CN102559512B - 尖镰孢番茄颈腐根腐专化型及其在培育番茄颈腐根腐病抗病品种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尖镰孢番茄颈腐根腐专化型及其在培育番茄颈腐根腐病抗病品种中的应用。本发明菌株(简称菌株Forl-c)的保藏号为CGMCC No.5517。本发明有助于我国番茄颈腐根腐病研究工作者对番茄颈腐根腐病的致病机理的解析、有助于番茄颈腐根腐病生防制剂的研发、有助于番茄颈腐根腐病抗性遗传及相关基因分子标记的研究，有助于番茄颈腐根腐病抗病基因的挖掘，有助于番茄颈腐根腐病抗病植物材料筛选和鉴定等工作，为番茄颈腐根腐病的综合防治打下了基础。本发明对于有效控制番茄颈腐根腐病的危害具有重大价值，将促进我国番茄颈腐根腐病抗病育种的发展。
Description
技术领域
本发明涉及尖镰孢番茄颈腐根腐专化型及其在培育番茄颈腐根腐病抗病品种中的应用。
背景技术
番茄颈腐根腐病最早发现于日本，之后在很多国家发生并成为影响温室番茄生产的重要病害。番茄颈腐根腐病的主要症状表现为：番茄茎基部和根部褐变腐烂，发病植株在土壤与植株茎基部交接处(环绕茎基部)有明显的深褐色病斑；早期侵染的植株，在3-5片叶的幼苗期从发病部位折倒而萎蔫死亡；晚期侵染的植株，在5叶期以后至开花结果期发病，表现为茎基部缢缩、呈深褐色、植株仍然直立而萎蔫致死，发病严重时病死率高达100％。番茄颈腐根腐病除了侵染番茄，还能侵染豆科植物、葫芦科植物和藜科植物。
我国是番茄生产和出口大国，近年来番茄设施栽培的面积逐年加大且往往连作种植。番茄颈腐根腐病是一种土传病害，能在温室区迅速蔓延，在连作栽培区造成的损失逐年加大甚至造成绝产。因此，生产上迫切需要抗番茄颈腐根腐病的优良植物品种。
我国发生番茄颈腐根腐病始于2007年，近几年来有蔓延和加重的趋势，选育抗病品种作为最有效的防治方法已经引起我国番茄育种家的高度重视。成功分离、纯化和鉴定我国番茄颈腐根腐病病原，并了解该病原菌的生长条件是进行抗病育种的必要条件，但我国关于番茄颈腐根腐病的研究尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供尖镰孢番茄颈腐根腐专化型及其在培育番茄颈腐根腐病抗病品种中的应用。
本发明提供的菌株为尖镰孢番茄颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)Forl-c，已于2011年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5517。尖镰孢番茄颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)Forl-c CGMCCNo.5517简称菌株Forl-c。
本发明还保护菌株Forl-c在如下(a)或(b)中的应用：(a)筛选抗番茄颈腐根腐病植物(种质资源)；(b)筛选具有抑制番茄颈腐根腐病作用的产品。所述植物为番茄果砧1号。
本发明还保护菌株Forl-c在培育颈腐根腐病发病植物中的应用。所述植物为番茄(如番茄自交系Q-167)、黄瓜(如黄瓜品种102)、甜菜(如甜菜品种紫叶甜菜)或菜豆。
本发明还保护一种培养菌株Forl-c的方法，是在如下条件下进行所述培养：温度为20-30℃，pH值为4-10。所述温度具体可为25℃。所述pH值可为6-9，具体可为8。
本发明还保护一种促进菌株Forl-c的分生孢子萌发的方法，是在如下条件下培养所述分生孢子：温度为15-30℃，相对湿度为90-100％。所述温度具体可为25℃。所述相对湿度具体可为100％。
本发明还保护一种培育菌株Forl-c的培养基，是将查彼克培养基中的氮源替换为等质量的其它氮源得到的培养基。所述查彼克培养基中的氮源为硝酸钠。所述其它氮源为有机氮和/或硝态氮，具体可为硝酸钾、蛋白胨和甘氨酸中的至少一种。所述查彼克培养基具体可由如下物质组成：2.00g NaNO3、1.00g K2HPO4、0.50g KCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.01g FeSO4、30.00g蔗糖、1000ml蒸馏水和17.00g琼脂。
本发明还保护一种抑制菌株Forl-c的菌丝生长的方法，是将菌株Forl-c置于63℃以上的温度下，从而抑制所述菌丝生长。所述方法具体可将菌株Forl-c在63℃以上的温度下放置10分钟以上。
本发明还保护一种杀死菌株Forl-c的分生孢子的方法，是将所述分生孢子置于61℃以上的温度下，从而杀死所述分生孢子。所述方法具体可将所述分生孢子在61℃以上的温度下放置10分钟以上。
本发明还保护一种筛选抑制颈腐根腐病的产品的方法，包括如下步骤：
(1)将菌株Forl-c接种植物，得到颈腐根腐病发病植物；
(2)用所述颈腐根腐病发病植物筛选抑制颈腐根腐病的产品。
