离比符合3：1的理论比例。综合双亲、F1和231个F2分离群体单株的苗期抗病鉴定结果，西瓜Calhoun Gray对西瓜抗枯萎病基因Fon-1控制。
2、西瓜抗枯萎病基因Fon-1的初步定位分析
步骤B-b中，根据Black Diamond×Calhoun Gray F2群体苗期抗病鉴定结果，各取5份抗、感极端表型单株DNA混合构建抗、感基因DNA池。采用集团混合分析法（Bulked Segregating Analysis,BSA）对950个SSR/Indel/dCAPS标记进行多态性筛选，获得与目的性状连锁的标记。950对引物序列来自于国家蔬菜工程技术研究中心高密度遗传图谱所设计的标记（A high resolution genetic mapanchoring scaffolds of the sequenced watermelon genome.2012）及根据父母本基因组重测序信息中的差异位点自行设计。
分析结果显示，SSR标记WMG00291和dCAPS标记197728_fon的扩增/酶切反应条带与目的性状连锁，如图1-b所示，图1-b为WMG00291和197728_fon对抗感亲本、F1、F2抗感池的PCR扩增/酶切结果。（图1-b中，M泳道：DNA marker；CG泳道：Calhoun Gray；BD泳道：Black Diamond；F1泳道.F1；R_mix泳道：抗病基因池；S_mix泳道：感病基因池）
步骤B-c中，利用软件joinmap4.0对上述与目标性状连锁的标记进行遗传连锁分析，WMG00291和197728_fon2个标记位于抗病基因的两侧，连锁距离分别为3.0cM和12.0cM。结合西瓜高密度遗传图谱信息，如图1-b所示，图1-a为西瓜1号染色体遗传连锁图，将枯萎病Fon-1基因定位与1号染色体上15cM区间内，如图1所示，图1为西瓜Fon-1抗性基因初定位图。（图1中，1-a：西瓜高密度遗传图谱；1-b：197728_fon和WMG00291对双亲、F1、感抗DNA池的PCR扩增/酶切）
3、与目标性状连锁的SNP位点比对分析
步骤C中，利用西瓜全基因重测序信息，对初步定位的1号染色体15cM基因区间进行基因组序列比对，获取与11份材料表型完全相符的4个SNP位点，208089位点碱基突变为C→G、458344位点碱基突变为G→A、459624位点碱基突变为C→T、502124位点碱基突变为A→G，如图2所示，图2为初步定位基因区间序列比对获选候选SNP位点。利用在线设计网站对上述SNP位点分别设计CAPS/dCAPS标记，引物在线设计网站为http://frodo.wi.mit.edu/primer3/;http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html。
4、自然群体材料及F2群体基因型验证分析
步骤D中，通过208089_fon、458344_fon、459624_fon、502124_fon分别对双亲、F1、231个F2分离群体单株进行PCR扩增,利用DNA限制内切酶TaqI进行酶切反应其结果显示：
引物208089_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示，如图3所示，162个抗病单株中有159个单株基因型鉴定结果显示为抗病单株，另外3个抗病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该抗病单株为交换株；69个感病单株中有66个单株基因型鉴定结果为感病单株，另外3个感病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该感病病单株为交换株；因此，231个F2群体单株中共有6个交换单株。（图3中，泳道1：Black Diamond；泳道2：Calhoun Gray；泳道3-4：F1；泳道5-25：Black Diamond×Calhoun Gray F2部分单株）
引物458344_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示，如图4所示，162个抗病单株中有160个单株基因型鉴定结果显示为抗病单株，另外2个抗病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该抗病单株为交换株；69个感病单株基因型鉴定结果为感病单株，与表型符合；因此，231个F2群体单株中共有2个交换单株。（图4中，泳道1：Black Diamond；泳道2：Calhoun Gray；泳道3-4：F1；泳道5-25：Black Diamond×Calhoun Gray F2部分单株）
引物459624_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示，如图5所示，162个抗病单株中有160个单株基因型鉴定结果显示为抗病单株，另外2个抗病株鉴定结果显示表型结果与基因型不符，表明该抗病单株为交换株；69个感病单株基因型鉴定结果为感病单株，与表型符合；因此，231个F2群体单株中共有2个交换单株。（图5中，泳道1：Black Diamond；泳道2：Calhoun Gray；泳道3-4：F1；泳道5-25：Black Diamond×Calhoun Gray F2部分单株）
引物502124_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示，如图6所示，162个抗病单株基因型鉴定结果为抗病单株；69个感病单株基因型鉴定结果为感病单株；因此，231个F2单株基因型与表型完全符合。（图6中，泳道1：BlackDiamond；泳道2：Calhoun Gray；泳道3-4：F1；泳道5-25：Black Diamond×CalhounGray F2部分单株）