所述植物为番茄(如番茄自交系Q-167)、黄瓜(如黄瓜品种102)、甜菜(如甜菜品种紫叶甜菜)或菜豆。
本发明提供了一株菌，为尖镰孢番茄颈腐根腐专化型。本发明提供的菌株可以引发多种植物的颈腐根腐病。本发明还对该菌株的生长最适温度、生长最适pH、生长最适氮源、菌丝致死温度、分生孢子萌发的最适温度、分生孢子萌发的最适湿度和分生孢子的致死温度等的条件进行了研究。
本发明有助于我国番茄颈腐根腐病研究工作者对番茄颈腐根腐病的致病机理的解析、有助于番茄颈腐根腐病生防制剂的研发、有助于番茄颈腐根腐病抗性遗传及相关基因分子标记的研究，有助于番茄颈腐根腐病抗病基因的挖掘，有助于番茄颈腐根腐病抗病植物材料的鉴定和筛选等工作，为番茄颈腐根腐病的综合防治打下了基础。本发明对于有效控制番茄颈腐根腐病的危害具有重大价值，将促进我国番茄颈腐根腐病抗病育种的发展。
附图说明
图1为菌株Forl-c的形态鉴定图。
图2为氮源对菌株Forl-c的菌落生长的影响。
图3为温度对菌株Forl-c的分生孢子萌发的影响。
图4为番茄果砧1号和Q-167浸根接种菌株Forl-c四周后的的照片。
图5为各种待测产品对菌株Forl-c的分生孢子萌发的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、菌株的获得和鉴定
一、菌株的获得
2008年8月于国家蔬菜工程技术研究中心农场大棚内采集典型发病植株，按常规方法用PDA平板25℃条件下进行病原分离培养，挑单孢纯化。分离到一株病原菌，将其命名为菌株Forl-c。
二、菌株的鉴定
1、形态鉴定
将菌株Forl-c接种到PDA平板上，25℃黑暗培养，观察菌落形态。在CLA培养基(2％水琼脂，20g琼脂，1L水，康乃馨叶片块)上培养，观察大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子，并在100倍倒置显微镜下直接观察小型分生孢子的产生方式。
形态鉴定图见图1，A为菌落形态，B为大型分生孢子(横线代表25um)，C为小型分生孢子(横线代表25um)，D为CLA培养基上原位的小型孢子(横线代表50um)。菌株Forl-c在PDA培养基上呈淡紫灰色，菌落圆形，菌丝绒毛状，25℃条件下在PDA上黑暗培养5d菌落直径60mm左右。大型分生孢子镰刀型，以3个隔膜为主。小型分生孢子长椭圆形，通常无隔。分生孢子梗短、生于菌丝侧面，单生，无分枝。厚垣孢子顶生或间生，圆形，多为单独生长，偶尔也对生或串生。依据《The FusariumLaboratory Manual》(Leslie，J.F.& Summerell，B.A.The Fusarium Laboratory Manual.2006)，鉴定该菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
2、rDNA-ITS鉴定
将菌株Forl-c接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在25℃、125rpm振荡培养3～4d，过滤收集菌丝体用于DNA提取。利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对菌株Forl-c的rDNA-ITS区进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最终72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对分析。
电泳检测结果显示，PCR扩增得到大小约500bp的片段，经测序分析菌株Forl-c的ITS序列片段全长503bp。BLAST比对分析表明该序列与GenBank中EU839387等尖孢镰刀菌的序列同源性达到99％，这一分析结果表明该菌株属于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。
综合形态鉴定和rDNA-ITS鉴定结果，确认菌株Forl-c为尖镰孢番茄颈腐根腐专化型。
尖镰孢番茄颈腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)Forl-c已于2011年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5517。尖镰孢番茄颈腐根腐专化型(Fusariumoxysporum f.sp.radicis-lycopersici)Forl-c CGMCC No.5517简称菌株Forl-c。
实施例2、菌株Forl-c的致病性测定
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)自交系Q-167：国家蔬菜工程技术研究中心)。
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，用蒸馏水配成浓度为107个/mL的孢子悬浮液。
2、将番茄自交系Q-167的种子用52℃温水浸种30分钟，再用清水冲洗。
3、用浸根法进行接种
将步骤2的种子催芽后播种在盛有灭菌蛭石的营养钵内，幼苗1片真叶时轻轻拔起，用水将根系冲干净，放入步骤1得到的孢子悬浮液(设置蒸馏水对照)中浸根10分钟，然后移栽入盛有灭菌蛭石和草炭(1质量份蛭石+两质量份草炭)的苗钵内。将将植株随机分为两组，分别置于18℃和27℃条件下培养。
进行浸根处理1个月后调查两组植株的发病率。采用蒸馏水浸根的植株均未发生番茄颈腐根腐病。采用孢子悬浮液浸根的植株在18℃培养条件下番茄颈腐根腐病的发病率为100％，在27℃培养条件下番茄颈腐根腐病的发病率为70％。
植株发病后从发病部位的病健交接处分离纯化病原菌观察形态，与实施例1的步骤二的1中的形态描述一致。
实施例3、菌株Forl-c的致病范围测定
供试植物如下：
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)自交系Q-167：国家蔬菜工程技术研究中心)；
黄瓜(Citrullus sativus L.)品种102：北京京研益农科技发展中心；
甜菜(Beta vulgaris L.)品种紫叶甜菜：北京京研益农科技发展中心；
菜豆(Phaseolus vulgaris L.)：北京聚宏种苗技术有限责任公司。
分别将各个供试植物进行以下实验：
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，用蒸馏水配成浓度为107个/mL的孢子悬浮液。
2、将供试植物的种子用52℃温水浸种30分钟，再用清水冲洗。
3、用浸根法进行接种
方法同实施例2的步骤3，在18℃条件下培养植株。
进行浸根处理4周后调查发病情况。
采用蒸馏水浸根的植株均未发生番茄颈腐根腐病。采用孢子悬浮液浸根的番茄、黄瓜、甜菜和菜豆番茄颈腐根腐病发病率均为100％。结果表明，菌株Forl-c不仅能使番茄致病，还能使黄瓜、菜豆和甜菜致病。
实施例4、菌株Forl-c生长条件的研究
一、温度对菌株Forl-c的菌落生长的影响
从长有菌株Forl-c的PDA平板上用5mm打孔器打取菌饼(从病原菌菌落边缘打取)，将其置于新的PDA平板(pH6.5)中央，分别在不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃)下黑暗培养，每个培养温度设置4个重复，5天后用十字交叉法测量菌落直径。
结果见表1。菌株Forl-c在5℃时几乎无生长，在10～25℃范围内，随着温度的升高生长量增加，25℃时生长量最大，之后随着温度的升高生长量下降，40℃时没有生长(表1)。菌株Forl-c生长适宜的温度范围为20～30℃，最适温度为25℃。
表1采用不同温度培养后的菌落直径
| 培养温度(℃) | 菌落直径(mm) |
| 5 | 6.0 |
| 10 | 6.5 |
| 15 | 21.6 |
| 20 | 45.5 |
| 25 | 59.5 |
| 30 | 40.3 |
| 35 | 9.9 |
| 40 | 5.0 |
二、菌株Forl-c的菌丝致死温度
从长有菌株Forl-c的PDA平板上用5mm打孔器打取菌饼(从病原菌菌落边缘打取)，每5个菌饼置于一个含10ml灭菌水的玻璃试管中，封好棉塞，置于恒温水浴锅中加热(55℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃；每个温度设置4个重复处理)，预热1min后开始计时，从计时开始10min后取出试管立即用冷水进行冷却，从每个试管中随机取出3枚菌饼放到PDA平板(pH6.5)上，25℃培养4d，观察菌饼是否长出菌丝。
菌株Forl-c在55℃、60℃、61℃和62℃处理10min后均能观察到菌丝生长，在63℃、64℃和65℃处理10min，均观察不到菌丝生长。因此，菌株Forl-c的菌丝致死温度为63℃，具体可采用63℃处理10min的条件来致死菌丝。
三、氮源对菌株Forl-c的菌落生长的影响
固体查彼克培养基由如下物质组成：2.00g NaNO3、1.00g K2HPO4、0.50g KCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.01g FeSO4、30.00g蔗糖、1000ml蒸馏水和17.00g琼脂。
以固体查彼克培养基为基础培养基，分别用等质量的其它氮源(硝酸钾、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、甘氨酸)代替固体查彼克培养基中的硝酸钠。
从长有菌株Forl-c的PDA平板上用5mm打孔器打取菌饼(从病原菌菌落边缘打取)，将其置于各个平板中央，25℃培养4d，用十字交叉法测量其菌落直径。每种氮源设置4个重复处理。