利用Joinmap4.0软件分析上述标记与目标性状的连锁关系，结果显示，标记208089_fon与西瓜抗枯萎病基因Fon-1呈连锁关系，其连锁距离为2.5cM；标记459624_fon、458344_fon与西瓜抗枯萎病基因Fon-1呈紧密连锁关系，其连锁距离分别为0.9cM、1.0cM；标记502124_fon与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈现出共分离。
为进一步验证上述标记与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的连锁关系，利用164份优良西瓜种质资源材料进行验证，其中，有56个抗病品种和108个感病品种。
208089_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示（如图7所示），164份西瓜种质资源材料中，有32份材料与田间抗病表型结果不符，其符合率为80.4%。（图7中，泳道1-25：西瓜种质资源材料）
458344_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示（如图8所示），164份西瓜种质资源材料中，有5份材料与田间抗病表型结果不符，其符合率为96.9%。（图8中，泳道1-25：西瓜种质资源材料）
459624_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示（如图9所示），164份西瓜种质资源材料中，有2份材料与田间抗病表型结果不符，其符合率为98.7%。（图9中，泳道1-25：西瓜种质资源材料）
502124_fon扩增后利用TaqI限制酶酶切反应显示（如图10所示），164份西瓜种质资源材料的基因型与田间抗病表型结果符合率为100%。（图10中，泳道1-25：西瓜种质资源材料）
上述酶切反应结果进一步证实了上述标记208089_fon、458344_fon、459624_fon与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁关系；标记502124_fon是西瓜抗枯萎病基因Fon-1的特异性标记；说明上述SNP位点以及利用上述SNP位点所设计的标记在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值，可以有效地运用于西瓜分子辅助育种。
Claims (9)
1.西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，该标记的核苷酸碱基序列为以下四组：
第一组为：序列表中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，,，
第二组为：序列表中的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，
第三组为：序列表中的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6，
第四组为：序列表中的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；
该获取方法包括如下步骤：
A、供试材料选取：选取供试材料；
B、所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1的初步定位：
对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料；利用集团混合分析法，提取其基因组DNA，构建抗、感DNA池，
对西瓜高密度遗传图谱中的SSR/Indel标记以及根据父母本基因组重测序信息中的差异位点自行设计dCAPS标记进行筛选，获取与目标性状连锁的标记；再对所述的与目标性状连锁标记进行遗传连锁分析，并结合西瓜高密度遗传图谱信息，初步定位目标基因Fon-1区间；
C、候选SNP的获取：利用西瓜全基因重测序结果，对西瓜重测序材料在初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点；
D、获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的SNP位点，并对所述的候选SNP位点进行验证：针对所述的候选SNP位点分别设计CAPS/dCAPS标记，在验证材料中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜抗枯萎病基因Fon-1的紧密连锁的系列标记。
2.根据权利要求1所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤B中，用于所述的SSR/Indel/dCAPS标记的引物为：
SSR引物WMG00291为：
上游引物序列：5’-GAAAGTTGACAAGCGATCTCAAAA-3’,
下游引物序列：5’-CCAGACCTTCAATTTTATGTCCAA-3’；
dCAPS引物197728_fon为：
上游引物序列：5’-TTCTCAATTCTCATCTCATCCCATC-3’,
下游引物序列：5’-AAAAAAAAACTGAAACCCAAGAAAG-3’；
步骤B中，用于所述的SSR/Indel/dCAPS标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持。
3.根据权利要求1或2所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤B中，所述的限制内切酶为：Alu I限制内切酶；