结果见图2。氮源对菌株Forl-c生长的影响差异显著，适宜的氮源是蛋白胨和硝酸钾(菌落直径分别为70.0mm和69.8mm)，其次是甘氨酸和硝酸钠(菌落直径分别为66.3mm和64.8mm)，而氯化铵和硫酸铵作为氮源不适于菌株Forl-c的生长(菌落直径分别为52.9mm和54.6mm)。
四、pH对菌株Forl-c的菌落生长的影响
从长有菌株Forl-c的PDA平板上用5mm打孔器打取菌饼(从病原菌菌落边缘打取)，将其置于各个新PDA平板(pH分别为4、5、6、7、8、9或10)中央，25℃培养4d，用十字交叉法测量其菌落直径。每个pH设置4个重复处理。
在pH4的条件下，平均菌落直径为44.0mm。在pH5的条件下，平均菌落直径为59.0mm。在pH6的条件下，平均菌落直径为60.9mm。在pH7的条件下，平均菌落直径为62.1mm。在pH8的条件下，平均菌落直径为66.0mm。在pH9的条件下，平均菌落直径为62.8mm。在pH10的条件下，平均菌落直径为59.7mm。在pH4条件下，菌株生长量最小。在pH5～8范围内，菌株生长量逐渐加大。pH8条件下，菌株生长量最大，之后生长量有所下降。因此，该菌株的最适宜pH为8。
五、温度对菌株Forl-c的分生孢子萌发的影响
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，取分生孢子，用蒸馏水配成浓度为107个/mL的分生孢子悬浮液。
2、取步骤1的分生孢子悬浮液，采用载玻片上萌发法(Fang Z D.Research Methodsfor Plant Pathology[M].Beijing：China Agriculture Press(北京：中国农业出版社)，1998.)检测分生孢子培养24小时后的萌发率(随机镜检记录100个孢子萌发情况)，分别采用5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的培养温度。
结果见图3。在5-10℃条件下分生孢子不能萌发，15℃时分生孢子萌发率开始增加，25℃时分生孢子萌发率最大，温度超过30℃后分生孢子萌发率开始下降。因此，25℃是菌株Forl-c的分生孢子萌发的适宜温度。
六、菌株Forl-c分生孢子的致死温度
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，取分生孢子，用蒸馏水配成浓度为107个/mL的分生孢子悬浮液。
2、将5ml分生孢子悬浮液加入试管中，在恒温水浴锅中加热(55℃、60℃、61℃、62℃或65℃；每个温度设置4个重复处理)，预热1min后开始计时，处理过程中随时缓缓摇匀试管以保证温度均匀，从计时开始10min后立即立即用冷水进行冷却。
3、采用载玻片上萌发法(Fang Z D.Research Methods for Plant Pathology[M].Beijing：China Agriculture Press(北京：中国农业出版社)，1998.)检测分生孢子室温培养24小时后的萌发率(随机镜检记录500个孢子萌发情况)。
55℃处理10min后，分生孢子的萌发率为55％。60℃处理10min后，分生孢子的萌发率为1％。61℃、62℃或65℃处理10min后，分生孢子的萌发率均为0％。因此，菌株Forl-c分生孢子的致死温度为61℃，具体可采用61℃处理10min的条件来致死分生孢子。
七、湿度对菌株Forl-c分生孢子萌发的影响
采用小容器空气湿度的调节法(Fang Z D.Research Methods for Plant Pathology[M].Beijing：China Agriculture Press(北京：中国农业出版社)，1998.)：在密闭容器内25℃培养菌株Forl-c的分生孢子，用不同浓度的硫酸溶液控制密闭容器内的相对湿度(75％、90％或100％；每个相对湿度设置三个重复处理)，定时镜检分生孢子萌发率。
相对湿度为100％时，培养10.5h后的分生孢子萌发率为50.2％，培养23h后分生孢子萌发率达91.4％。相对湿度为95％时，培养10.5h后分生孢子萌发率为0.1％，培养23h后分生孢子萌发率仅为17.6％。相对湿度为75％时，分生孢子几乎不能萌发。说明分生孢子萌发对湿度的要求很高，100％是最适宜分生孢子萌发的相对湿度。
实施例5、应用菌株Forl-c鉴定番茄抗病性并筛选抗颈腐根腐病的番茄种质资源
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)自交系Q-167：国家蔬菜工程技术研究中心)。
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)果砧1号：北京京研益农科技发展中心。
以自交系Q-167作为感病对照，我们首次通过人工接种对果砧1号等9份番茄育种材料进行抗病性鉴定。