步骤B中，所述的标记酶切位点为：AGCT；
步骤B中，所述的酶切反应程序为：
阶段1：37℃酶切12~16h；阶段2：65℃酶变性20min；阶段3：4℃保持。
4.根据权利要求1所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤D中，所述的系列候选SNP位点所在西瓜基因组上碱基位置为：西瓜基因组1号染色体碱基位置为208089、458344、459624和502124的SNP位点；
步骤D中，所述的系列候选SNP位点的碱基突变为：208089位点碱基突变为C→G、458344位点碱基突变为G→A、459624位点碱基突变为C→T、502124位点碱基突变为A→G。
5.根据权利要求1 或4所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤D中，用于所述CAPS/dCAPS标记的引物为：
dCAPS引物208089_fon为：
上游引物序列：5’-AAATGGGTACTGGTGGTCGCTC-3’,
下游引物序列：5’-TTCCTCTTCTTCTGTTTCTCCACAA-3’；
CAPS引物458344_fon为：
上游引物序列：
5’-TTAAGTTTCTAACCTTTAAAATTGATCTCT-3’,
下游引物序列：5’-CCTACCTTGAAAAACTTGAGGGATA-3’；
CAPS引物459624_fon为：
上游引物序列：
5’-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3’,
下游引物序列：5’-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3’；
dCAPS引物502124_fon为：
上游引物序列：5’-AACACCACCCACTTTGGAGCTTCG-3’,
下游引物序列：5’-TTTTAGGGTGAAAATGGGTATTGTA-3’。
6.根据权利要求1或4所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤D中，用于所述的CAPS/dCAPS标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃ 20s，Tm值 20s，72℃ 30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持；其中系列标记Tm值：208089_fon:57℃、458344_fon:55℃、459624_fon:55℃、502124_fon:54℃。
7.根据权利要求1或4所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤D中，所述的限制内切酶为：Taq I限制内切酶
步骤D中，所述的系列标记酶切位点为：TCGA；
步骤D中，所述的酶切反应程序为：
阶段1：65℃酶切12~16h；阶段2：80℃酶变性20min；阶段3：4℃保持。
8.根据权利要求1所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤B中，所述的提取基因组DNA的方法为：
ⅰ. 取叶片在液氮中研磨成粉末，再加入2% CTAB提取液，该提取液中含有2% CTAB、1.4mM NaCl、100mM Tris-HCl pH8.0、20mM EDTA pH8.0、1% PVP-40、0.2% β-巯基乙醇，混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；所述的叶片与2% CTAB提取液的重量体积比为1:5-8；
ⅱ.将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀，冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇，所述的氯仿和异戊醇的体积比为24：1，抽提两次，得到上清液A；
ⅲ.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液，所述的洗涤缓冲液中含有76% 乙醇，10mM 乙酸铵，洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液溶解，所述的TE缓冲液中含有10mM Tris-HCl、1mM EDTA、所述的TE缓冲液的pH值为7.4，得到溶液A；
ⅳ. 向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇，所述的氯仿和异戊醇的体积比为24：1抽提一次，得到上清液B；
ⅴ.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M 醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；
ⅵ. 用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干，加ddH2O溶解DNA，得到所述的基因组DNA。
9.根据权利要求1所述的西瓜抗枯萎病基因Fon-1连锁的SNP位点及标记的获取方法，其特征在于：
步骤A中，所述的供试材料包括：
父本Calhoun Gray，为典型的高抗枯萎病生理小种1美洲类型西瓜材料；
母本Black Diamond，为典型的高感枯萎病生理小种1美洲类型西瓜材料；
以上述二者为亲本进行杂交获取的F1代群体；
以所述的F1代自交获得F2代分离群体；
西瓜自然资源群体，包含抗病材料和感病材料。
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