分别将感病对照Q-167和果砧1号等9份番茄育种材料进行下述实验：
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，用蒸馏水配成浓度为107个/mL的孢子悬浮液。
2、将番茄种子用52℃温水浸种30分钟，再用清水冲洗。
3、用浸根法进行接种
方法同实施例2的步骤3，在18℃条件下培养植株。
进行浸根处理4周后调查发病情况。
结果是番茄果砧1号的发病率为0％，其它8份番茄育种材料发病率为80-100％，番茄自交系Q-167的发病率为90％。即番茄果砧1号对颈腐根腐病具有抗性大大高于番茄自交系Q-167，番茄果砧1号为候选抗颈腐根腐病的番茄种质资源。番茄果砧1号的照片见图4A。番茄自交系Q-167的照片见图4B。
实施例6、应用菌株Forl-c筛选具有抑制番茄颈腐根腐病作用的产品
待测产品为多菌灵(25％可湿性粉剂)和克菌丹(65％可湿性粉剂)，均为陕西美邦农药有限公司生产，使用浓度均为稀释1000倍液。
1、将菌株Forl-c在PDA平板(pH6.5)培养7天后，取分生孢子，加入蒸馏水和待测产品(设置不加入待测产品的对照)，得到分生孢子浓度为107个/mL、待测产品稀释至1000倍体积的分生孢子悬浮液。
3、采用载玻片上萌发法(Fang Z D.Research Methods for Plant Pathology[M].Beijing：China Agriculture Press(北京：中国农业出版社)，1998.)检测分生孢子室温培养10小时、15小时、24小时、36小时和40小时后的萌发率(随机镜检记录500个孢子萌发情况)。
结果见表2和图5(A为对照处理，B为多菌灵，C为克菌丹)。加入克菌丹后的孢子萌发率略低于对照处理，但差异不大，说明克菌丹对孢子萌发没有显著抑制作用。加入多菌灵后的孢子萌发率仅为0-1.23％，说明多菌灵对孢子萌发具有显著的抑制作用。在实际生产中可以将多菌灵作为抑制番茄颈腐根腐病的候选药物。
表2各种待测产品对菌株Forl-c的分生孢子萌发的影响(％)
| 时间(h) | 对照(水) | 克菌丹 | 多菌灵 |
| 10 | 41.49 | 31.11 | 0 |
| 15 | 48.62 | 35.12 | 0.38 |
| 24 | 77.28 | 71.03 | 0.75 |
| 36 | 78.65 | 74.78 | 1.06 |
| 48 | 78.92 | 77.73 | 1.23 |
Claims (9)
1.尖镰孢番茄颈腐根腐专化型（Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici)For1-c，它的保藏编号为CGMCC No.5517。
2.权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c在如下（a）或（b）中的应用：
（a）筛选抗番茄颈腐根腐病植物；
（b）筛选具有抑制番茄颈腐根腐病作用的产品。
3.权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c在培育颈腐根腐病发病植物中的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为番茄、黄瓜、甜菜或菜豆。
5.一种培养权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c的方法，是在如下条件下进行所述培养：温度为20-30℃，pH值为4-10。
6.一种促进权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c的分生孢子萌发的方法，是在如下条件下培养所述分生孢子：温度为15-30℃，相对湿度为90-100%。
7.一种抑制权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c的菌丝生长的方法，是将所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c置于63℃以上的温度下，从而抑制所述菌丝生长。
8.一种杀死权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c的分生孢子的方法，是将所述分生孢子置于61℃以上的温度下，从而杀死所述分生孢子。
9.一种筛选抑制颈腐根腐病的产品的方法，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述尖镰孢番茄颈腐根腐专化型For1-c接种植物，得到颈腐根腐病发病植物；
（2）用所述颈腐根腐病发病植物筛选抑制颈腐根腐病的产品。
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